Prelievo di sangue I

La raccolta del sangue è un requisito comune per diversi studi di ricerca che coinvolgono topi e ratti. La scelta del metodo per il prelievo di sangue in questi animali dipende da molti fattori come il volume di sangue necessario, la frequenza del prelievo, lo stato di salute dell'animale da dissanguare e il livello di abilità del tecnico.

Qui, esamineremo queste considerazioni e delineeremo le procedure di raccolta del sangue, tra cui il sanguinamento oculare retro-orbitale, i tagli e le tacche della coda, nonché la raccolta del sangue intracardiaco. Per altri metodi, vedere il secondo video di questa serie.

Prima di approfondire i protocolli di prelievo del sangue, esaminiamo alcune considerazioni generali tra cui il tipo di campione, la selezione dell'ago e il volume massimo di sangue che può essere raccolto. Prima di prelevare il sangue da un topo o da un ratto, è necessario determinare il tipo di campione di sangue richiesto. Le procedure sperimentali potrebbero richiedere sangue intero, plasma o siero.

Se si raccoglie sangue intero, è necessario aggiungere un anticoagulante al campione per prevenire la coagulazione. Gli anticoagulanti comunemente usati includono eparina, citrato di sodio e acido etilendiammina tetraacetico, abbreviato in EDTA. Gli anticoagulanti possono essere caricati direttamente nella siringa per rivestire le superfici. Ciò consente il contatto diretto dell'anticoagulante durante il prelievo del sangue, aiutando nella prevenzione della coagulazione. Poiché il sangue dei roditori si coagula rapidamente, è essenziale utilizzare il corretto rapporto tra anticoagulante e sangue. La raccolta del plasma richiede la centrifugazione del sangue intero con anticoagulante. Dopo la rotazione, il liquido traslucido sopra i globuli bianchi e lo strato piastrinico è il plasma. Contiene fibrinogeno e altri fattori della coagulazione. D'altra parte, il siero viene raccolto da un campione di sangue intero SENZA anticoagulanti. E poiché il campione si è coagulato, il siero, che è il giocatore migliore, non contiene fibrinogeno o altri fattori di coagulazione.

La selezione dell'ago si basa sulle dimensioni dell'animale e sul sito della venipuntura. In generale, gli aghi di grande diametro causano meno danni alle cellule del sangue e consentono una raccolta del sangue più rapida; ma hanno maggiori probabilità di causare danni alle navi. Dovrebbe essere considerata anche la lunghezza dell'ago. Se un ago è troppo lungo, potrebbe essere scomodo da usare o il sangue potrebbe iniziare a coagulare mentre è ancora all'interno dell'ago. Le scelte di dimensioni variano da 18 a 29 gauge e da 0,5 a 1,5 pollici di lunghezza. La dimensione dell'ago appropriata per ciascun metodo sarà discussa nella sezione procedure.

Infine, a causa delle piccole dimensioni dei roditori, esiste una quantità massima di sangue che può essere raccolta da un singolo prelievo di sangue, che non causerà gravi danni all'organismo. Il prelievo di sangue potrebbe avvenire senza o con sostituzione di liquidi, di solito eseguito utilizzando soluzione fisiologica allo 0,9%. Il limite massimo in ogni caso è elencato nel protocollo di testo sottostante. Inoltre, alcuni esperimenti richiedono la raccolta di più campioni e in tali casi, insieme alla sostituzione dei fluidi, gli animali avranno bisogno di tempo per ricostituire anche le cellule del sangue. Anche in questo caso, esiste un importo massimo che può essere raccolto durante la raccolta seriale e i limiti massimi sono elencati nel protocollo seguente.

Dopo aver esaminato alcune considerazioni generali, passiamo alle tecniche specifiche di prelievo del sangue, a partire dal sanguinamento retro-orbitale, una tecnica utilizzata dagli scienziati per raccogliere piccoli volumi dai vasi vicino all'occhio. Si noti che la struttura anatomica dell'area orbitale è diversa tra il topo e il ratto. I ratti hanno un plesso di vasi che scorrono dietro l'occhio, mentre il topo ha una serie di vasi che creano un seno retroorbitale, il che rende più facile eseguire questa procedura nei topi.

