Elettroforesi capillare

Capillary Electrophoresis (CE)

JoVE Science Education
Analytical Chemistry

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Capillary Electrophoresis (CE)

3.10: Ion-Exchange Chromatography

3.15: Cyclic Voltammetry (CV)

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08:50 min

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April 30, 2023

Overview

Fonte: Laboratorio del Dr.B. Jill Venton – Università della Virginia

L’elettroforesi capillare (CE) è una tecnica di separazione che separa le molecole in un campo elettrico in base alle dimensioni e alla carica. La CE viene eseguita in un piccolo tubo di vetro chiamato capillare che viene riempito con una soluzione elettrolitica. Gli analiti sono separati a causa delle differenze nella mobilità elettroforetica, che varia con la carica, la viscosità del solvente e le dimensioni. L’elettroforesi tradizionale nei gel è limitata nella quantità di tensione che può essere applicata perché gli effetti di riscaldamento di Joule rovineranno il gel e la separazione. I capillari hanno un ampio rapporto superficie-volume e quindi dissipano meglio il calore. Pertanto, le tensioni applicate per un esperimento di elettroforesi capillare sono piuttosto grandi, spesso 10.000-20.000 V.

L’elettroforesi capillare è utile per separazioni ad alte prestazioni. Rispetto alla cromatografia liquida, le separazioni CE sono spesso più veloci ed efficienti. Tuttavia, l’elettroforesi capillare funziona meglio per separare le molecole cariche, che non è una limitazione della cromatografia liquida. CE ha una maggiore capacità di picco rispetto alla cromatografia liquida ad alte prestazioni (HPLC), il che significa che le separazioni sono più efficienti e possono essere rilevati più picchi. La strumentazione può essere molto semplice. Tuttavia, l’HPLC è più versatile e molte fasi fisse e mobili sono state sviluppate per diversi tipi di molecole.

Principles

L’elettroforesi capillare separa le molecole a causa della loro mobilità elettroforetica. La mobilità elettroforetica di una molecola dipende dalla sua carica e da quanto è attratta o respinta dalla tensione e dalla forza di trascinamento per attrito che resiste al movimento. L’attrito è proporzionale al raggio della molecola. Pertanto, la mobilità elettroforetica si basa sulle dimensioni e sulla carica. La velocità che una molecola carica percorre lungo un capillare è il prodotto della sua mobilità elettroforetica e del campo elettrico applicato. Tensioni più elevate portano quindi a velocità più elevate e separazioni più rapide.

La maggior parte degli strumenti di elettroforesi capillare sono impostati con la tensione negativa all’estremità del rilevatore e la tensione positiva all’ingresso. Ciò significa che le molecole caricate positivamente migrano verso il catodo alla fine, mentre le molecole caricate negativamente migrano dall’altra parte. Tuttavia, tutte le molecole sono visibili al rivelatore, perché c’è un flusso di fluido di massa chiamato flusso elettroosmotico. L’ordine di migrazione è quindi molecole caricate positivamente, neutre e quindi caricate negativamente.

Il flusso elettroosmotico è causato dall’applicazione di un’alta tensione a un piccolo capillare di vetro riempito con una soluzione salina. Gli ioni caricati positivamente nella soluzione salina formano un doppio strato con i gruppi di silanoli caricati negativamente sulle pareti del vetro. Quando una tensione negativa viene applicata all’estremità del capillare, tira i cationi dal doppio strato, che tira anche la soluzione intorno ad esso a causa delle forze di attrito. Questo tipo di flusso è a forma di spina e porta a un minore allargamento della banda rispetto ai tappi di flusso a forma di parabola dell’HPLC.

Le molecole neutre scorrono tutte alla stessa velocità del flusso elettroosmotico. Tuttavia, una fase pseudo-stazionaria può essere aggiunta al buffer di esecuzione per formare micelle che le molecole possono partizionare dentro e fuori. Una tipica fase pseudo-stazionaria è il dodecilsolfato di sodio. Le micelle sono caricate negativamente all’esterno, quindi hanno una mobilità elettroforetica, quindi il tempo trascorso nella micella determina il tempo di migrazione. Questa forma di elettroforesi capillare è chiamata cromatografia elettrocinetica micellare (MEKC).

