Prelievo di sangue I

1. Sanguinamento retro-orbitale

1. Attrezzatura
   1. Preparare un barattolo a campana, o camera di induzione anestetica, per somministrare un gas anestetico come l'isoflurano. Quando si utilizza un barattolo a campana, è imperativo che l'anestetico liquido non entri in contatto con l'animale, per evitare l'assorbimento attraverso la pelle. È possibile utilizzare una piattaforma con piccoli fori.
   2. Sono preferiti tubi a microematocrito che contengono 50-75 microlitri. I tubi avvolti in mylar hanno meno probabilità di rompersi tra le dita dell'operatore e devono essere considerati una misura di sicurezza.
   3. Diversi spessori di asciugamani di carta, o altri materiali isolanti, sono posizionati sulla superficie di lavoro per mantenere il calore corporeo dell'animale durante la procedura.
2. Preparazione e posizionamento dell'animale
   1. L'animale viene anestetizzato con un anestetico per inalazione, come l'isoflurano, in un barattolo a campana o in una camera di induzione dell'anestesia a gas, per effetto.
   2. Una volta che l'animale è completamente anestetizzato, viene rimosso e posto in posizione laterale.
   3. L'occhio è sporgente posizionando un dito sulla parte superiore della testa e lungo la mascella, e tirando la pelle indietro e verso il basso.
   4. Evitare di applicare pressione alla trachea, in quanto ciò potrebbe collassare o occludere le vie aeree causando la morte per asfissia.
3. Astinenza di sangue
   1. Il microematocrito è posto nel canthus mediale dell'occhio e diretto caudale con un angolo di 30-45 ° dal piano del naso.
   2. Applicare pressione ruotando delicatamente il tubo dell'ematocrito. Questo taglierà le membrane congiuntivali e romperà il plesso oculare.
   3. Il sangue fluirà nel tubo dell'ematocrito per azione capillare.
   4. Evitare di spingere così in profondità da colpire l'osso nella parte posteriore della cavità oculare.
   5. Una volta che il sangue inizia a fluire, mantenere la pressione per mantenere l'occhio sporgente.
   6. Per raccogliere più tubi di sangue, non è necessario posizionare il tubo successivo nel plesso oculare, poiché il sangue continuerà a fluire e può essere raccolto poiché proviene dal canthus mediale.
   7. Per fermare il sanguinamento, rilasciare la pelle e consentire all'occhio di tornare alla posizione normale. Applicare pressione all'orbita per garantire l'emostasi.

Figura 1. Prelievo di sangue orbitale retrò nei topi.

2. Procedure di spurgo della coda: cecchino della coda e nick della coda

1. Attrezzatura
   1. Una lama sterile per bisturi, preferibilmente una lama numero 11 o una lama di rasoio monofacce, viene utilizzata per effettuare l'amputazione iniziale per il metodo del cecchino della coda. Le forbici non devono essere utilizzate perché il taglio fatto dalle forbici è schiacciante, favorendo così la coagulazione e riducendo il flusso sanguigno. Per la procedura di coda, viene utilizzata una lama di bisturi numero 11 o 15 per effettuare il taglio.
   2. Viene preparato un tubo di ritenuta che consente l'accesso alla coda del mouse.
   3. Asciugamani di carta assorbenti o garze sono usati come substrato per eseguire il cecchino della coda.
   4. Sono richiesti anche tubi di raccolta o tubi di ematocrito.
   5. La polvere stiptica dovrebbe essere disponibile per aiutare nell'emostasi.
2. Limitazione
   1. L'animale viene inserito nel tubo in modo tale che la coda sia accessibile. Per i limitatori di tipo Broome, l'animale viene tirato prima nella groppa nel tubo. Per altri tubi, l'animale viene posizionato per primo a testa in su.
   2. Gli animali sono fissati nel tubo in modo tale che non possano girarsi o ritirare la coda.
   3. Alcuni topi consentiranno il cecchino della coda e la raccolta del sangue con un contenimento manuale minimo se sono autorizzati ad afferrare una superficie ruvida.
   4. Alcuni ratti richiedono l'anestesia per inalazione per questo metodo di raccolta del sangue.
3. Astinenza di sangue
   1. La coda viene pulita con acqua tiepida per rimuovere i detriti e causare una leggera vasodilatazione. NON usare acqua calda.
   2. Per il beccaccino della coda, la coda è estesa e l'estremità della coda (0,5-1 mm per i topi e fino a 2 mm per i ratti) viene tagliata con la lama del bisturi.
   3. Per il nick della coda, la coda è estesa e un taglio viene effettuato con la lama del bisturi a circa 2/3 della distanza dalla groppa, direttamente sopra la vena laterale della coda.
   4. La coda può essere accarezzata da groppa a punta per favorire il flusso sanguigno; tuttavia, ciò ridurrà la qualità del campione.
   5. Il sangue viene raccolto dalla punta o dal nick usando tubi di ematocrito o lasciato gocciolare in una fiala di raccolta.

