Metodi di singola molecola per monitorare l'evoluzione a doppio strato: Proprietà meccaniche

Ciao, sono la dottoressa Ola Anderson del Dipartimento di Fisiologia e Biofisica del Weill Cornell Medical College di New York. Mi chiamo Olson. Sono uno studente di biomedicina computazionale nel laboratorio di Olive Anderson.

E io sono Shail Collingwood, tecnico di ricerca anch'io del laboratorio Anderson. Oggi vi mostreremo come formare un piano, uno strato bimolecolare, come isolare una piccola membrana utilizzando l'elettrodo a punzonatura dello strato bimolecolare (Biolayer Punch), come registrare l'attività di un singolo canale e come analizzare i risultati, utilizzando così i canali Gramin come sonde per studiare le proprietà dello strato lipidico B. In un video precedente, vi abbiamo mostrato come prepararvi per questi esperimenti.

Vi abbiamo mostrato come preparare la camera che utilizziamo e come preparare l'elettrodo per il bilayer punch, che impieghiamo per isolare il sottile strato di membrana nel quale registriamo l'attività del canale. Dunque, prepariamo alcuni bilayer. Per iniziare l'allestimento degli esperimenti sul bilayer, aggiungete 2,5 mil di soluzione elettrolitica equilibrata alla temperatura desiderata in ciascun compartimento della camera precedentemente rivestita. La soluzione che utilizziamo di solito è cloruro di sodio uno molare più dieci millimolari.

Pezzo di tampone regolato a pH 7; regolare il microscopio e la sorgente luminosa in modo che il foro nel teflon sia centrato nel campo visivo e ben illuminato. Inserire la micropipetta di vetro in un porta-microelettrodo. Collegare una siringa al porta-microelettrodo mediante un pezzo di tubo in tigon.

Riempire la pipetta nel porta-elettrodo mediante aspirazione. Prestare attenzione a evitare bolle d'aria, poiché potrebbero interrompere il collegamento elettrico tra il pellet di argento nel porta-elettrodo e la punta della pipetta. Applicare una piccola quantità di vaselina sulla vite, quindi inserirla nel porta-elettrodo microscopico.

La vaselina aiuta a creare una sigillatura ermetica. Inserire il supporto dell'elettrodo nel supporto per clampaggio della membrana all'interno della gabbia di Faraday. Posizionare la punta della micropipetta centrata e immediatamente dietro il foro nella partizione in teflon.

Posizionare l'elettrodo di argento arrotolato nella camera anteriore. Fissarlo in posizione con argilla modellabile e collegarlo al circuito del comando di tensione. Infine, bilanciare gli elettrodi.

Questo è fondamentale perché le due elettrodi, quella anteriore e quella nel portaelettrodi microscopico, possono avere potenziali di semicella leggermente diversi. Il potenziale di semicella è la differenza tra il metallo d'argento dell'elettrodo e la soluzione elettrolitica adiacente al rivestimento di cloruro d'argento. Bilanciare le elettrodi regolando l'offset manuale in modo che la corrente che fluisce tra i due compartimenti oscilli tra -200 e +200 picoampere sul registratore in configurazione patch clamp.

Il potenziale di offset cambierà nel tempo, quindi si bilanciano gli elettrodi a intervalli regolari durante l'esperimento per formare la membrana lipidica a doppio strato. Pulire una pipetta usata e lucidata a fiamma con la soluzione fch come descritto nel video allegato. Immergere la pipetta pulita nella soluzione lipidica e lasciare risalire il liquido di circa un millimetro all'interno della pipetta.

Posizionare la punta della pipetta appena davanti al foro nella partizione in Teflon e applicare delicatamente una bolla di soluzione lipidica sul foro. Quando l'operazione ha successo, si forma una bolla lipidica di colore brillante che attraversa il foro, con una struttura a forma di toro o di ciambella che la collega alla partizione in Teflon. Lasciare che la membrana si assottigli, processo che può essere agevolato applicando un potenziale di 100-200 millivolt attraverso la membrana.

Posizionare la punta della micropipetta di vetro nel Taurus e lasciarla riposare per alcuni minuti per garantire un migliore sigillo tra la pipetta e il doppio strato lipidico. A questo punto, si è pronti per isolare una porzione di membrana utilizzando una micropipetta di vetro. Ora aggiungere alla membrana il gramin.

Questa soluzione di gramina è stata preparata da un ceppo madre di un micromolare, diluito a uno-dieci nanomolari. In dimetilsolfossido, di solito da uno a dieci microlitri della diluizione vengono aggiunti a ciascun lato della membrana in modo che la concentrazione finale rientri nell'intervallo dei picomolari. Utilizzare le barrette magnetiche per agitare la soluzione per circa due minuti e attendere altri dieci minuti prima di formare una nuova piccola membrana per registrare l'attività dei singoli canali.

Questo tempo di pesatura permette l'incorporazione della gramicidina nella membrana. Verificare l'attività del canale applicando una tensione. In generale, si desidera circa un evento di canale al secondo.

I canali sono visibili come variazioni discrete verso l'alto e verso il basso della corrente di membrana. Ora sei pronto per iniziare l'esperimento vero e proprio. Per prima cosa, registra le tracce della corrente di controllo.

Bilanciare l'elettrodo come dimostrato in precedenza, formare una piccola membrana o una patch come descritto nel video allegato. Applicare 200 millivolt positivi e registrare l'attività del singolo canale. Si dovrebbero raccogliere da 100 a 200 transizioni della corrente del singolo canale.

