Astinenza di sangue II

La raccolta del sangue da topi e ratti è necessaria per un'ampia varietà di studi scientifici e i ricercatori hanno sviluppato diversi metodi per raggiungere specifici obiettivi sperimentali.

Nella prima puntata, abbiamo discusso la considerazione generale del prelievo di sangue e abbiamo esaminato il sanguinamento oculare retro-orbitale, le cesoie e le tacche della coda, nonché i metodi di raccolta del sangue intracardiaco. Qui delineeremo le procedure per la raccolta del sangue dalle vene facciali, sottomandibolari, safene e femorali. Questi metodi sono meno invasivi e non richiedono anestesia, il che li rende metodi di scelta quando l'uso di anestetici può confondere i risultati del sangue o altri dati.

Cominciamo con la procedura per ottenere un campione di sangue da una vena facciale murina. Sul topo c'è una vena facciale facilmente accessibile che attraversa la guancia. Inizia scegliendo l'attrezzatura adeguata per la procedura. Fondamentalmente, hai bisogno di una piccola provetta da centrifuga per la raccolta del sangue e di una lancetta, disponibile in diverse dimensioni. La selezione della lancetta corretta dipende dall'età, dal sesso e dal peso corporeo dell'animale e dalle dimensioni del campione da raccogliere. Vedere il protocollo di testo per i dettagli sulla selezione della lancetta.

Inizia la procedura trattenendo l'animale usando la tecnica della collottola. Un'adeguata contenzione riduce al minimo il movimento laterale della testa e aiuta a garantire un'accurata e sicura puntura venosa con la lancetta. Se l'impugnatura è troppo stretta, il flusso sanguigno può essere limitato con conseguente riduzione del volume raccolto. Una volta che l'animale è trattenuto, individua l'area approssimativa della vena facciale misurando la lunghezza dell'occhio sotto il canto laterale e la larghezza dell'occhio caudalmente. Con la punta della lancetta, sentire delicatamente il punto in cui termina l'osso mascellare. Per una migliore precisione nella perforazione del vaso, potresti voler posizionare il mouse su un lato.

Ora, nel sito di inserimento, tenere la lancetta perpendicolare alla superficie della pelle con la punta leggermente rivolta verso il naso. Questo è fondamentale, perché se la punta della lancetta è diretta caudalmente, il condotto uditivo verrà perforato causando sanguinamento dall'orecchio. Per perforare la vena, applicare una spinta decisa e perforare la pelle fino alla spalla della lancetta. Dopo la rimozione, il sangue inizierà a fluire. Per favorire il flusso, posizionare l'animale con la testa più bassa del cuore. Per fermare l'emorragia, tamponare il sito di puntura per ottenere l'emostasi e prevenire un'eccessiva perdita di sangue. Infine, rilasciare la pressione sulla collottola e riportare l'animale nella sua gabbia. Si noti che i volumi di raccolta variano, ma è imperativo NON superare il volume massimo per la raccolta del sangue di sopravvivenza. Vedere il protocollo di testo del video Blood Withdrawal One per i dettagli sul volume massimo di raccolta raccomandato. I campioni seriali possono essere prelevati alternando il lato utilizzato. Nessuno dei due lati deve essere usato più spesso di ogni 5-7 giorni.

Ora esaminiamo il metodo di sanguinamento della vena sottomandibolare. Sebbene questa sia molto simile alla tecnica per il sanguinamento della vena facciale, ci sono variazioni nell'attrezzatura e sottili differenze nella procedura di sanguinamento.

La vena sottomandibolare corre lungo la mascella inferiore del topo e converge con la vena facciale nella vena giugulare. Invece di una lancetta, questo metodo viene eseguito utilizzando aghi. Tuttavia, come per le lancette, la selezione del calibro dell'ago dipende dall'età, dal sesso, dal peso dell'animale e dalla dimensione del campione - vedere il protocollo di testo per i dettagli.