Inizia afferrando una provetta per la raccolta del sangue. Sono preferibili microprovette per ematocrito che contengono 50-75 microlitri. Stendere diversi tovaglioli di carta o altri materiali isolanti sul piano di lavoro. Questo serve a mantenere il calore corporeo dell'animale durante la procedura. Ora anestetizzare l'animale usando un anestetico per inalazione come l'isoflurano. Una volta che l'animale è completamente anestetizzato, rimuoverlo dalla camera e posizionarlo su un fianco che è in posizione sdraiata laterale. Quindi, posiziona un dito sulla parte superiore della testa e lungo la linea della mascella e tira la pelle indietro e verso il basso per indurre la sporgenza dell'occhio. Evitare di esercitare pressione sulla trachea in quanto ciò potrebbe causare la morte per asfissia. Successivamente, posizionare il tubo per microematocrito nel canto mediale dell'occhio e dirigerlo caudalmente con un angolo di 30-45 gradi rispetto al piano del naso. Applicare pressione ruotando delicatamente il tubo. Questo taglierà le membrane congiuntivali e romperà il plesso oculare o il seno. Il sangue fluirà nella provetta per ematocrito per azione capillare. Evita di spingere il tubo così in profondità da colpire l'osso nella parte posteriore della cavità oculare. Una volta che il sangue inizia a fluire, mantenere la pressione per mantenere l'occhio sporgente. Per fermare l'emorragia, rilasciare la pelle e lasciare che l'occhio torni alla posizione normale. Applicare pressione per promuovere l'emostasi. Per la raccolta ripetuta del campione, attendere un minimo di 10 giorni tra i sanguinamenti. Questo fornisce ai tessuti un po' di tempo per guarire.

Sebbene il sanguinamento retro-orbitale sia una procedura comune, ci sono molte preoccupazioni sulla sua umanità. Questi includono gonfiore dovuto a un movimento eccessivo del tubo ematocritico. Questo a sua volta può causare la sporgenza del bulbo oculare e impedire la chiusura della palpebra con conseguente secchezza corneale, danni e dolore, che possono innescare graffi e automutilazione. Il posizionamento improprio della provetta per ematocrito può recidere il nervo ottico con conseguente cecità. Un'altra possibile complicazione è che l'occhio può essere costretto a uscire dall'orbita, permettendo alle palpebre di cadere dietro il bulbo oculare. Inoltre, i problemi possono derivare dalla frattura delle fragili ossa dell'orbita, dalla penetrazione del globo oculare con conseguente perdita dell'umor vitreo o dalla formazione di un ematoma dietro l'occhio che può provocare dolore estremo. Nonostante tutte queste preoccupazioni, se un tecnico qualificato esegue la procedura e l'animale è completamente anestetizzato, il sanguinamento retro-orbitale è un metodo efficace di raccolta del sangue nei roditori.

Passiamo ora in rassegna le considerazioni e le procedure per il sanguinamento della coda, che consente la raccolta di campioni seriali di piccoli volumi. L'attrezzatura necessaria per questa procedura include un bisturi sterile numero 11. Le forbici non devono essere usate perché il taglio fatto dalle forbici è schiacciante, il che può favorire la coagulazione e ridurre il flusso sanguigno. Altri strumenti sono un tubo di ritenuta che permette l'accesso alla coda dell'animale; asciugamani di carta assorbente; provette di raccolta per ematocrito e polvere emostatica - per favorire l'emostasi.

Inizia fissando l'animale nel tubo di ritenuta. Quindi, pulire la coda con acqua tiepida per rimuovere i detriti e causare una leggera vasodilatazione. NON utilizzare acqua calda. Estendi la coda e con la lama del bisturi taglia l'estremità della coda per raccogliere il sangue usando l'ematocrito o le provette di raccolta. La coda può essere accarezzata o "munta" dalla groppa alla punta per favorire il flusso sanguigno. Questo, tuttavia, diminuirà la qualità del campione.