Il rilevamento in CE è simile a quello per HPLC. UV-Vis è generale e non richiede tagging finché la molecola ha un doppio legame. Tuttavia, l’assorbanza dipende dalla lunghezza del percorso, che è piccola per un capillare di 50 μm. Una cella a bolle o una cella z aumenterà la lunghezza del tracciato. La fluorescenza indotta dal laser è un metodo di rilevamento più sensibile. Un laser viene illuminato attraverso una finestra nel capillare e la fluorescenza del prodotto misurato. Mentre la fluorescenza fornisce una sensibilità molto elevata, generalmente richiede che le molecole siano etichettate perché la maggior parte non sono fluorescenti. Il rilevamento elettrochimico e il rilevamento della spettrometria di massa elettrospray stanno guadagnando popolarità. Il problema con uno di questi rivelatori è che l’alta tensione dalla separazione deve essere portata a terra prima del rilevamento, poiché l’elettrochimica e l’elettrospray richiedono l’applicazione di una tensione e la tensione CE può interferire. Nuovi metodi di disaccoppiamento della tensione CE, utilizzando elettrodi per drenare la corrente o una piccola fessura nel capillare, stanno superando queste sfide.

Procedure

1. Configurazione della strumentazione CE

Accendere lo strumento CE e il computer. Utilizzando il software del computer, accendere la sorgente luminosa per l’analisi UV per consentirne il riscaldamento. Alcuni software hanno un indicatore quando la lampada è pronta per l’uso (l’icona della lampada diventa colorata).
Creare un file di metodi. Impostare i parametri importanti per l’esecuzione del CE. In questa analisi le temperature della cartuccia e della conservazione del campione sono di 35 °C. La lunghezza d’onda per il rilevamento UV è di 214 nm.
Scrivi un programma temporale. Il programma consiste generalmente in fasi di risciacquo (per pulire il capillare prima dell’analisi), fasi di iniezione e quindi una fase di elettroforesi. Per la fase di risciacquo, eseguire 2 risciacqui per 1 minuto utilizzando 20 psi di pressione. Il primo risciacquo è con NaOH, che aiuta ad assicurarsi che i gruppi silanolici sulla parete capillare siano deprototonati. Il secondo risciacquo è con tampone di corsa (tampone borato 0,025 M qui) per assicurarsi che il capillare sia lasciato equilibrato con tampone.
Per l’iniezione, l’iniezione di pressione viene utilizzata a 0,5 psi per 5 s.
Per la fase di elettroforesi, le condizioni sono tensione di separazione: 20 kV, tempo: 5 min, polarità normale. Per ogni passaggio, indicare anche quale flaconcino è l’ingresso e quale flaconcino è l’uscita. Salvare il file dei metodi dopo aver inserito tutti i parametri.

2. Preparazione degli standard e dei campioni di soda

Produrre soluzioni stock da 500 ppm di aspartame, caffeina e acido benzoico in acqua. Fare 50 ml di ciascuno, usando un pallone volumetrico.
Produrre una soluzione standard di 150 ppm di aspartame, 150 ppm di caffeina e 100 ppm di acido benzoico in un matraccio volumetrico da 10 ml.
Produrre soluzioni standard di caffeina di 50 ppm, 100 ppm, 150 ppm e 200 ppm in un pallone volumetrico da 10 ml.

