Raccolta di tessuti sterili

Sterile Tissue Harvest

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Lab Animal Research

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Sterile Tissue Harvest

5.7: Compound Administration II

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12:24 min

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August 24, 2015

Overview

Fonte: Kay Stewart, RVT, RLATG, CMAR; Valerie A. Schroeder, RVT, RLATG. Università di Notre Dame, IN

Nel 1959 le 3 R furono introdotte da W.M.S. Russell e R.L. Burch nel loro libro The Principles of Humane Experimental Technique. Le 3 R sono la sostituzione, la riduzione e il perfezionamento dell’uso degli animali nella ricerca. ¹ L’uso di linee cellulari e colture tissutali originate da animali da ricerca è una tecnica sostitutiva, in quanto consente di condurre molti esperimenti in vitro. Il prelievo di tessuti e organi per l’uso in colture cellulari e tissutali richiede una tecnica asettica per evitare la contaminazione dei tessuti. La raccolta sterile è necessaria anche per l’analisi di proteine e RNA e la profilazione metabolica dei tessuti. Questo manoscritto discuterà il processo di prelievo di organi sterili in ratti e topi.

Principles

La tecnica asettica deve essere seguita per garantire la sterilità dei tessuti. La raccolta viene eseguita in una cappa a flusso laminare che è stata disinfettata con alcool. Tutti i materiali utilizzati devono essere sterilizzati. Il tecnico che esegue la raccolta deve indossare dispositivi di protezione individuale, tra cui maschera, bouffant, camice chirurgico sterile e guanti chirurgici sterili. L’abito deve coprire i polsi per prevenire lo spargimento di cellule della pelle nella cavità del corpo aperta, nelle piastre di Petri o nel mezzo sterile. Per mantenere la sterilità del tecnico, questa procedura richiede che un secondo tecnico non sterile assista il tecnico sterile con l’eutanasia degli animali.

Negli esperimenti che richiedono i profili metabolici dei tessuti, il metodo di raccolta dei tessuti ha un grande impatto sulla qualità dei dati raccolti. ² Sia la procedura di eutanasia che la durata del raccolto possono influire sull’integrità dei tessuti. L’ipossia, una conseguenza dell’eutanasia con anidride carbonica, ha dimostrato di avere un profondo effetto sui metaboliti nei tessuti. L’emorragia dei vasi nel tessuto polmonare è anche causata dall’uso di anidride carbonica per l’eutanasia. L’ordine di rimozione dei tessuti quando viene eseguita la dissezione sequenziale dei tessuti mirati può causare cambiamenti metabolici, poiché i tessuti iniziano a invecchiare o decadere durante il raccolto.

Mentre la maggior parte dei prelievi sterili mira a un singolo organo, ci possono essere momenti in cui è necessario più di un organo. Durante la dissezione sequenziale, i tessuti richiesti determineranno l’ordine in cui devono essere rimossi. ² I tessuti che si degradano rapidamente devono essere raccolti il più rapidamente possibile dopo l’eutanasia. Per mantenere la sterilità degli strumenti, gli organi prelevati dalla cavità addominale vengono rimossi nel seguente ordine: milza, fegato, rene, ghiandole surrenali, ovaie o testicoli, organi sessuali accessori (prostata, vescicole seminali, utero, tube di Falloppio), tessuto pancreatico, linfonodi, vescica urinaria e tratto intestinale (stomaco, intestino tenue e crasso). L’ordine del prelievo di organi dalla cavità toracica è quello di rimuovere prima il cuore e i polmoni seguiti dalla raccolta di timo, linfonodi ed esofago. ³ Per ogni mouse sono necessari nuovi guanti.

Alcuni degli organi prelevati sterili potrebbero dover essere conservati. La conservazione dei tessuti avviene mediante congelamento flash con azoto liquido (LN₂) o con una combinazione di LN₂ e 2-metilbutano. Per la sola LN_2, i tessuti vengono risciacquati in soluzione salina sterile, asciugati su un panno assorbente sterile per esaurire l’umidità in eccesso, posti in quadrati di foglio di alluminio sterile e immediatamente immersi nella LN₂. ² Per i campioni immunologici, viene aggiunto 2-metilbutano. Il tessuto è in realtà immerso nel 2-metilbutano che è stato raffreddato dal LN₂. Quando i tessuti sono diventati bianchi, vengono rimossi dal 2-metilbutano, posti in confezioni sterili e quindi collocati direttamente nel LN₂.