Per iniziare, strofina l'animale allo stesso modo del sanguinamento della vena facciale in modo che ci sia un movimento minimo da un lato all'altro della testa. Richiamo: una presa troppo stretta può ridurre il volume di raccolta del sangue. Mentre trattenete il topo, immaginate una linea dall'angolo della bocca attraverso il viso e una linea dal canto laterale dell'occhio. Il punto di intersezione di queste linee è l'area approssimativa della vena sottomandibolare. Questo coincide con una piccola fossetta glabra che si trova caudale all'angolo della bocca e leggermente al di sotto della linea della mascella.

Per una maggiore precisione, porre l'animale in deposizione laterale (3.6.1). Quindi, tieni l'ago perpendicolare alla superficie della pelle e inseriscilo con una spinta decisa. NON inserire l'ago oltre la punta smussata, poiché una profondità di inserimento maggiore può causare traumi ai muscoli, ai nervi e ad altri vasi che si trovano nella testa, nel collo e nella cavità orale. Dopo la rimozione dell'ago, il sangue inizierà a fluire. Come per il sanguinamento delle vene facciali, posiziona il mouse con la testa più in basso del cuore per favorire il flusso sanguigno. Infine, tamponare il sito di puntura per ottenere l'emostasi e rilasciare la pressione sulla collottola per riportare l'animale nella sua gabbia.

Ora, impariamo come raccogliere il sangue dalla vena safena. Questa vena è un vaso superficiale che corre dorsalmente e poi lateralmente attraverso l'articolazione tarsale.

L'attrezzatura necessaria per questa procedura include un dispositivo di contenzione, che potrebbe essere di plastica flessibile per i ratti o, per i topi, è possibile utilizzare un tubo conico di plastica modificato da 50 millilitri. Si noti che l'estremità del tubo è tagliata per consentire un foro di respirazione e una fessura larga mezzo pollice e lunga 2 pollici è tagliata dall'estremità del cappuccio. I bordi sono ricoperti di nastro adesivo per la sicurezza degli animali. Questa procedura richiede anche un laccio emostatico - prodotto utilizzando una siringa da 3 cc e una lunghezza di sutura non assorbibile 0-2, un triplo unguento antibiotico con un tampone - da utilizzare come barriera a prova di umidità tra la pelle e la gocciolina di sangue, un tagliacapelli, un ago calibro 22 per la venipuntura e una provetta per ematocrito per la raccolta del sangue.

Per trattenere un topo, posizionalo nel tubo, prima il naso. Quindi, guidare delicatamente la zampa posteriore nella fessura e stabilizzarla usando l'indice e il pollice. Successivamente, radere il pelo dalla faccia laterale della gamba dal garretto al ginocchio. Quindi, spalmare uno strato molto sottile dell'unguento antibiotico triplo sulla zona glabra. Successivamente, applicare il laccio emostatico il più possibile a livello cranico e stringerlo. Il vaso safeno che attraversa la superficie esterna dal ginocchio alla caviglia inizierà a riempirsi e diventerà sollevato e facile da visualizzare.

Quindi, tieni un ago calibro 22 direttamente sopra il vaso sanguigno e perpendicolarmente alla superficie della pelle. E perforare il vaso, facendo attenzione a non inserire l'ago troppo in profondità e perforare il muscolo o l'osso. Il sangue si accumula sulla superficie della gamba per essere raccolto in una provetta per ematocrito. Una volta raccolto il sangue, allentare il laccio emostatico e applicare pressione sulla puntura per l'emostasi. Dopo che l'emorragia si è fermata, rimuovere l'animale dal sistema di ritenuta e rimetterlo nella sua gabbia. I volumi raccolti con questo metodo sono compresi tra 10 e 150 ? L, a seconda della frequenza del campionamento. E la qualità del campione è variabile, in quanto può contenere prodotti tissue. Non dovrebbero essere prelevati più di 4 campioni di sangue entro un periodo di 24 ore dalla stessa gamba.