Per fermare l'emorragia, applicare pressione sulla punta della coda con una garza. La polvere emostatica può essere utilizzata per ottenere l'emostasi. Controllare gli animali ogni 5-10 minuti per assicurarsi che l'emostasi sia stata raggiunta, che potrebbe essere ritardata dopo ripetuti campionamenti. Il campione raccolto da una cesoia della coda può contenere sangue sia arterioso che venoso, insieme alla contaminazione del prodotto tissutale. Tuttavia, questa procedura per la raccolta del sangue consente raccolte in serie interrompendo la crosta o il coagulo del taglio originale all'estremità della coda.

Un metodo alternativo di raccolta del sangue a un taglio della coda è l'intaccatura del vaso della coda, che è relativamente meno invasivo. Per questo, usando la stessa lama del bisturi, fai un piccolo taglio direttamente sopra la vena laterale della coda, a circa due terzi della distanza dalla groppa. Come per le cesoie della coda, il sangue può essere raccolto in provette di raccolta o ematocrito. Ed è imperativo assicurare l'emostasi applicando pressione sul sito e ricontrollando l'animale ogni 5-10 minuti. Tuttavia, come per la cesoia della coda, i campioni possono essere contaminati da prodotti tissue.

Spesso gli studi richiedono un campione di sangue di grandi dimensioni non di sopravvivenza, che si ottiene attraverso il dissanguamento tramite un'emorragia intracardiaca o la vena cava caudale.

Per il metodo intracardiaco nei topi, è necessaria una siringa da 3 cc con un ago da 22 -25 gauge da 1 pollice. E per i ratti, è preferibile una siringa da 10-12 cc con un ago da 18 pollici di calibro 1,5. Consulta il protocollo qui sotto per capire perché queste esigenze e le siringhe sono ideali.

Inizia con l'eutanasia dell'animale usando l'anidride carbonica. Dopo l'eutanasia, tieni il roditore per la collottola con il corpo appeso verticalmente. Questa restrizione è fondamentale in quanto il corpo dovrebbe essere dritto per evitare la deflessione del cuore o una torsione del torace. Si noti che il cuore si trova approssimativamente a livello del gomito. Il lato di inserimento si trova nella tacca appena a sinistra dello xifoide, parallelo alla colonna vertebrale e sotto le costole.

Inserisci l'ago, smussalo verso l'alto, nel torace e perfora il cuore. Applicare una leggera contropressione con la siringa. Se l'ago è nel cuore, il sangue fluirà nella siringa. Attendere che il sangue abbia riempito la canna prima di aggiungere ulteriore contropressione. Circa la metà del volume totale del sangue può essere raccolto da un topo o da un ratto mediante puntura cardiaca. Ciò equivale a circa 1 ml di sangue da un topo medio e a circa 10 ml di sangue da un ratto medio

Una posizione alternativa è la decubito dorsale quando si utilizza l'approccio laterale. In questo caso, posiziona l'ago tra le costole sul lato sinistro dell'animale. Il punto di ingresso è misurato rispetto al punto del gomito sulla parete toracica. Inserire l'ago, smussare verso l'alto, perpendicolarmente al piano del tavolo in un punto a metà della parete toracica. Applicare una leggera contropressione con la siringa. Se l'ago è nel cuore, il sangue fluirà nella siringa. Ancora una volta, attendi che il sangue abbia riempito la canna prima di aggiungere ulteriore contropressione. Si noti che in entrambe le posizioni, una contropressione eccessiva può far collassare il cuore occludendo lo smusso dell'ago e interrompendo il flusso sanguigno nella siringa.