Procedure

1. Preparazione

I materiali comunemente usati includono alcol al 70% in una bottiglia di schizzo, aghi sterili da 20-25 gauge, due confezioni di strumenti sterili di forbici per l’iride e pinza per il pollice (una per la pelle e una per i tessuti interni), asciugamani di carta, guanti da chirurgo sterili, una capsula di Petri sterile, un mezzo sterile e una soluzione salina sterile.
La ventola del cappuccio deve essere in funzione per almeno 15 minuti prima della procedura e deve essere disinfettata con alcol al 70%.
Se la cappa è dotata di una lampada di sterilizzazione UV, può essere utilizzata per disinfettare ulteriormente la superficie di lavoro.
I guanti puliti sono indossati per la configurazione del cappuccio. L’attrezzatura viene caricata nel cofano nell’ordine in cui verranno utilizzati, di solito da sinistra a destra. Ciò consente di condurre il lavoro in un flusso di lavoro unidirezionale, evitando che gli oggetti sporchi contaminino gli articoli puliti. Ciò proteggerà i tessuti o gli organi prelevati dalla contaminazione accidentale delle carcasse animali.
Le confezioni sterili degli strumenti vengono aperte, rispettando l’interno sterile delle confezioni. Per mantenere la sterilità, la confezione viene posizionata al centro del tavolo e ogni lembo viene aperto senza attraversare il campo sterile o l’interno della confezione. La persona non sterilista apre il primo lembo superiore riflettendolo per lui / lei. I lembi laterali vengono quindi aperti utilizzando entrambe le mani , una su ciascun lembo – e allontanandoli dalla confezione. Il lembo finale viene quindi tirato verso la persona che apre la confezione, avendo cura di evitare di toccare una qualsiasi delle superfici interne della confezione.
Metti gli asciugamani di carta nel cappuccio e bagnali con alcool.
La persona non sterilizza gli animali.
La persona sterile indossa due serie di guanti chirurgici sterili.
La persona non sterilista posiziona la carcassa sugli asciugamani di carta e immerge completamente la carcassa con il 70% di alcol.
Usando un set di forbici sterili e pinza, fai un taglio orizzontale nella pelle appena anteriore al prepuzio (nei maschi) o all’osso pelvico (nelle femmine). Evitare di tagliare la muscolatura addominale.
Mettere da parte gli strumenti.

