Preparazione di Single-Cell Sospensioni da Spleen mouse con il dissociatore gentleMACS

In questo protocollo video, vedrai come dissociare milze di topo utilizzando Gentle Max, un dispositivo automatico da banco che può frammentare meccanicamente i tessuti mediante speciali provette per ottenere sospensioni cellulari vitali. Dopo la dissociazione, le milze vengono filtrate con filtri di separazione Max Pres, centrifugate e sospese per ulteriori applicazioni. Ciao, mi chiamo Melanie mlu.

Sono un ricercatore presso Milton Biotech qui nel BE Lab Park, Germania. Oggi vi mostrerò la preparazione di una sospensione di singole cellule a partire dalla milza di topo utilizzando la dissociazione GenX. La dissociazione GenX permette una preparazione molto semplice e rapida di una sospensione di singole cellule.

Iniziamo. Per evitare dissociazioni manuali noiose e spesso dolorose, il dissociazione massima delicata consente di dissociare i tessuti in modo molto efficiente in condizioni controllate e riproducibili. I tessuti vengono dissociati delicatamente utilizzando tubi di colore violetto C in sospensioni di singole cellule vitali.

Il tubo C presenta un'apertura sigillata con setto al centro del tappo, che consente di pipettare dal tubo mantenendo sempre la sterilità. Per sospendere le cellule dissociate, sarà necessario utilizzare il corretto tampone P-B-S-B-S-A-E-D-T-A. Il tampone viene preparato aggiungendo una parte di soluzione madre di BSA a 20 parti di soluzione AutoMax per diluizione contenente EDTA.

Utilizzando i filtri di separazione Max Pres, i campioni di tessuto vengono liberati da tutti gli aggregati cellulari, favorendo una separazione massima e un'analisi successiva efficace. Per iniziare la procedura, carichiamo il tubo C con un volume di tampone. In base alla massa delle milze, una milza sana di un topo femmina da biopsia di sei o sette settimane pesa circa 80-120 milligrammi.

Ogni uno o due milza di questa massa richiede tre millilitri di tampone. Non superare un volume totale di 10 millilitri. Possiamo ora aggiungere la milza dissezionata nel tubo C contenente tre millilitri di tampone. Le milze di animali più vecchi o di animali con infezioni sono spesso più grandi e devono essere pesate nel tampone.

I volumi del buffer devono quindi essere scalati di conseguenza, ma ancora una volta non devono superare un volume totale di 10 millilitri. Ora, assicurarsi che il tappo del tubo C sia ben chiuso e collegare il tubo C al dissociatore. Con il tappo rivolto verso il basso, accendere il dissociatore: per uno o due milzi, selezionare il Programma M milza oh uno. Il programma richiederà 56 secondi per completarsi; se il numero di milzi è maggiore, utilizzare il Programma M milza oh quattro.

Questo programma può essere utilizzato per un massimo di 720 milligrammi di tessuto splenico. Al termine del programma, il tessuto splenico nativo viene dissociato in una sospensione di cellule PLE, che presenta quest'aspetto; centrifugare brevemente per raccogliere il campione sul fondo del tubo. Ciò garantirà che rotore e statore siano liberati da tutte le cellule, che si accumulano sul fondo del tubo C.

Rimuoviamo il campione attraverso l'apertura sigillata con settimo nel tappo del tubo C utilizzando una pipetta da mille microlitri. Per iniziare la fase di filtrazione, applichiamo il tessuto dissociato sul filtro di pre-separazione o su un setaccio con dimensione dei pori di 30 micron. Il setaccio deve adattarsi a un tubo da 15 millilitri per uno o due milzi o a un tubo da 50 millilitri per più di due milzi.

Fare passare la sospensione cellulare, quindi lavare il filtro applicando cinque millilitri di tampone. Centrifugare ora il tubo con la sospensione cellulare a 300 G a temperatura ambiente per 10 minuti per raccogliere tutte le cellule in un pellet di cellule spleniche. Ora che abbiamo un pellet di cellule dissociate, dobbiamo aspirare il soprannatante e risospendere il pellet cellulare in una quantità appropriata di tampone per la dissociazione della milza.

L'utilizzo del gentle max produrrà un'alta percentuale di PLE citi vitali, come dimostrato dalla citometria a flusso mediante il max quant. Le cellule morte vengono colorate con ioduro di propidio e dall'esempio fornito. Il diagramma a dispersione laterale e anteriore mostra SP citi preparati. Ok.

Vi ho mostrato come dissociare il tessuto splenico utilizzando questa delicata dissociazione X. Quando eseguite questa procedura, è importante regolare la quantità di buffer in base alle dimensioni del campione e scegliere il programma Gentle X appropriato. Ok, questo è tutto.

In bocca al lupo per il tuo esperimento.