1. Preparazione
2. Raccolta dei tessuti
Fonte: Kay Stewart, RVT, RLATG, CMAR; Valerie A. Schroeder, RVT, RLATG. Università di Notre Dame, IN
Nel 1959 le 3 R furono introdotte da W.M.S. Russe…
1. Preparazione
2. Raccolta dei tessuti
Molti esperimenti richiedono la raccolta di cellule dal tessuto asportato. In questi casi, è imperativo che la procedura di prelievo dei tessuti venga eseguita in modo sterile. L'uso di linee cellulari e colture di tessuti provenienti da animali da ricerca consente di condurre molti esperimenti in vitro, il che a sua volta riduce l'uso di animali nella ricerca.
In questo video, discuteremo il metodo asettico per il prelievo di organi comunemente estratti da animali da laboratorio. E questo sarà seguito da una breve rassegna di alcuni esperimenti di esempio che impiegano questa tecnica sterile per raggiungere diversi obiettivi di ricerca.
Cominciamo con le fasi di preparazione necessarie per garantire la sterilità dello spazio, degli strumenti e del personale durante la raccolta dei tessuti animali.
Questa procedura viene eseguita in una cappa a flusso laminare. Prima del processo, la ventola della cappa deve funzionare per almeno 15 minuti e l'area deve essere disinfettata con alcol al 70%. Quindi, metti dei tovaglioli di carta nella cappa e bagnali con etanolo al 70%. Successivamente, caricare l'attrezzatura sterile e organizzarla in base all'ordine in cui verrà utilizzato ogni strumento, di solito da sinistra a destra. Ciò consente che il flusso di lavoro avvenga in modo unidirezionale, evitando la contaminazione accidentale dalla carcassa dell'animale.
Si raccomanda la presenza di un tecnico non sterile per assistere il tecnico sterile. Entrambi gli operatori devono indossare una maschera e un bouffant. Il tecnico sterile deve indossare un camice sterile e due paia di guanti chirurgici sterili. Si noti che il camice e i guanti devono coprire i polsi per evitare la dispersione di cellule cutanee nella cavità corporea aperta, nelle piastre di Petri o nei terreni sterili.
La persona non sterile apre la confezione dello strumento sterile senza toccare la superficie interna, in modo che la persona sterile possa rimuovere lo strumento in modo asettico. Infine, il tecnico non sterile sopprime l'animale, posiziona la carcassa sui tovaglioli di carta e la immerge completamente con alcol al 70%, in modo che la persona sterile possa iniziare il raccolto.
Innanzitutto, esamineremo l'estrazione degli organi addominali, tra cui milza, fegato, reni, ovaie e testicoli.
Usando un set di forbici e pinze sterili, fai un taglio orizzontale nella pelle appena anteriore al prepuzio nei maschi e all'osso pelvico nelle femmine. Evitare di tagliare la muscolatura addominale. Quindi, posiziona il pollice sotto il taglio e afferra il bordo cranico del taglio. Usando l'altra mano, tieni saldamente gli arti posteriori e la coda, mentre tiri la pelle verso la testa. La pelle si strappa dal corpo appena sopra gli arti posteriori e può essere capovolta sopra la testa e le zampe anteriori. Questo rimuove efficacemente i contaminanti dei capelli che potrebbero interferire con il prelievo sterile degli organi. Quindi, immergere nuovamente il corpo con alcol al 70% e rimuovere il paio di guanti superficiali, che non sono più sterili. Scartare anche tutti gli strumenti che sono stati utilizzati sulla pelle.
Per prelevare la milza, posizionare il corpo in decubito laterale destro. La milza dovrebbe essere visibile attraverso il muscolo addominale. Usa le forbici per fare un taglio direttamente sopra la milza e ritrarre delicatamente l'organo dalla cavità del corpo. Taglia tutti gli attacchi tra la milza e lo stomaco e il tessuto pancreatico, ma evita di perforare o strappare l'organo.
Per prelevare tutti gli altri organi addominali, posizionare il corpo in decubito dorsale. Quindi, sollevare e tagliare via il muscolo addominale lasciando un'apertura ovale direttamente sopra la cavità addominale. Per prelevare il fegato, riflettere l'organo caudalmente lontano dal diaframma. Ora usa le forbici per recidere con cura tutte le membrane tra le due strutture. Quindi, fai un taglio perpendicolare alla colonna vertebrale attraverso i vasi sanguigni. Quindi solleva il fegato e riflettilo verso il diaframma per visualizzare gli attacchi sottostanti. Ci saranno membrane sottili che attaccano i lobi epatici più piccoli allo stomaco e all'intestino tenue. Afferra il nodo fibroso al centro del fegato sul lato inferiore e solleva l'organo per trovare tutti gli attacchi. Ora separa l'organo dai tessuti sottostanti. Si noti che il fegato è fragile e può essere facilmente perforato con conseguente rilascio eccessivo di sangue. Pertanto, deve essere maneggiato con cura.