2. Raccolta dei tessuti

Fai un piccolo taglio appena anteriore al bacino nelle femmine e sopra il prepuzio nei maschi.
Posizionare il pollice sotto il taglio e afferrare il bordo cranico del taglio. Usando l’altra mano, tenere saldamente gli arti posteriori e la coda mentre si tira la pelle verso la testa.
La pelle si strappa via dal corpo appena sopra gli arti posteriori e può essere girata dentro e fuori sopra la testa e le zampe anteriori. Questo rimuove efficacemente i contaminanti dei capelli durante il prelievo di organi.
Immergere nuovamente il corpo con alcol al 70% e rimuovere il paio di guanti superficiali che non sono più sterili.
Aprire la cavità addominale utilizzando strumenti sterili.
1. Milza
  1. Per raccogliere la milza, il corpo è posizionato nella posizione laterale destra.
  2. La milza può essere visualizzata attraverso il muscolo addominale.
  3. Un taglio a forbice viene effettuato direttamente sopra la milza.
  4. La milza viene delicatamente ritratta dalla cavità corporea.
  5. Quando si tagliano tutti gli attacchi tra la milza, lo stomaco e il tessuto pancreatico, evitare di perforare o strappare l’organo.
2. Fegato
  1. Per raccogliere qualsiasi altro organo addominale, il corpo viene posto in reclinenza dorsale.
  2. Il muscolo addominale viene sollevato e tagliato via, lasciando un’apertura ovale direttamente sopra la cavità addominale.
  3. Dopo aver esposto la cavità addominale, riflettere il fegato caudale lontano dal diaframma.
  4. Tagliare con cura eventuali membrane che attaccano il fegato al diaframma.
  5. Fare un taglio perpendicolare alla colonna vertebrale attraverso i vasi sanguigni visibili tra il fegato e il diaframma.
  6. Sollevare il fegato e rifletterlo verso il diaframma per visualizzare gli attacchi sottostanti.
  7. Ci saranno membrane sottili che attaccano i lobi epatici più piccoli allo stomaco e all’intestino tenue, che dovranno essere interrotti.
  8. Afferrare il nodo fibroso al centro del fegato sul lato inferiore e sollevare l’organo per trovare tutti gli allegati. Separare il fegato dagli organi e dai tessuti sottostanti.
  9. Si noti che il fegato è fragile e può essere facilmente perforato, con conseguente rilascio di sangue; pertanto, deve essere maneggiato con attenzione.
3. Reni
  1. Dopo aver esposto la cavità addominale, spingere l’intestino a sinistra per visualizzare il rene destro o a destra per visualizzare il rene sinistro.
  2. Per rimuovere il rene, utilizzare le lame della pinza per afferrare sotto il rene per isolare l’organo dal corpo. Usando le forbici o una lama di bisturi, tagliare il rene lontano dal corpo. Fai il taglio sotto la pinca per evitare di danneggiare il rene.
  3. Una volta rimosso il rene, qualsiasi grasso può essere tagliato dall’organo.
4. Ovario
  1. Dopo aver esposto la cavità addominale, spostare l’intestino cranicamente per visualizzare l’utero.
  2. Seguire le corna a sinistra, e poi a destra, dell’utero alle ovaie.
  3. Le ovaie sono piccole. Negli animali più anziani, possono essere immersi nel grasso.
  4. Far scorrere la pinca sotto l’ovaio per isolarla dal corpo e tagliarla libera dal grasso e dalla tuba di Falloppio.
5. Testicoli
  1. Dopo aver aperto la cavità addominale, afferrare delicatamente il cuscinetto di grasso inguinale e tirarlo anteriormente.
  2. Questo tirerà il testicolo dallo scroto.
  3. Una volta che il testicolo è esposto, tagliare gli attacchi allo scroto e al dotto deferente per liberarlo dal corpo.
  4. Questo viene fatto per ogni testicolo.
La cavità toracica viene aperta per rimuovere gli organi toracici
1. Il corpo è posto in reclinenza dorsale. È imperativo che la pelle si rifletta ben sopra la testa se gli organi della cavità toracica devono essere prelevati.
2. Afferrare il processo xifoide e sollevare per consentire un taglio attraverso il muscolo addominale appena caudale alle costole. Estendere il taglio lungo la curva inferiore della gabbia toracica su entrambi i lati. Ciò consentirà la visualizzazione del diaframma.
3. Forare il diaframma facendo un piccolo taglio nella gabbia toracica nel punto più laterale possibile su ciascun lato. Tagliare il diaframma lontano dalle costole.
4. Sollevare le costole allo xifoide per visualizzare gli organi toracici.
5. Estendere il taglio laterale fino alla parte superiore dello sterno su entrambi i lati e aprire il torace.
6. Il cuore e i polmoni sono più facilmente rimossi insieme.
  1. Posizionare la pinna perpendicolare alla trachea e afferrare saldamente la trachea.
  2. Usando le forbici, fare un taglio perpendicolare alla trachea appena anteriore alla pinza. Questo taglio dovrebbe tagliare la trachea e l’esofago.
  3. Senza allentare la presa sulla trachea, sollevare la trachea e caudally. Snip qualsiasi attacco dei polmoni alla superficie spinale nella gabbia toracica.
  4. L’esofago potrebbe aver bisogno di essere tagliato per essere in grado di sollevare il cuore e i polmoni liberi dalla cavità toracica.
7. Solo cuore
  1. Sollevare il cuore e tagliare con cura il sacco pericardico.
  2. L’aorta si trova all’aspetto cranico del cuore alla sinistra dell’animale.
  3. Tenendo l’aorta con la pinica, fare un taglio distale alla pinica, mantenendo una presa sull’aorta e sul cuore.
  4. Afferrare l’aorta mentre si recide la vena cava anteriore e le arterie e le vene polmonari.
  5. Sollevare il cuore libero dalla cavità toracica dall’arteria aortica.
8. Altri organi toracici
  1. Gli organi vengono prelevati nel seguente ordine per mantenere la sterilità degli strumenti: timo, linfonodi ed esofago.
Cervello
1. In circostanze speciali, il cervello dovrà essere raccolto per una coltura sterile.
2. Il cervello viene prelevato per ultimo dopo qualsiasi altro prelievo di organi.
3. Nei casi in cui il cervello è l’unico organo da raccogliere, la pelle non viene strappata dal corpo, ma invece viene effettuato un taglio alla nuca e si estende lungo la linea mediana dalla zona cervicale dorsale alla punta del naso.
4. Dopo aver allontanato la pelle dal cranio lateralmente, l’osso esposto viene imbevuto di alcol al 70% e i guanti superiori sporchi vengono rimossi.
5. Usando un paio dedicato di forbici sterili per la raccolta del cervello, fai un taglio attraverso la colonna vertebrale alla base del cranio.
6. Apri il cranio posizionando la punta delle forbici nel forame magnum e tagliando lungo la linea mediana.
7. Utilizzare l’estremità piatta della lama a forbice per allontanare le ossa parietali dal cervello.
8. Interrompere attentamente gli attaccamenti nervosi al tronco cerebrale e il chiasma ottico sotto il cervello, usando il punto chiuso della pinna del pollice.
9. In modo simile, far scorrere la pinca chiusa anteriormente sotto il cervello e rompere gli attacchi ai bulbi olfattivi.
10. Il cervello può quindi essere lasciato cadere dal cranio in mezzo sterile.
11. Quando si raccoglie il cervello, una mano sarà considerata non sterilizzante in quanto afferra la pelle dal cranio riflessa sotto il mento per stabilizzare la testa, mentre il cranio viene tagliato e il cervello rimosso.
Pelle
1. Tessuto mammario
  1. Il tessuto mammario si trova dalla parte superiore dello sterno al manubrio all’apertura genitale sulla superficie ventrale e si estende lateralmente su entrambi i lati, quasi toccando la superficie dorsale ai fianchi e alle spalle.
  2. Esaminare il tessuto mammario per cercare masse, scolorimento o anomalie. Le femmine in allattamento o in gravidanza avranno un aumento del volume del tessuto mammario e il latte potrebbe essere presente.
  3. L’escissione delle ghiandole mammarie richiede di afferrare il bordo della ghiandola con una pinna per il pollice e l’uso di una dissezione smussata per allentare gli attaccamenti alla pelle. Una volta che la ghiandola è stata separata dalla pelle, le forbici dell’iride possono essere utilizzate per tagliare eventuali attacchi rimanenti.
  4. Immergere le superfici esposte con il 70% di alcol e iniziare la raccolta dei tessuti utilizzando una nuova serie di strumenti sterili.
  5. Il tessuto raccolto viene risciacquato con soluzione salina sterile prima di metterlo in terreno di coltura.
2. Tumori sottocutanei
  1. Spesso, le cellule tumorali vengono ripetutamente impiantate negli animali e quindi il tumore risultante viene raccolto per mantenere la linea cellulare del tumore.
  2. È imperativo che la raccolta di tessuti sterili di tumori sottocutanei venga eseguita prima della violazione dell’integrità della pelle.
  3. Se la massa è abrasa o è necrotica, il tessuto raccolto non sarà di buona qualità e potrebbe non essere sterile.
  4. Il corpo è posizionato per esporre l’area di interesse. La pelle viene tagliata lungo un lato del tumore.
  5. Riflettere attentamente la pelle per esporre il tumore. Posizionare gli strumenti della pelle di lato e immergere i tessuti esposti con il 70% di alcol.
  6. Con nuovi strumenti sterili, seziona la massa dagli attacchi sottostanti e seziona tutti i vasi sanguigni che alimentano la massa.
  7. Il tumore viene quindi posto nel terreno di coltura.