3. Eseguire gli esempi sul ce

Inserire i flaconcini contenenti campioni standard o di soda nel porta flaconcino del campione. Assicurati di annotare quale campione si trova in quale slot. Due slot hanno il buffer di esecuzione del borato e la soluzione di risciacquo NaOH da 0,1 M.
Nel file di metodo, inserire lo slot in cui si trova il primo flaconcino campione.
Acquisire una singola esecuzione, assicurandosi di inserire tutte le informazioni sui dati richieste dal programma.
Continuare ad acquisire dati, cambiando il flaconcino di ingresso per ciascun campione. Esegui lo standard di combinazione, le 3 concentrazioni di caffeina e un campione di Pepsi e Pepsi dietetica.
Inserire il target nello strumento e scegliere lo strumento appropriato.
Analizzare i dati sul computer. Calcola le aree di picco e gli standard di sovrapposizione e i campioni reali per aiutare a identificare i picchi. Crea una curva di calibrazione per i dati sulla caffeina.

L’elettroforesi capillare, o CE, è una tecnica utilizzata nell’analisi chimica per separare le molecole in un campo elettrico in base alle dimensioni e alla carica.

L’elettroforesi capillare viene eseguita in un tubo di diametro sub-millimetrico, chiamato capillare, che contiene una soluzione elettrolitica fluente. Il campione viene iniettato nel capillare e viene applicato un campo elettrico. Le molecole vengono quindi separate in base alla differenza nella loro velocità, che è influenzata dalla carica, dalle dimensioni e dalla viscosità del solvente. CE è ideale per la separazione di molecole cariche e ha una risoluzione maggiore rispetto alla cromatografia liquida ad alte prestazioni, rendendola più efficiente e sensibile.

Questo video introdurrà le basi dell’elettroforesi capillare e ne dimostrerà l’uso determinando la composizione di una bibita.

In CE, un campo elettrico viene applicato a un capillare riempito con un elettrolita. Il campo elettrico induce una carica positiva all’ingresso capillare e una carica negativa all’uscita.

L’elettrolita scorre all’interno del capillare, indotto dal campo elettrico. Questo flusso, chiamato flusso elettro-osmotico, è causato dal movimento di uno strato discreto di ioni salini caricati positivamente lungo le pareti dei capillari caricati negativamente.

Mentre la corrente elettrica attraversa il capillare, i cationi lungo il muro si muovono verso l’estremità negativa. Questo flusso iodico tira la soluzione al centro attraverso il tubo.

Le molecole campione vengono quindi separate in base alla loro velocità all’interno del capillare. Questa velocità, chiamata mobilità elettroforetica, dipende dalla carica e dalle dimensioni delle molecole e da quanto è attratta o respinta da un campo elettrico.

Le molecole caricate positivamente fluiscono più velocemente attraverso il capillare, poiché sono più attratte dal potenziale all’uscita. Le molecole caricate negativamente scorrono molto più lentamente, poiché sono più attratte dal potenziale all’ingresso. Le molecole neutre vengono trasportate insieme al flusso di massa. Pertanto, l’ordine delle molecole che escono dal capillare è caricato positivamente, neutro e quindi caricato negativamente. Inoltre, il flusso elettrolitico attira molecole più piccole più velocemente delle molecole più grandi a causa delle forze di attrito.

Le molecole vengono registrate da un rivelatore, come UV-Vis, quando escono dalla colonna e vengono visualizzate in un grafico dell’intensità del segnale del rivelatore rispetto al tempo, chiamato elettroferogramma.

Gli elettroferogrammi possono produrre una serie di informazioni; ad esempio il numero di composti diversi presenti in un campione e la quantità di ciascuna sostanza.

Ora che hai visto una breve sinossi dell’elettroforesi capillare, diamo un’occhiata a come viene eseguita in laboratorio.

Innanzitutto, accendere lo strumento di elettroforesi capillare e il computer. Quindi accendere il rilevatore UV per consentirne il riscaldamento.

Impostare i parametri per l’esecuzione dell’esperimento. Innanzitutto, impostare la temperatura per la cartuccia e la conservazione del campione a 35 °C e la lunghezza d’onda per il rilevamento UV a 214 nm.