Un altro metodo per raccogliere il sangue cardiaco è attraverso la vena cava caudale. L'attrezzatura necessaria per questa procedura è una siringa appropriata con un ago della misura corretta inserito; forbici per l'apertura della cavità addominale, piccole pinze atraumatiche per il pollice e spugna di garza. Questa tecnica richiede che l'animale sia profondamente anestetizzato e mantenuto in anestesia durante tutta la procedura. La narcosi con CO2 non è un'opzione, poiché il cuore dell'animale deve battere per questa procedura. Posizionare l'animale in posizione sdraiata dorsale e fissare gli arti alla piattaforma. Gli arti dovrebbero essere estesi lontano dal corpo.

Ora solleva la pelle con una pinza e usa le forbici per fare un piccolo taglio trasversale attraverso la pelle appena sopra il bacino nelle femmine o il prepuzio nei maschi. Quindi, posiziona la punta delle forbici nel taglio e fai un'incisione sulla linea mediana attraverso la pelle dal bacino o dal prepuzio allo xifoide. Con la pelle riflessa lateralmente, sollevare il muscolo e fare un piccolo taglio trasversale attraverso il muscolo, appena sopra il taglio della pelle.

Posiziona la punta della forbice nell'addome e fai un'incisione sulla linea mediana attraverso il muscolo fino allo xifoide. Assicurati di inclinare la punta delle forbici verso l'alto per evitare di tagliare gli organi. Tagliare trasversalmente lungo la curva delle costole su ciascun lato. Fare attenzione a non perforare il fegato. Muovi delicatamente l'intestino alla sinistra dell'animale per esporre la vena cava posteriore. Metti una garza sul fegato e appoggia su di essa l'indice e il medio. Con l'altra mano, inserire l'ago, smussare nella vena cava, a metà strada tra la giunzione dei vasi renali e la biforcazione iliaca. Prelevare lentamente il sangue esercitando pressione sul fegato.

Evitare il movimento delle mani, in quanto ciò potrebbe causare la rottura del vaso. Inoltre, un prelievo di sangue troppo rapido può causare il collasso del vaso sullo smusso occludendo l'apertura e impedendo la raccolta del sangue. Il vantaggio principale di questa tecnica è la capacità di raccogliere un campione sterile perché l'ago non passa attraverso la pelle.

Infine, diamo un'occhiata ad alcune applicazioni di queste tecniche di prelievo di sangue. L'immuno-oncologia è un campo emergente e i ricercatori in questo settore spesso eseguono la raccolta del sangue per studiare le cellule immunitarie nelle diverse fasi dello sviluppo del cancro. Ad esempio, qui i ricercatori hanno raccolto sangue cardiaco da topi portatori di cancro per isolare e quantificare i neutrofili a dieci, venti e trenta giorni dopo l'attecchimento del tumore.

D'altra parte, anche la composizione del sangue è spesso studiata dai fisiologi. Come in questo studio, i ricercatori erano interessati a valutare la funzione renale negli animali diabetici. Per fare ciò, questi scienziati hanno prima iniettato un colorante in un modello animale di diabete. Successivamente, hanno quindi utilizzato il metodo del taglio della coda per raccogliere il sangue in diversi punti temporali per valutare la concentrazione di colorante nel sangue, che è stato infine utilizzato per calcolare la velocità di filtrazione glomerulare che ha evidenziato la differenza nella funzione renale dopo l'induzione del diabete.

Infine, i ricercatori sulle cellule staminali utilizzano campioni di sangue per valutare il successo dell'incorporazione delle cellule del donatore nel sistema del ricevente. Qui, i ricercatori hanno prima trapiantato cellule del midollo osseo da un topo maschio in un animale femmina di tipo selvatico e geneticamente modificato tramite l'iniezione della vena caudale. Successivamente, hanno raccolto il sangue dal seno retroorbitale del topo ricevente per studiare il DNA genomico delle cellule del sangue utilizzando la reazione a catena della polimerasi. Questo ha fornito la percentuale di attecchimento di cellule del donatore nei due tipi di animali.

Hai appena visto la prima puntata di JoVE sulle tecniche di prelievo del sangue. Si prega di guardare il prossimo video della serie per rivedere come eseguire altre tecniche comunemente impiegate di raccolta del sangue negli animali da laboratorio. Come sempre, grazie per la visione!