Molti esperimenti richiedono la raccolta di cellule dal tessuto asportato. In questi casi, è imperativo che la procedura di prelievo dei tessuti venga eseguita in modo sterile. L’uso di linee cellulari e colture di tessuti che provengono da animali da ricerca consente di condurre molti esperimenti in vitro,il che a sua volta riduce l’uso di animali nella ricerca.

In questo video, discuteremo il metodo asettico per il prelievo di organi comunemente estratti da animali da laboratorio. E questo sarà seguito da una breve rassegna di alcuni esperimenti di esempio che impiegano questa tecnica sterile per raggiungere diversi obiettivi di ricerca.

Iniziamo con i passaggi di preparazione necessari per garantire la sterilità dello spazio, degli strumenti e del personale durante la raccolta dei tessuti animali.

Questa procedura viene eseguita in una cappa a flusso laminare. Prima del processo, la ventola della cappa deve funzionare per almeno 15 minuti e l’area deve essere disinfettata con alcol al 70%. Quindi, posizionare alcuni asciugamani di carta nel cappuccio e bagnarli con etanolo al 70%. Successivamente, caricare l’attrezzatura sterile e organizzare in base all’ordine in cui verrà utilizzato ogni strumento, di solito da sinistra a destra. Ciò consente al flusso di lavoro di verificarsi in modo unidirezionale, prevenendo la contaminazione accidentale dalla carcassa animale.