Per raccogliere i reni, spingere l'intestino a sinistra per esporre il rene destro o a destra per esporre il rene sinistro. Ora usa le lame del forcipe per afferrare sotto il rene e usando le forbici taglia sotto il forcipe, rimuovendo l'organo dal corpo.
Per raccogliere le ovaie, muovi l'intestino cranialmente per visualizzare l'utero. Segui le corna uterine sinistra e destra fino alle ovaie. Si tratta di piccoli organi e negli animali più anziani possono essere incorporati nel grasso. Fai scorrere la pinza sotto l'ovaio per isolarlo dal corpo e liberarlo dal grasso e dalle tube di Falloppio.
Nei maschi, per rimuovere i testicoli, afferrare delicatamente il cuscinetto adiposo inguinale e tirare anteriormente. Questo estrarrà il testicolo dallo scroto. Una volta che diventano visibili, taglia gli attacchi allo scroto e al dotto deferente per liberare queste strutture dal corpo.
Successivamente, impariamo come prelevare organi toracici, come il cuore e i polmoni. Il cuore e i polmoni vengono rimossi più facilmente insieme. Per aprire la cavità toracica, iniziare mettendo l'animale in decubito dorsale. Innanzitutto, afferra e solleva il processo xifoideo. Quindi fai un taglio attraverso il muscolo addominale appena caudale alle costole. Estendere il taglio lungo la curva inferiore della gabbia toracica su entrambi i lati, esponendo il diaframma.
Quindi, forare il diaframma praticando un piccolo taglio nella gabbia toracica nel punto più laterale possibile su ciascun lato. Quindi, taglia il diaframma dalle costole. Ora solleva le costole allo xifoide per visualizzare gli organi toracici. Estendi il taglio laterale fino alla parte superiore dello sterno su entrambi i lati per aprire il torace. Quindi posizionare la pinza perpendicolarmente alla trachea e afferrare saldamente la trachea. Ora, usando le forbici, fai un taglio perpendicolare appena anteriormente alla pinza. Questo dovrebbe recidere la trachea e l'esofago. Senza allentare la presa sulla trachea, sollevarla caudalmente e tagliare eventuali attacchi dei polmoni alla superficie spinale nella gabbia toracica. Continua fino a quando non sei in grado di sollevare il cuore e i polmoni dalla cavità toracica.
Per rimuovere solo il cuore, sollevare l'organo e tagliare con cura il sacco pericardico. Quindi, tieni l'aorta con la pinza e fai un taglio distale alla pinza. Quindi recidere la vena cava anteriore, le arterie polmonari e le vene. Dopodiché, dovresti essere in grado di sollevare il cuore dalla cavità toracica.
Ora, esaminiamo la procedura di prelievo del cervello utilizzando una tecnica asettica. Nei casi in cui il cervello è l'unico organo ad essere raccolto, le fasi di preparazione sono le stesse.
Per iniziare il raccolto, saturare il corpo con l'alcol e strappare la pelle dal corpo come prima, su e sopra il cranio. Ciò consente a tutto di essere sterile da questo punto in poi. Quindi, saturare nuovamente l'animale con alcol, rimuovere i guanti esterni e gettare gli strumenti utilizzati sulla pelle. Ora fai un taglio sulla nuca ed estendilo lungo la linea mediana dalla zona cervicale dorsale alla punta del naso.
Ora, usando un paio di forbici sterili per la raccolta del cervello, fai un taglio attraverso la colonna vertebrale alla base del cranio. Per aprire il cranio, posizionare la punta delle forbici nel forame magno e tagliare lungo la linea mediana. Si noti che durante questa procedura di prelievo del cervello, una mano è considerata non sterile in quanto afferra la pelle dal cranio riflessa sotto il mento per stabilizzare la testa, mentre la mano sterile viene utilizzata per tagliare il cranio. Dopodiché, usa il bordo piatto della lama della forbice per sollevare le ossa parietali dal cervello. E usando la spatola, interrompi con cura gli attacchi nervosi al tronco encefalico e il chiasma ottico sotto il cervello. Infine, far scorrere anteriormente la pinza chiusa e rompere gli attacchi in corrispondenza dei bulbi olfattivi. E il cervello può quindi essere lasciato cadere dal cranio direttamente nel terreno sterile.
Ora che abbiamo esaminato gli elementi essenziali della raccolta di tessuti sterili, discutiamo alcuni dei numerosi usi di questa procedura nella ricerca biomedica.
