Name: Preparazione di Single-Cell Sospensioni da Spleen mouse con il dissociatore gentleMACS (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2008-12-11T00:00:00.000+00:00
Duration: 5 min 18 s
Description: Impara a preparare sospensioni di cellule singole da milza di topo usando il dissociatore gentleMACS. Questo metodo automatizzato garantisce elevata vitalità cellulare per analisi di citometria a flusso e applicazioni immunologiche.

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Introduzione alla Attrezzature <ol><li> Il tessuto è leggermente dissociato, utilizzando viola Tubi C in singola cellula vitale sospensioni. </li><li> La PBS / BSA tampone EDTA è usato per separare le cellule. Il buffer è preparato con l&#39;aggiunta di 1 parte di soluzione madre BSA per 20 parti di autoMACS Risciacquo Soluzione contenente EDTA. </li><li> La pre-separazione filtri MACS sono usati in modo che i campioni di tessuto dissociate sono liberi di tutti i grumi di cellule, favorendo il successo separazione MACS e successiva analisi. </li></ol> Dissociare le cellule della milza <ol><li> Milze intere disscociated in cella singola sospensioni di splenociti utilizzando il dissociatore gentleMACS. </li><li> Per iniziare la procedura, caricare la metropolitana C, con un volume di tampone a seconda della massa della milza. Una milza sana di un giovane adulto femmina BALB / c del mouse pesa circa 80-120 mg. Ogni 1 o 2 milza di questa massa richiedono 3 ml di tampone. Milza di animali più vecchi o animali con infezioni sono spesso più grandi e devono essere valutati nel buffer. I volumi buffer deve essere ripartita in proporzione. Non superano un volume totale di buffer di 10 ml. </li><li> Aggiungere la milza sezionato per la metropolitana C contenente 3 ml di buffer. </li><li> Assicurarsi che il tappo del tubo C è stretto e collegare il tubo C al dissociatore con il tappo verso il basso. </li><li> Accendere il dissociatore. Per 1-2 milza, selezionare m_spleen_01 programma. Il programma avrà 56 secondi per essere completata. Se il numero di milza è maggiore, usare il programma m_spleen_04, questo programma può essere utilizzato per un massimo di 720 mg di tessuto milza. </li><li> Dopo il completamento del programma del tessuto milza nativa è dissociato in una sospensione splenocyte. </li><li> Spin down la sospensione a cellule intere, a 300xg a temperatura ambiente per circa 30 sec. Questo farà sì che il rotore e lo statore sono liberati di tutte le cellule che vengono raccolte sul fondo del tubo C. </li><li> Rimuovere il campione attraverso il setto-sigillato l&#39;apertura del tappo del tubo C con una 1000 pipetter microlitro. </li></ol> Filtrazione passo <ol><li> Per iniziare la fase di filtrazione, applicare il tessuto dissociato al pre-filtro di separazione o di un colino cellula con 30 micron dimensioni dei pori. Il filtro dovrebbe montare un tubo di 15 ml per 1-2 milza o un tubo da 50 ml per più di 2 milze. </li><li> Lasciate che la sospensione di cellule passano attraverso. Poi lavare il filtro applicando 5 ml di tampone. </li><li> Ora, centrifugare la provetta con la sospensione cellulare a 300xg, a temperatura ambiente per 10 minuti per raccogliere tutte splenociti in una milza pellet. </li><li> Ora, che abbiamo un pellet di splenociti dissociato, dobbiamo aspirare il supernatante e risospendere il pellet cellulare in una quantità adeguata di buffer. </li></ol> Dissociazione milza utilizzando il dissociatore gentleMACS produrrà una elevata percentuale di splenociti vitale, che è dimostrato mediante citometria di flusso utilizzando l&#39;analizzatore MACSQuant. Le cellule morte sono colorate con ioduro di propidio. Nell&#39;esempio fornito, l&#39;attaccante scatter plot mostra il lato dot splenociti preparato.

Tutti i protocolli e le schede tecniche sono disponibili all&#39;indirizzo<a href="http://www.miltenyibiotec.com"&gt; Http://www.miltenyibiotec.com.</a&gt;.

Per evitare di dissociazioni manuali ripetitive e spesso dolorosa, il dissociatore gentleMACS permette di dissociare i tessuti in maniera molto efficiente, in condizioni controllate e riproducibili. La procedura di dissociazione tessuto è delicato per le cellule e sospensioni cellulari produce un alto tasso di vitalità. Il dissociatore gentleMACS in combinazione con C Tubi è stata progettata per la preparazione di singola cellula sospensioni da vari tessuti. Lo strumento è dotato di una serie di programmi preimpostati per dissociare il mouse milza, fegato, polmone, o tessuto neurale. La gamma di programmi e protocolli sarà continuamente ampliata per includere altri tessuti.