Si raccomanda la presente di un tecnico non sterile per assistere il tecnico sterile. Entrambi gli operatori devono indossare una maschera e un bouffant. Il tecnico sterile deve indosso un camice sterile e due paia di guanti chirurgici sterili. Si noti che l’abito e i guanti devono coprire i polsi per prevenire lo spargimento di cellule della pelle nella cavità del corpo aperta, nelle piastre di Petri o nei mezzi sterili.

La persona non sterile apre il pacchetto di strumenti sterili senza toccare la superficie interna, in modo che la persona sterile possa rimuovere lo strumento in modo asettico. Infine, il tecnico non sterile eutanasizza l’animale, pone la carcassa sugli asciugamani di carta e la immerge completamente con alcol al 70%, in modo che la persona sterile possa iniziare la raccolta.

In primo luogo, esamineremo l’estrazione degli organi addominali, tra cui la milza, il fegato, i reni, le ovaie e i testicoli.

Usando una serie di forbici sterili e pinza fare un taglio orizzontale nella pelle appena anteriore al prepuzio nei maschi e l’osso pelvico nelle femmine. Evitare di tagliare la muscolatura addominale. Quindi, posiziona il pollice sotto il taglio e afferra il bordo cranico del taglio. Usando l’altra mano, tenere saldamente gli arti posteriori e la coda, mentre si tira la pelle verso la testa. La pelle si strappa via dal corpo appena sopra gli arti posteriori e può essere girata dentro e fuori sopra la testa e le zampe anteriori. Questo rimuove efficacemente i contaminanti dei capelli che potrebbero interferire con il prelievo di organi sterili. Quindi, immergere nuovamente il corpo con alcol al 70% e rimuovere il paio di guanti superficiali, che non sono più sterili. Scarta anche tutti gli strumenti che sono stati utilizzati sulla pelle.

Per raccogliere la milza, posizionare il corpo nella posizione laterale destra. La milza dovrebbe essere visibile attraverso il muscolo addominale. Usa le forbici per fare un taglio direttamente sopra la milza e ritrai delicatamente l’organo dalla cavità del corpo. Tagliare tutti gli attaccamenti tra la milza e lo stomaco e il tessuto pancreatico, ma evitare di perforare o strappare l’organo.

Per raccogliere tutti gli altri organi addominali, posizionare il corpo in reclinenza dorsale. Quindi, sollevare e tagliare via il muscolo addominale lasciando un’apertura ovale direttamente sopra la cavità addominale. Per raccogliere il fegato, riflettere l’organo caudale lontano dal diaframma. Ora usa le forbici per tagliare con cura eventuali membrane tra le due strutture. Quindi, fare un taglio perpendicolare alla colonna vertebrale attraverso i vasi sanguigni. Quindi sollevare il fegato e rifletterlo verso il diaframma per visualizzare gli allegati sottostanti. Ci saranno membrane sottili che attaccano i lobi epatici più piccoli allo stomaco e all’intestino tenue. Afferrare il nodo fibroso al centro del fegato sul lato inferiore e sollevare l’organo per trovare tutti gli allegati. Ora separa l’organo dai tessuti sottostanti. Si noti che il fegato è fragile e può essere facilmente perforato con conseguente eccessivo rilascio di sangue. Pertanto, deve essere maneggiato con attenzione.

Per raccogliere i reni, spingere l’intestino a sinistra per esporre il rene destro o a destra per esporre il rene sinistro. Ora usa le lame della pinza per afferrare sotto il rene e usando le forbici tagliate sotto la pinza, rimuovendo l’organo dal corpo.

Per raccogliere le ovaie, spostare l’intestino cranicamente per visualizzare l’utero. Seguire le corna uterine sinistra e destra fino alle ovaie. Questi sono piccoli organi e negli animali più anziani possono essere incastonati nel grasso. Far scorrere la pinca sotto l’ovaio per isolarla dal corpo e tagliarla libera dal grasso e dalla tuba di Falloppio.

Nei maschi, per rimuovere i testicoli, afferrare delicatamente il cuscinetto di grasso inguinale e tirare anteriormente. Questo tirerà il testicolo dallo scroto. Una volta che diventano visibili, taglia gli attacchi allo scroto e ai dotti deferenti per liberare queste strutture dal corpo.