I ricercatori dello staminali neurale utilizzano una tecnica di raccolta sterile per estrarre il tessuto dal cervello neonatale del topo, per far crescere queste cellule in vitro. Ciò consente loro di studiare il ruolo delle cellule staminali neurali nello sviluppo e nella progressione del cancro.
Un'altra area attiva di ricerca che coinvolge la raccolta dei tessuti è la profilazione metabolica, che prevede lo studio della fisiologia dei tessuti analizzando i diversi metaboliti in un campione. In questo esempio, gli scienziati, utilizzando una tecnica asettica, hanno raccolto biopsie epatiche da topi wild type e germ-free e hanno utilizzato la spettroscopia di risonanza magnetica nucleare, o NMR, per chiarire la differenza nel profilo metabolico epatico delle due popolazioni animali.
Infine, gli immunologi eseguono spesso il prelievo di tessuti sterili per studiare la diffusione dell'infezione. In questo particolare esperimento, i ricercatori hanno eseguito un'iniezione intratracheale del batterio Pseudomonas aeruginosa per indurre un'infezione polmonare cronica. Successivamente, gli animali sono stati soppressi e i polmoni sono stati estratti utilizzando una tecnica asettica per determinare la carica batterica a 3, 7, 14 e 28 giorni dopo l'infezione.
Hai appena visto il video di JoVE sulla raccolta di tessuti da animali da laboratorio utilizzando la tecnica asettica. Ora dovresti avere un'idea migliore dei passaggi che devi adottare per garantire che la sterilità sia mantenuta durante il raccolto. E dovresti essere in grado di estrarre gli organi addominali e toracici e il cervello da questi animali senza causare alcun danno ai tessuti. Come sempre, grazie per la visione!
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Q1: Why is sterile tissue harvest important in laboratory animal research?
Sterile tissue harvest prevents contamination of cells and organs collected from research animals, which is essential for cell and tissue cultures, protein and RNA analysis, and metabolic profiling. Using harvested tissues for in vitro experiments reduces overall animal usage in research, supporting the replacement principle of the 3 R's framework for humane research practices.
Q2: What equipment and preparation are needed before starting a sterile tissue harvest?
The procedure requires a laminar flow hood running for at least 15 minutes before use. Disinfect the hood with 70% alcohol and place wet paper towels inside. Arrange sterile instruments in order of use from left to right to maintain unidirectional workflow. The sterile technician must wear a sterile gown and two pairs of sterile surgical gloves covering the wrists to prevent skin cell contamination.
Q3: How are abdominal organs like the liver and spleen removed during sterile harvest?
For the spleen, position the animal in right lateral recumbency and cut directly over the organ, gently retracting it while avoiding punctures. For the liver, place the animal in dorsal recumbency, reflect it away from the diaphragm, and carefully sever membranes and blood vessels. The liver is fragile and easily punctured, so handle it carefully to prevent excessive blood release that could compromise tissue quality.
Q4: What is the proper technique for harvesting the heart and lungs together?
Place the animal in dorsal recumbency and open the thoracic cavity by cutting through the abdominal muscle and diaphragm. Puncture the diaphragm at the lateral rib cage and extend cuts to the sternum. Grasp the trachea with forceps and sever it with scissors, then lift and remove lung attachments from the spinal surface until the heart and lungs can be lifted free from the chest cavity.
Q5: How is the brain harvested using aseptic technique?
Strip the skin from the body and over the skull, then saturate with alcohol and remove outer gloves. Make a cut along the midline from the cervical area to the nose. Using dedicated sterile scissors, cut through the spine at the skull base and along the midline through the foramen magnum. Lever the parietal bones away, disrupt nerve attachments with a spatula, and break olfactory bulb attachments with forceps before dropping the brain into sterile media.
Q6: What research applications use sterile tissue harvest techniques?
Neural stem researchers extract tissue from mouse neonatal brains to study stem cell development and cancer progression in vitro. Metabolic profiling studies analyze tissue metabolites using nuclear magnetic resonance spectroscopy. Immunologists harvest lungs aseptically to measure bacterial load in infection models, collecting samples at multiple time points to track disease progression.
Q7: What roles do sterile and non-sterile technicians play during tissue harvest?
Both technicians wear masks and bouffants. The non-sterile technician euthanizes the animal, places the carcass on paper towels, soaks it with 70% alcohol, and opens sterile instrument packages without touching inner surfaces. The sterile technician wears a sterile gown and two pairs of gloves, removes instruments aseptically, and performs the actual organ extraction to maintain sterility throughout the procedure.
Capitoli in questo video
0:00
Overview
1:06
Prepping for Sterility: Space, Instruments, and Personnel
3:04
Harvesting Abdominal Organs
7:08
Harvesting Thoracic Organs
9:12
Harvesting Brain
11:00
Applications
12:02
Summary