Infine, impareremo come raccogliere il sangue dalla vena femorale, che è un'altra opzione per la raccolta del sangue su un ratto. La vena femorale corre sulla faccia mediale della zampa posteriore dall'inguine all'articolazione del ginocchio prima di attraversare il ginocchio e diventare la vena safena laterale, rendendola facilmente accessibile.

Il vantaggio del sanguinamento della vena femorale è che un volume maggiore viene raccolto più facilmente rispetto alla vena safena. Lo svantaggio è che questa procedura, in un animale cosciente, richiede due persone. L'attrezzatura necessaria per questa procedura è simile al metodo della vena safena, tranne per il fatto che non richiede il laccio emostatico e il dispositivo di contenimento preferibile è un cono flessibile. Per selezionare il cono corretto, misuralo rispetto alla lunghezza del corpo dell'animale e poi fai un foro ovale a livello della coscia.

Per trattenere l'animale, mettilo nel tubo, prima il naso. Quindi, piega l'estremità del cono e chiudilo usando una piccola clip per legare per evitare che l'animale esca. Ora tira la zampa posteriore attraverso l'apertura ovale per accedere alla vena femorale. Non stringere troppo forte in quanto potrebbe esacerbare la formazione di ematomi. Quindi, radere la superficie interna della gamba dall'inguine al ginocchio e applicare uno strato sottile di unguento antibiotico triplo sulla zona glabra. Successivamente, la persona di contenzione dovrebbe occludere la vena femorale e afferrare il topo con la superficie interna della gamba rivolta verso la persona che sta per prelevare il sangue. Tenendo l'ago calibro 22 perpendicolare al vaso sanguigno, perforare direttamente la vena e raccogliere il sangue in provette per ematocrito mentre perla sulla superficie della pelle. La puntura deve essere il più vicino possibile al ginocchio per consentire un futuro campionamento anteriore a questo sito. Inoltre, assicurarsi che la profondità della puntura non sia superiore alla lunghezza dello smusso dell'ago. Per favorire il flusso sanguigno, posizionare il ratto con la zampa più in basso del cuore. Infine, rilasciare la pressione sulla gamba e applicare pressione sul sito di puntura per ottenere l'emostasi e prevenire un'eccessiva perdita di sangue. Si noti che con questa procedura è possibile raccogliere una quantità significativamente maggiore di sangue.

Dopo aver discusso le basi delle tecniche di raccolta del sangue, esaminiamo alcuni esempi del motivo per cui queste procedure possono essere utili per la ricerca scientifica

Il sangue viene spesso analizzato per confermare la risposta immunitaria durante lo sviluppo del vaccino. Qui, i ricercatori hanno somministrato un vaccino peptidico agli animali affetti da cancro alla vescica. Successivamente, hanno raccolto il sangue attraverso la vena sottomandibolare e separato il siero per rilevare i livelli di diverse citochine, che fungono da indicatori dell'efficacia del vaccino.

La raccolta del sangue viene anche comunemente eseguita per testare l'efficacia di un trattamento studiando i biomarcatori della malattia umana, come i livelli di glucosio nel diabete. Questi ricercatori erano interessati a testare l'efficacia di una nuova terapia genica somministrata attraverso la vena caudale negli animali diabetici. Dopo l'iniezione, questi ricercatori hanno raccolto sangue dalla vena safena in diversi punti temporali per analizzare l'effetto di diversi protocolli di trattamento sul livello di glucosio nel sangue.

Infine, per alcuni esperimenti, è importante conoscere lo stato di base dell'animale, come i livelli di infiammazione o stress. In questo esempio, il plasma sanguigno è stato raccolto da un ratto prima e dopo un evento stressante. E come puoi vedere, il livello di corticosterone, o ormone dello stress, è più alto negli animali dieci minuti dopo l'evento stressante.

Hai appena visto la seconda puntata di JoVE sulle tecniche di prelievo di sangue per topi e ratti. Dopo aver visto entrambi questi video, dovresti avere una migliore comprensione delle considerazioni e delle procedure per la raccolta del sangue da questi animali e di come vengono utilizzati oggi nella ricerca biomedica. Come sempre, grazie per la visione!