Successivamente, impariamo come raccogliere organi toracici, come il cuore e i polmoni. Il cuore e i polmoni sono più facilmente rimossi insieme. Per aprire la cavità toracica, iniziare posizionando l’animale in reclinazione dorsale. In primo luogo, afferrare e sollevare il processo xifoide. Quindi fare un taglio attraverso il muscolo addominale appena caudale alle costole. Estendere il taglio lungo la curva inferiore della gabbia toracica su entrambi i lati, esponendo il diaframma.

Quindi, forare il diaframma facendo un piccolo taglio nella gabbia toracica nel punto più laterale possibile su ciascun lato. Quindi, tagliare il diaframma lontano dalle costole. Ora solleva le costole allo xifoide per visualizzare gli organi toracici. Estendere il taglio laterale fino alla parte superiore dello sterno su entrambi i lati per aprire il torace. Quindi posizionare la pinna perpendicolare alla trachea e afferrare saldamente la trachea. Ora, usando le forbici, fai un taglio perpendicolare appena anteriore alla pinza. Questo dovrebbe scidere la trachea e l’esofago. Senza allentare la presa sulla trachea, sollevarla caudale e snip eventuali attacchi dei polmoni alla superficie spinale nella gabbia toracica. Continuare fino a quando non si è in grado di sollevare il cuore e i polmoni liberi dalla cavità toracica.

Per rimuovere solo il cuore, sollevare l’organo e tagliare con cura il sacco pericardico. Quindi, tenere l’aorta con la pinica e fare un taglio distale alla pinca. Quindi recidere la vena cava anteriore, le arterie polmonari e le vene. Dopo di ciò, dovresti essere in grado di sollevare il cuore libero dalla cavità toracica.

Ora, rivediamo la procedura di raccolta del cervello usando la tecnica asettica. Nei casi in cui il cervello è l’unico organo da raccogliere, le fasi di preparazione sono le stesse.

Per iniziare il raccolto, saturare il corpo con l’alcol e rimuovere la pelle dal corpo come prima – su e sopra il cranio. Ciò consente che tutto sia sterile da questo punto in avanti. Quindi, saturare nuovamente l’animale con alcool, rimuovere i guanti esterni e scartare gli strumenti utilizzati sulla pelle. Ora fai un taglio alla nuca ed estendilo lungo la linea mediana dalla zona cervicale dorsale alla punta del naso.

Ora, usando un paio di forbici sterili per la raccolta del cervello, fai un taglio attraverso la colonna vertebrale alla base del cranio. Per aprire il cranio, posizionare la punta delle forbici nel foramene magnum e tagliare lungo la linea mediana. Si noti che durante questa procedura di raccolta del cervello, una mano è considerata non sterile in quanto afferra la pelle dal cranio riflessa sotto il mento per stabilizzare la testa, mentre la mano sterile viene utilizzata per tagliare il cranio. Successivamente, utilizzare il bordo piatto della lama a forbice per allontanare le ossa parietali dal cervello. E usando la spatola, interrompere attentamente gli attacchi nervosi al tronco cerebrale e il chiasma ottico sotto il cervello. Infine, far scorrere anteriormente la pinca chiusa e rompere gli attacchi alle lampadine olfattive. E il cervello può quindi essere lasciato cadere dal cranio direttamente nel mezzo sterile.

Ora che abbiamo esaminato gli elementi essenziali della raccolta di tessuti sterili, discutiamo alcuni dei molti usi di questa procedura nella ricerca biomedica.

I ricercatori di staminali neurali utilizzano la tecnica di raccolta sterile per estrarre il tessuto dal cervello neonatale del topo, per far crescere queste cellule in vitro. Ciò consente loro di studiare il ruolo delle cellule staminali neurali nello sviluppo e la progressione del cancro.

Un’altra area attiva di ricerca che coinvolge la raccolta dei tessuti è la profilazione metabolica, che comporta lo studio della fisiologia dei tessuti analizzando i diversi metaboliti in un campione. In questo esempio, gli scienziati, utilizzando la tecnica asettica, hanno raccolto biopsie epatiche da topi wild type e germ-free e hanno utilizzato la spettroscopia di risonanza magnetica nucleare, o NMR, per chiarire la differenza nel profilo metabolico epatico delle due popolazioni animali.