<table><tbody><tr><td>Kit iniziale gentleMACS&amp;#8482;</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-093-235</td><td>&lt;a href=&quot;http://www.miltenyibiotec.com/en/PG_709_763_gentleMACS_Dissociator.aspx">http://www.miltenyibiotec.com/en/PG_709_763_gentleMACS_Dissociator.aspx&lt;/a&gt;</td></tr><tr><td>C Tube</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-093-237</td><td>&lt;a href=&quot;http://www.miltenyibiotec.com/en/PG_709_765_gentleMACS_C_Tubes.aspx">http://www.miltenyibiotec.com/en/PG_709_765_gentleMACS_C_Tubes.aspx&lt;/a&gt;</td></tr><tr><td>Tube da 13 mL</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-091-596</td><td>&lt;a href=&quot;http://www.miltenyibiotec.com/en/PG_34_751_13_mL_Tubes_for_LS_Columns.aspx">http://www.miltenyibiotec.com/en/PG_34_751_13_mL_Tubes_for_LS_Columns.aspx&lt;/a&gt;</td></tr><tr><td>Soluzione di risciacquo autoMACS&amp;#8482;</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-091-222</td><td>&lt;a href=&quot;http://www.miltenyibiotec.com/en/PG_134_155_autoMACS_Rinsing_Solution.aspx">http://www.miltenyibiotec.com/en/PG_134_155_autoMACS_Rinsing_Solution.aspx&lt;/a&gt;</td></tr><tr><td>Soluzione madre MACS&amp;#174; BSA</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-091-376</td><td>&lt;a href=&quot;http://www.miltenyibiotec.com/en/PG_33_295_MACS_BSA_Stock_Solution.aspx">http://www.miltenyibiotec.com/en/PG_33_295_MACS_BSA_Stock_Solution.aspx&lt;/a&gt;</td></tr><tr><td>Filtri pre-separazione</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-041-407</td><td>&lt;a href=&quot;http://www.miltenyibiotec.com/en/PG_34_247_Pre_Separation_Filters.aspx">http://www.miltenyibiotec.com/en/PG_34_247_Pre_Separation_Filters.aspx&lt;/a&gt;</td></tr><tr><td>Analizzatore MACSQuant</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-092-197</td><td></td></tr><tr><td>Soluzione di ioduro di propidio</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-093-233</td><td>&lt;a href=&quot;http://www.miltenyibiotec.com/en/PG_337_744_Propidium_Iodide_Solution.aspx">http://www.miltenyibiotec.com/en/PG_337_744_Propidium_Iodide_Solution.aspx&lt;/a&gt;</td></tr></tbody></table>

preparazione di single-cell sospensioni da spleen mouse con il dissociatore gentlemacs

Preparation of Single-Cell Suspensions from Mouse Spleen with the gentleMACS Dissociator

Monocellulari sospensioni sono un prerequisito per esperimenti di separazione delle cellule, l&#39;analisi delle cellule e coltura delle cellule. Per evitare di dissociazioni manuali ripetitive e spesso doloroso il dissociatore gentleMACS permette di dissociare i tessuti in maniera molto efficiente, in condizioni controllate e riproducibili. Il dissociatore gentleMACS può dissociarsi in modo ottimale milza del mouse, coniugando risparmio di tempo e di normalizzazione dall&#39;utente sicurezza. Questo video spiega come dissociare milza del mouse utilizzando il dissociatore gentleMACS, un sistema automatico da banco dispositivo in grado di distruggere meccanicamente i tessuti con tubi speciali per la produzione di sospensioni di cellule vitali. A seguito di dissociazione, milza vengono filtrati, centrifugati e risospesi per ulteriori applicazioni.

Questo video descrive un semplice, di risparmiare tempo tecnica per la dissociazione dei tessuti automatizzato mediante il dissociatore gentleMACS per preparare cella singola sospensioni di splenociti mouse.

Preparazione di Single-Cell Sospensioni da Spleen mouse con il dissociatore gentleMACS

Le sospensioni di singole cellule sono un prerequisito per gli esperimenti di separazione, analisi e coltura cellulare. Per evitare la tediosa e spesso dolorosa procedura manuale...