3. Raccolta del sangue cardiaco

1. Attrezzatura
   1. Per un mouse, è preferibile una siringa da 3 cc con un ago da 22-25 gauge x 1 ". Le siringhe più piccole non hanno la stessa rifopressione e possono rendere più difficile l'astinenza di sangue. Aghi più piccoli di 25 gauge limitano il flusso di sangue, portando ad un aumento della coagulazione e danni alle cellule del sangue. Gli aghi più corti di 1 "potrebbero non raggiungere il livello del cuore quando si avvicinano dal diaframma.
   2. Per un ratto, è preferibile una siringa da 10-12 cc con un ago da 18 gauge x 1,5 ". A seconda delle dimensioni del ratto, una siringa più piccola potrebbe non contenere l'intero volume di sangue da raccogliere, e quindi la siringa dovrebbe essere cambiata durante la procedura. Aghi più piccoli di 20 gauge limitano il flusso del sangue, portando ad un aumento della coagulazione. Gli aghi più corti di 1,5 " potrebbero non raggiungere il livello del cuore quando si avvicinano dal diaframma.
   3. Un tubo di raccolta del sangue di dimensioni sufficienti viene utilizzato per contenere il sangue raccolto.
2. Limitazione
   1. Una corretta moderazione è essenziale per il successo di questo metodo. L'animale è tenuto dalla collottola con il corpo appeso verticalmente. È importante che il corpo sia dritto per prevenire la deflessione del cuore o una torsione del torace.
   2. Una posizione alternativa è la reclinata dorsale quando si posiziona l'ago tra le costole sul lato sinistro dell'animale. Ciò è particolarmente utile per ratti molto grandi o quando più animali devono essere dissanguati.

Figura 2. Prelievo di sangue cardiaco con mouse tenuto verticalmente.

3. Astinenza di sangue
   1. L'approccio dall'aspetto posteriore, forando il diaframma è più facilmente realizzabile quando il topo o il topo è tenuto verticalmente dalla collottola.
      1. L'ago è avanzato nella tacca appena a sinistra dello xifoide dell'animale.
      2. L'ago deve essere parallelo alla colonna vertebrale e posizionato appena sotto le costole.
      3. Il cuore si trova approssimativamente a livello del gomito.
      4. Metti l'ago, smussa, nel petto e perfora il cuore.
      5. Applicare una leggera retropressione con la siringa. Se l'ago è nel cuore, il sangue scorrerà nella siringa.
      6. Attendere che il sangue abbia riempito la siringa prima di aggiungere ulteriore pressione di nuovo sulla siringa.
   2. L'approccio laterale dal lato sinistro dell'animale richiede il posizionamento dell'animale in reclinazione dorsale.
      1. Il punto di ingresso viene misurato rispetto al punto del gomito sulla parete toracica. Il cuore si trova approssimativamente a livello del gomito.
      2. L'ago viene inserito perpendicolarmente al piano del tavolo in un punto a metà strada sulla parete toracica come misurato dorsoventralmente.
      3. Metti l'ago, smussa, nel petto e perfora il cuore.
      4. Applicare una leggera retropressione con la siringa. Se l'ago è nel cuore, il sangue scorrerà nella siringa.
      5. Attendere che il sangue abbia riempito la siringa prima di aggiungere ulteriore contropressione sulla siringa.