Infine, gli immunologi spesso eseguono la raccolta di tessuti sterili per studiare la diffusione dell’infezione. In questo particolare esperimento, i ricercatori hanno eseguito l’iniezione intratracheale di batteri Pseudomonas aeruginosa per indurre un’infezione polmonare cronica. Successivamente, gli animali sono stati sottoposti a eutanasia e i polmoni sono stati estratti utilizzando la tecnica asettica per determinare la carica batterica a 3, 7, 14 e 28 giorni dopo l’infezione.

Hai appena visto il video di JoVE sulla raccolta di tessuti da animali da laboratorio usando la tecnica asettica. Ora dovresti avere un’idea migliore dei passaggi che devi intraprendere per garantire che la sterilità sia mantenuta per tutto il raccolto. E dovresti essere in grado di estrarre gli organi addominali e toracici e il cervello da questi animali senza causare alcun danno al tessuto. Come sempre, grazie per aver guardato!

Applications and Summary

Sebbene molte delle procedure per il prelievo di organi sterili siano simili a un’autopsia standard, l’uso della tecnica sterile è imperativo affinché i tessuti siano di valore per le procedure sperimentali, che includono il prelievo di cellule dai tessuti asportati. La profilazione o la raccolta di RNA dai tessuti può essere compromessa se la sterilità non viene mantenuta.

Transcript

Many experiments demand collection of cells from the excised tissue. In such cases, it is imperative that the tissue harvest procedure be performed in a sterile manner. The use of cell lines and tissue cultures that originate from research animals allows for many experiments to be conducted in vitro, whichin turn reduces the animal usage in research.

In this video, we will discuss the aseptic method for harvest of commonly extracted organs from lab animals. And this will be followed by a short review of a few example experiments employing this sterile technique to achieve different research goals.

Let’s begin with the prepping steps required to ensure sterility of the space, instruments, and personnel during animal tissue harvest.

This procedure is performed in a laminar flow hood. Prior to the process, the hood fan should run for at least 15 minutes and the area should be disinfected with 70% alcohol. Next, place some paper towels into the hood and wet them with 70% ethanol. After that, load the sterile equipment and organize by the order in which each instrument will be used, usually from left to right. This allows for the workflow to occur in a unidirectional manner, preventing accidental contamination from the animal carcass.

It is recommended that a non-sterile technician be present to assist the sterile technician. Both operators must wear a mask and a bouffant. The sterile technician must don a sterile gown and two pairs of sterile surgical gloves. Note that the gown and gloves must cover the wrists to prevent the shedding of skin cells into the opened body cavity, petri dishes, or sterile media.

The non-sterile person opens the sterile instrument package without touching the inner surface, so that the sterile person can remove the tool aseptically. Lastly, the non-sterile technician euthanizes the animal, places the carcass on the paper towels and completely soaks it with 70% alcohol, so that the sterile person can begin the harvest.

First, we will review the extraction of abdominal organs, including the spleen, liver, kidneys, ovaries, and testes.

Using a set of sterile scissors and forceps make a horizontal cut in the skin just anterior to the prepuce in males and the pelvic bone in females. Avoid cutting through the abdominal musculature. Next, place your thumb under the cut and grasp the cranial edge of the cut. Using the other hand, securely hold the hind limbs and tail, while pulling the skin toward the head. The skin will tear away from the body just above the hind limbs, and can be turned inside out over the head and forelegs. This effectively removes hair contaminants that might interfere with the sterile organ harvest. Then, soak the body again with 70% alcohol and remove the superficial pair of gloves, which are no longer sterile. Also discard all the instruments that were used on the skin.

To harvest the spleen, position the body in right lateral recumbency. The spleen should be visible through the abdominal muscle. Use scissors to make a cut directly over the spleen, and gently retract the organ from the body cavity. Cut all the attachments between the spleen and the stomach and pancreatic tissue, but avoid puncturing or tearing the organ.

To harvest all other abdominal organs, place the body in dorsal recumbency. Then, lift and cut away the abdominal muscle leaving an oval opening directly over the abdominal cavity. To harvest the liver, reflect the organ caudally away from the diaphragm. Now use scissors to carefully sever any membranes between the two structures. Next, make a cut perpendicular to the spine through the blood vessels. Then lift the liver and reflect it toward the diaphragm to visualize the attachments beneath it. There will be thin membranes attaching the smaller liver lobes to the stomach and small intestine. Grasp the fibrous node in the center of the liver on the underside and lift the organ to find all the attachments. Now separate the organ from the underlying tissues. Note that the liver is fragile and can be easily punctured resulting in excessive release of blood. Therefore, it must be handled carefully.