Quindi, impostare i due passaggi di risciacquo. Il primo risciacquo è con idrossido di sodio per garantire che i gruppi silanolici sulla parete capillare siano protonati. Il secondo risciacquo utilizza il tampone in esecuzione per equilibrare il capillare. Quindi, impostare il campione per iniettare a 0,5 psi per 5 s.

Impostare la fase di elettroforesi, selezionando la tensione di separazione. In questo caso, utilizzare 20 kV per 5 minuti utilizzando la polarità normale, il che significa che il campo elettrico è positivo all’ingresso e negativo all’uscita.

In primo luogo, preparare 50 ml di soluzioni stock dei componenti di soda aspartame, caffeina e acido benzoico a 500 parti per milione in acqua.

Dalle soluzioni stock, produrre una soluzione standard di 150 ppm di aspartame, 150 ppm di caffeina e 100 ppm di acido benzoico.

Quindi, fai 4 soluzioni standard di caffeina a 50, 100, 150 e 200 ppm. Questi campioni verranno utilizzati per creare una curva di calibrazione. Per ulteriori informazioni, vedere il video di questa raccolta sulle curve di calibrazione.

Infine, preparare i campioni di soda degassandoli con azoto. I campioni di soda saranno analizzati senza diluizione.

Inserire i flaconcini contenenti campioni standard o di soda nel supporto del flaconcino. Inserire anche i flaconcini contenenti il tampone e la soluzione di risciacquo con idrossido di sodio nel portasecquista. Assicurati di registrare la posizione di ciascuno.

Nel software dello strumento CE, indicare quali slot contengono le due soluzioni di risciacquo e il primo flaconcino campione. Ora esegui il primo esempio.

Quindi, eseguire lo standard di combinazione, le 4 concentrazioni di caffeina e un campione di soda regolare e dietetico cambiando la fiala di ingresso.

Quando tutte le soluzioni sono state separate, analizzare i dati.

Innanzitutto, utilizzare gli standard per identificare i picchi nei campioni di soda. Un confronto tra i tre picchi osservati nel campione di soda dietetica con gli standard mostra che caffeina, aspartame e acido benzoico sono presenti nella soda dietetica. Nel normale campione di soda, è presente solo il picco di caffeina, ma non i picchi di aspartame e acido benzoico.

Quindi, calcolare l’area di picco per ogni soluzione standard di caffeina e fare una curva di calibrazione. La curva di calibrazione per la caffeina può essere utilizzata per calcolare la concentrazione di caffeina in ciascun campione.

L’elettroforesi capillare viene utilizzata per molte separazioni speciali in ambienti accademici e industriali.

CE è spesso usato come componente dei test di controllo qualità dell’industria farmaceutica. I farmaci, sia come piccole molecole che come biologici, possono essere eseguiti attraverso l’elettroforesi capillare per vedere se sono presenti prodotti collaterali. Può anche essere usato per determinare se le proteine sono correttamente piegate, poiché il ripiegamento può influenzare la carica proteica.

CE può anche essere usato per separare il DNA. Utilizzando una piastra microwell e più matrici di capillari, i ricercatori possono aumentare la produttività di un singolo esperimento, come mostrato qui. I frammenti di DNA sono stati separati in base alle dimensioni, con una risoluzione fino a 1 coppia di basi. Ciò rende possibile il sequenziamento di frammenti di DNA, insieme alla determinazione di altri parametri come le varianti del numero di copie, che viene utilizzato per diagnosticare potenziali malattie genetiche.

Una proteina può essere modificata da vari gruppi funzionali che sono chimicamente attaccati a posizioni diverse. Copie diverse della stessa proteina possono variare con modifiche diverse, che cambieranno la carica e le dimensioni di ciascuna proteina. L’esecuzione delle proteine purificate attraverso un CE collegato a uno spettrometro di massa può separare le proteine in base alle quali sono presenti modifiche e anche identificare il tipo e la posizione della modifica.

Hai appena visto l’introduzione di JoVE all’elettroforesi capillare. Ora dovresti capire come CE separa le molecole in base a carica e massa e come eseguire un campione sul CE in laboratorio.