In questo protocollo video, vedrai come dissociare milze di topo utilizzando Gentle Max, un dispositivo automatico da banco che può frammentare meccanicamente i tessuti mediante speciali provette per ottenere sospensioni cellulari vitali. Dopo la dissociazione, le milze vengono filtrate con filtri di separazione Max Pres, centrifugate e sospese per ulteriori applicazioni. Ciao, mi chiamo Melanie mlu.Sono un ricercatore presso Milton Biotech qui nel BE Lab Park, Germania. Oggi vi mostrerò la preparazione di una sospensione di singole cellule a partire dalla milza di topo utilizzando la dissociazione GenX. La dissociazione GenX permette una preparazione molto semplice e rapida di una sospensione di singole cellule.Iniziamo. Per evitare dissociazioni manuali noiose e spesso dolorose, il dissociazione massima delicata consente di dissociare i tessuti in modo molto efficiente in condizioni controllate e riproducibili. I tessuti vengono dissociati delicatamente utilizzando tubi di colore violetto C in sospensioni di singole cellule vitali.Il tubo C presenta un'apertura sigillata con setto al centro del tappo, che consente di pipettare dal tubo mantenendo sempre la sterilità. Per sospendere le cellule dissociate, sarà necessario utilizzare il corretto tampone P-B-S-B-S-A-E-D-T-A. Il tampone viene preparato aggiungendo una parte di soluzione madre di BSA a 20 parti di soluzione AutoMax per diluizione contenente EDTA.Utilizzando i filtri di separazione Max Pres, i campioni di tessuto vengono liberati da tutti gli aggregati cellulari, favorendo una separazione massima e un'analisi successiva efficace. Per iniziare la procedura, carichiamo il tubo C con un volume di tampone. In base alla massa delle milze, una milza sana di un topo femmina da biopsia di sei o sette settimane pesa circa 80-120 milligrammi.Ogni uno o due milza di questa massa richiede tre millilitri di tampone. Non superare un volume totale di 10 millilitri. Possiamo ora aggiungere la milza dissezionata nel tubo C contenente tre millilitri di tampone. Le milze di animali più vecchi o di animali con infezioni sono spesso più grandi e devono essere pesate nel tampone.I volumi del buffer devono quindi essere scalati di conseguenza, ma ancora una volta non devono superare un volume totale di 10 millilitri. Ora, assicurarsi che il tappo del tubo C sia ben chiuso e collegare il tubo C al dissociatore. Con il tappo rivolto verso il basso, accendere il dissociatore: per uno o due milzi, selezionare il Programma M milza oh uno. Il programma richiederà 56 secondi per completarsi; se il numero di milzi è maggiore, utilizzare il Programma M milza oh quattro.Questo programma può essere utilizzato per un massimo di 720 milligrammi di tessuto splenico. Al termine del programma, il tessuto splenico nativo viene dissociato in una sospensione di cellule PLE, che presenta quest'aspetto; centrifugare brevemente per raccogliere il campione sul fondo del tubo. Ciò garantirà che rotore e statore siano liberati da tutte le cellule, che si accumulano sul fondo del tubo C.Rimuoviamo il campione attraverso l'apertura sigillata con settimo nel tappo del tubo C utilizzando una pipetta da mille microlitri. Per iniziare la fase di filtrazione, applichiamo il tessuto dissociato sul filtro di pre-separazione o su un setaccio con dimensione dei pori di 30 micron. Il setaccio deve adattarsi a un tubo da 15 millilitri per uno o due milzi o a un tubo da 50 millilitri per più di due milzi.Fare passare la sospensione cellulare, quindi lavare il filtro applicando cinque millilitri di tampone. Centrifugare ora il tubo con la sospensione cellulare a 300 G a temperatura ambiente per 10 minuti per raccogliere tutte le cellule in un pellet di cellule spleniche. Ora che abbiamo un pellet di cellule dissociate, dobbiamo aspirare il soprannatante e risospendere il pellet cellulare in una quantità appropriata di tampone per la dissociazione della milza.L'utilizzo del gentle max produrrà un'alta percentuale di PLE citi vitali, come dimostrato dalla citometria a flusso mediante il max quant. Le cellule morte vengono colorate con ioduro di propidio e dall'esempio fornito. Il diagramma a dispersione laterale e anteriore mostra SP citi preparati. Ok.Vi ho mostrato come dissociare il tessuto splenico utilizzando questa delicata dissociazione X. Quando eseguite questa procedura, è importante regolare la quantità di buffer in base alle dimensioni del campione e scegliere il programma Gentle X appropriato. Ok, questo è tutto.In bocca al lupo per il tuo esperimento.

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La preparazione standardizzata di Single-Cell Sospensioni da tessuto polmonare del mouse utilizzando il dissociatore gentleMACS

Dissociare cellule di tipi di tessuto specifico richiede parametri specifici per aggitation tessuto per ottenere un elevato volume di vitali, cellule coltivabili. Il Miltenyi gentleMACS dissociatore ottimizza questa operazione con un semplice protocollo pratico. In questa pubblicazione l'utilizzo di questo apparecchio sul tessuto nerual è spiegato.

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