To harvest the kidneys, push the intestines to the left to expose the right kidney or to the right to expose the left kidney. Now use the forceps blades to grasp beneath the kidney and using scissors cut under the forceps, removing the organ from the body.

To harvest the ovaries, move the intestines cranially to visualize the uterus. Follow the left and the right uterine horns to the ovaries. These are small organs and in older animals they may be imbedded in fat. Slide the forceps under the ovary to isolate it from the body and cut it free from the fat and the fallopian tube.

In males, to remove testes, gently grasp the inguinal fat pad and pull anteriorly. This will pull the testis from the scrotum. Once they become visible, cut the attachments to the scrotum and the vas deferens to free these structures from the body.

Next, let’s learn how to harvest thoracic organs, such as the heart and lungs. The heart and lungs are most easily removed together. To open the thoracic cavity, begin by placing the animal in dorsal recumbency. First, grasp and lift the xiphoid process. Then make a cut through the abdominal muscle just caudal to the ribs. Extend the cut along the lower curve of the rib cage on both sides, exposing the diaphragm.

Next, puncture the diaphragm by making a small cut in the rib cage at the most lateral point possible on each side. Then, cut the diaphragm away from the ribs. Now lift the ribs at the xiphoid to visualize the thoracic organs. Extend the lateral cut to the top of the sternum on both sides to open the chest. Then place the forceps perpendicular to the trachea and grasp the windpipe firmly. Now, using scissors, make a perpendicular cut just anterior to the forceps. This should sever the trachea and the esophagus. Without loosening the grip on the trachea, lift it up caudally and snip any attachments of the lungs to the spinal surface in the rib cage. Continue until you are able to lift the heart and lungs free of the chest cavity.

To remove just the heart, lift the organ and carefully cut through the pericardial sac. Next, hold the aorta with the forceps and make a cut distal to the forceps. Then sever the anterior vena cava, pulmonary arteries, and veins. After that, you should be able to lift the heart free of the thoracic cavity.

Now, let’s review the procedure of harvesting the brain using aseptic technique. In instances where the brain is the only organ to be collected, the prepping steps are the same.

To start the harvest, saturate the body with alcohol, and strip the skin from the body as before — up and over the skull. This allows for everything to be sterile from this point forward. Then, saturate the animal again with alcohol, remove the outer gloves and discard the instruments used on the skin. Now make a cut at the nape of the neck and extend it along the midline from the dorsal cervical area to the tip of the nose.

Now, using a dedicated pair of sterile brain harvest scissors, make a cut through the spine at the base of the skull. To open the cranium, place the point of the scissors in the foramen magnum and cut along the midline. Note that during this brain harvesting procedure, one hand is considered non-sterile as it grasps the skin from the skull reflected beneath the chin to stabilize the head, while the sterile hand is being used to cut the skull. After that, use the flat edge of the scissor blade to lever the parietal bones away from the brain. And using the spatula, carefully disrupt the nerve attachments at the brain stem and the optic chiasm beneath the brain. Lastly, slide the closed forceps anteriorly and break the attachments at the olfactory bulbs. And the brain can then be dropped from the skull directly into the sterile media.

Now that we’ve reviewed the essentials of sterile tissue harvest, let’s discuss some of the many uses of this procedure in biomedical research.

Neural stem researchers use sterile harvesting technique to extract tissue from mouse neonatal brain, to grow these cells in vitro. This allows them to study the role of neural stem cells in development, and cancer progression.

Another active area of research that involves tissue harvest is metabolic profiling, which involves studying tissue physiology by analyzing the different metabolites in a sample. In this example, scientists, using aseptic technique, collected liver biopsies from wild type and germ-free mice and used nuclear magnetic resonance spectroscopy, or NMR, to elucidate the difference in the liver metabolic profile of the two animal populations.

Lastly, immunologists often perform sterile tissue harvest to study the spread of infection. In this particular experiment, researchers performed intratracheal injection of bacteria Pseudomonas aeruginosa to induce chronic lung infection. Following that, animals were euthanized and lungs were extracted using aseptic technique to determine the bacterial load at 3, 7, 14, and 28 days post-infection.

You’ve just watched JoVE’s video on harvesting tissues from lab animals using aseptic technique. You should now have a better sense of the steps you need to take to ensure that sterility is maintained throughout the harvest. And you should be able to extract the abdominal and thoracic organs, and brains from these animals without causing any damage to the tissue. As always, thanks for watching!

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