Grazie per l’attenzione!

Results

Gli elettroferogrammi raccolti per i campioni di Pepsi e Pepsi dietetici sono mostrati rispettivamente nelle figure 1 e 2. I tre picchi per caffeina, aspartame e acido benzoico sono osservati nella dieta Pepsi e hanno tempi di migrazione simili a quelli standard. Per la Pepsi normale, è presente il picco di caffeina ma non i picchi di aspartame e acido benzoico. L’analisi CE è veloce in quanto i tempi di migrazione sono di soli 3-4 min.

La curva di calibrazione per la caffeina è mostrata nella Figura 3. Questa curva può essere utilizzata per calcolare la concentrazione di caffeina in ciascun campione.

Figura 1. Analisi CE di Diet Pepsi. I rossi sono standard di caffeina, aspartame e acido benzoico. Il nero è un campione di Pepsi dietetico. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figura 2. Analisi CE di Pepsi. Il nero è un campione di Pepsi mentre il rosso è un campione di standard di caffeina, aspartame e acido benzoico. Non c’è aspartame o acido benzoico, indicando che la soda non è dieta. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figura 3. Grafico di calibrazione della caffeina con CE. Un grafico dell’area di picco rispetto alla concentrazione per gli standard di caffeina misurati con CE. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Applications and Summary

L’elettroforesi capillare viene utilizzata per molte separazioni speciali. Ad esempio, viene utilizzato nell’industria farmaceutica per i test di qualità, per assicurarsi che non ci siano prodotti collaterali o interferenti. CE è particolarmente utile per separare i farmaci con un gruppo amminico di base, poiché le pareti del capillare possono essere rese neutre con un pH acido e quindi il farmaco non si attaccherà al capillare.

Una modalità di CE è stata anche utilizzata per sequenziare il genoma umano e separare il DNA. Questa modalità di CE è l’elettroforesi capillare su gel e per queste separazioni, un polimero viene iniettato nel capillare CE. Il polimero offre un’ulteriore modalità di separazione in base alle dimensioni, poiché i frammenti più piccoli possono viaggiare più velocemente attraverso il gel. Questo è chiamato setacciatura e, insieme alla separazione elettroforetica, ha una risoluzione di 1 coppia di basi per l’analisi del DNA.

Transcript

Capillary electrophoresis, or CE, is a technique used in chemical analysis to separate molecules in an electric field according to size and charge.

Capillary Electrophoresis is performed in a sub-millimeter diameter tube, called a capillary, which contains a flowing electrolyte solution. The sample is injected into the capillary, and an electric field is applied. The molecules are then separated based on the difference in their velocity, which is influenced by charge, size, and the solvent’s viscosity. CE is ideal for the separation of charged molecules and has a greater resolution than high-performance liquid chromatography, making it more efficient and sensitive.

This video will introduce the basics of capillary electrophoresis and demonstrate its use by determining the composition of a soft drink.

In CE, an electric field is applied to a capillary filled with an electrolyte. The electric field induces a positive charge at the capillary inlet, and a negative charge at the outlet.

The electrolyte flows within the capillary, induced by the electric field. This flow, called electro-osmotic flow, is caused by the movement of a discrete layer of positively-charged salt ions along the negatively-charged capillary walls.

As the electric current runs through the capillary, the cations along the wall move toward the negative end. This ion flow pulls the solution in the center through the tube.

The sample molecules are then separated based on their velocity within the capillary. This velocity, called electrophoretic mobility, depends on the molecules’ charge and size, and how much it is attracted or repelled by an electric field.

Positively-charged molecules flow faster through the capillary, as they are more attracted to the potential at the outlet. Negatively-charged molecules flow much slower, as they are more attracted to the potential at the inlet. Neutral molecules are carried along with the bulk flow. Thus, the order of molecules exiting the capillary is positively-charged, neutral, and then negatively-charged. Additionally, the electrolyte flow pulls smaller molecules faster than larger molecules due to frictional forces.