Figura 3. Prelievo di sangue cardiaco con topo in posizione di reclina dorsale.

4. Consigli tecnici
   1. Il cuore normale è situato con l'apice che punta a sinistra. In rari casi, il cuore può essere invertito, con conseguente difficoltà a perforare il cuore.
   2. Un'eccessiva ripressione sulla siringa può far collassare il cuore, occludendo la smussatura dell'ago e interrompendo il flusso di sangue nella siringa.
   3. Applicare la ripressione e rilasciarla ripetutamente avvierà la coagulazione nella siringa.
   4. Applicare delicatamente la pressione al fegato può forzare un volume di sangue aggiuntivo nel sistema circolatorio, rendendolo disponibile per l'astinenza.

4. Astinenza di sangue della vena cava posteriore

4. Attrezzatura
   1. Una siringa TB con un ago calibro 25-29 viene utilizzata per la raccolta del sangue nel topo. Per i ratti, è necessaria una siringa da 10-12 cc con un ago da 22-25 gauge x 1".
   2. È necessaria una piattaforma chirurgica, un vassoio di dissezione o un'altra superficie per fissare l'animale, insieme a cravatte, nastro adesivo o spilli per fissare gli arti in posizione.
   3. È necessaria l'anestesia iniettabile o l'anestesia per inalazione. Se si utilizza l'anestesia per inalazione, è auspicabile che l'anestetico venga erogato tramite un vaporizzatore di precisione con un cono nasale. La durata della procedura è tale che l'utilizzo di una camera di induzione senza ulteriore somministrazione di gas anestetico non fornirà tempo sufficiente per completare il prelievo di sangue prima che l'animale si rianima.
   4. Sono necessarie forbici dell'iride per il topo o forbici affilate per la sala operatoria per il ratto, insieme a piccole pinze atraumatiche per il pollice e una spugna di garza 2 "x 2".
5. Limitazione
   1. Quando l'animale è completamente anestetizzato, come determinato dal pizzico della dita dei dita o dal pizzico della coda, l'animale viene posto in reclinata dorsale.
   2. Gli arti sono fissati alla piattaforma con nastro o spilli. Gli arti dovrebbero essere estesi lontano dal corpo.
6. Ritiro
   1. La pelle viene sollevata e un piccolo taglio trasversale viene effettuato attraverso la pelle appena sopra il bacino nelle femmine, o appena sopra il prepuzio nei maschi.
   2. La punta delle forbici viene posizionata nel taglio e un'incisione della linea mediana viene praticata attraverso la pelle dal bacino / prepuzio allo xifoide.
   3. La pelle viene riflessa lateralmente su ciascun lato. La dissezione smussata può essere necessaria per allentarlo dal muscolo sottostante.
   4. Il muscolo viene sollevato e un piccolo taglio trasversale viene effettuato attraverso il muscolo appena sopra il taglio della pelle.
   5. La punta delle forbici viene posizionata nell'addome e un'incisione della linea mediana viene effettuata attraverso il muscolo allo xifoide. Assicurati di inclinare la punta delle forbici verso l'alto per evitare di tagliare organi.
   6. Tagliare trasversalmente lungo la curva delle costole su ciascun lato. Prestare particolare attenzione a non perforare il fegato.
   7. Spostare delicatamente l'intestino alla sinistra dell'animale per esporre la vena cava posteriore.
   8. Posizionare una garza sul fegato e appoggiare l'indice e il medio sul fegato.
   9. Con l'altra mano, inserire l'ago, smussato verso l'alto, nella vena cava a metà strada tra la giunzione dei vasi renali e la biforcazione iliaca.
   10. Prelevare lentamente il sangue mentre si applica la pressione sul fegato.

Figura 4. Prelievo di sangue dalla vena cava posteriore.