Molecules are recorded by a detector, such as UV-Vis, as they exit the column, and are visualized in a plot of detector signal intensity versus time, called an electropherogram.

Electropherograms can yield a range of information; such as how many different compounds are present in a sample and the amount of each substance.

Now that you’ve seen a brief synopsis of capillary electrophoresis, let’s take a look at how it is performed in the laboratory.

First, turn on the capillary electrophoresis instrument and computer. Then switch on the UV detector to allow it to warm up.

Set the parameters for running the experiment. First, set the temperature for the cartridge and sample storage to 35 °C and the wavelength for UV detection to 214 nm.

Next, set the two rinse steps. The first rinse is with sodium hydroxide to ensure that the silanol groups on the capillary wall are protonated. The second rinse uses running buffer to equilibrate the capillary. Then, set the sample to inject at 0.5 psi for 5 s.

Set the electrophoresis step, by selecting the separation voltage. In this case, use 20 kV for 5 min using normal polarity, meaning that the electric field is positive at the inlet and negative at the outlet.

First, prepare 50 mL stock solutions of the soda components aspartame, caffeine, and benzoic acid at 500 parts-per-million in water.

From the stock solutions, make a standard solution of 150 ppm aspartame, 150 ppm caffeine, and 100 ppm benzoic acid.

Then, make 4 standard solutions of caffeine at 50, 100, 150, and 200 ppm. These samples will be used to make a calibration curve. Fore more information, see this collection’s video on calibration curves.

Finally, prepare the soda samples by degassing them with nitrogen. The soda samples will be analyzed with no dilution.

Place the vials containing either standard or soda samples into the vial holder. Place the vials containing the run buffer and the sodium hydroxide rinse solution into the sample holder as well. Make sure to record the location of each.

In the CE instrument software, indicate which slots contain the two rinse solutions and the first sample vial. Now, run the first sample.

Then, run the combination standard, the 4 concentrations of caffeine, and a regular and diet soda sample by changing the input vial.

When all of the solutions have been separated, analyze the data.

First, use the standards to identify the peaks in the soda samples. A comparison of the three peaks observed in the diet soda sample to the standards shows that caffeine, aspartame, and benzoic acid are present in the diet soda. In the regular soda sample, only the caffeine peak is present, but not the aspartame and benzoic acid peaks.

Then, calculate the peak area for each caffeine standard solution, and make a calibration curve. The calibration curve for caffeine can be used to calculate the concentration of caffeine in each sample.

Capillary electrophoresis is used for many specialty separations in academic and industrial settings.

CE is often used as one component of pharmaceutical industry quality control testing. Drugs, either as small molecules or biologics, can be run through capillary electrophoresis to see if any side products are present. It can also be used to determine whether proteins are properly folded, as folding can affect protein charge.

CE can also be used to separate DNA. Using a microwell plate and multiple arrays of capillaries, researchers can increase the throughput of a single experiment, as shown here. DNA fragments were separated based on size, with a resolution down to 1 base pair. This makes sequencing fragments of DNA possible, along with determining other parameters like copy number variants, which is used to diagnose potential genetic diseases.

A protein can be modified by various functional groups that are chemically attached to different locations. Different copies of the same protein can vary with different modifications, which will change the charge and size of each protein. Running the purified proteins through a CE that is attached to a mass spectrometer can separate proteins based on which modifications are present, and also identify the type and location of the modification.

You’ve just watched JoVE’s introduction to capillary electrophoresis. You should now understand how CE separates molecules based on charge and mass, and how to run a sample on the CE in the lab.

Thanks for watching!

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Capillary Electrophoresis CE Chemical Analysis Separate Molecules Electric Field Size Charge Sub-millimeter Diameter Tube Capillary Flowing Electrolyte Solution Velocity Charge Size Solvent's Viscosity Resolution High-performance Liquid Chromatography Efficiency Sensitivity