Ripetere questo passaggio con -200 millivolt. Rompere la membrana espellendo l'elettrolita attraverso la punta della pipetta. Utilizzando la vite in nylon, riequilibrare gli elettrodi, ritirare la pipetta nella camera posteriore, espellere l'eccesso di lipidi e formare una nuova membrana.

È inoltre possibile ripetere questi passaggi per eseguire registrazioni a potenziali diversi. Ora siete pronti a registrare i tracciati della corrente sperimentale in presenza del modificatore del doppio strato lipidico. In questo caso, l'antidepressivo fluoxetina viene aggiunto a entrambi i lati della membrana.

La soluzione madre di fluoxetina deve essere diluita a 25 millimolare in DMSO. Aggiungere cinque microlitri di questa soluzione per ottenere una concentrazione di 50 micromolare nella camera. Il DMSO può influenzare le proprietà del doppio strato lipidico. Pertanto, è importante limitare la quantità di DMSO nella soluzione a 25 microlitri (1% o 150 millimolare).

Agitare per cinque minuti e attendere 10 minuti per consentire al modificatore di raggiungere l'equilibrio tra la soluzione acquosa e la membrana. A questo punto, registrare l'attività del canale come descritto in precedenza in presenza del modificatore. Ripetere questi passaggi per registrare l'attività del canale a concentrazioni crescenti del modificatore.

Impariamo molto sui cambiamenti nel doppio strato quantificando la durata dei canali e le loro frequenze di comparsa. Per effettuare un'analisi di questo tipo, dobbiamo rilevare la formazione e la scomparsa dei canali. Qui utilizziamo un algoritmo basato sulle transizioni, in cui il computer calcola la derivata prima per determinare le variazioni rapide della corrente e le contrassegna come eventi di canale.

Gli eventi sono memorizzati come una serie temporale per aiutarci a determinare la durata dei canali prima e dopo la transizione. I livelli di corrente sono anch'essi registrati e ci aiutano a determinare le ampiezze dei canali man mano che l'esperimento procede. Il computer costruisce un istogramma delle ampiezze delle transizioni di corrente, che consente di seguire l'acquisizione delle transizioni di corrente.

Permette inoltre di valutare la qualità dell'esperimento. Se le ampiezze di transizione attuali sono molto dispersi, ci sono problemi. Se l'istogramma è stretto, i risultati sono buoni.

Quando si sono accumulati più di 200 eventi di transizione, calcolare la corrente media e la deviazione standard per le transizioni nel picco principale. È possibile stimare semplicemente il tasso di comparsa del canale dividendo il numero di transizioni nell'istogramma dell'ampiezza di transizione per il tempo di osservazione. Ricordare di dividere anche per due, poiché un canale viene contato due volte nell'istogramma: una volta quando appare e una volta quando scompare.

Analizzare la serie temporale degli eventi di transizione per ottenere le distribuzioni della durata del canale. La determinazione delle durate è semplice nei tracciati di corrente in cui non è presente più di un canale conduttivo in qualsiasi momento. In questo caso, il computer rileva se ogni transizione corrisponde all'apparizione o alla scomparsa di un canale, e un evento di scomparsa può appartenere esclusivamente all'evento di apparizione precedente.

Il tempo tra le due transizioni corrisponde alla durata del canale. Nei casi in cui le transizioni del canale avvengono troppo vicine per essere distinte, è necessario assegnare manualmente le comparse e le scomparse. L'assegnazione risulta più complessa quando si hanno due o più canali che conducono contemporaneamente, poiché in questo caso non si sa a quale comparsa di canale appartiene una determinata scomparsa.

Per questo motivo, è preferibile avere un'attività del canale bassa. È possibile risolvere il problema dell'assegnazione utilizzando un generatore di numeri casuali per associare comparse a scomparse. In questo modo, si ottiene una serie di durate di vita del canale.

Questo viene convertito in un istogramma di durata, che a sua volta viene trasformato in un grafico di sopravvivenza, determinando la durata media mediante l'adattamento di una distribuzione esponenziale singola al grafico di sopravvivenza utilizzando un adattamento non lineare della curva ai minimi quadrati e esperimenti in cui la membrana grande non si rompe. Quando si aggiunge il modificatore del bicchierino lipidico, è possibile confrontare l'effetto sui tassi di comparsa del canale. Tale confronto non è giustificato se la membrana grande si rompe, poiché la funzione delle proteine di membrana è regolata dalla composizione lipidica della membrana cellulare.

Questa regolazione è dovuta a una combinazione di interazioni specifiche tra lipidi e proteine e a interazioni più generali tra il doppio strato lipidico e le proteine di membrana. Queste interazioni sono particolarmente importanti nella ricerca farmacologica. Poiché molti farmaci attualmente in commercio sono anfipatici e possono alterare le proprietà del doppio strato lipidico, il che a sua volta può portare a una modificata funzione delle proteine di membrana.

I canali Gramin possono essere utilizzati come trasduttori molecolari di forza per rilevare se gli anfifili possono alterare le proprietà del doppio strato lipidico. Riportare su un grafico le variazioni della durata e della frequenza di comparsa in funzione della concentrazione del modificatore fornisce informazioni sui cambiamenti delle proprietà del doppio strato.

Un aumento della frequenza indica che il doppio strato è più facilmente deformabile per ospitare il sito Gram e la dimerizzazione. Un aumento della durata indica che la deformazione del doppio strato associata alla formazione del canale non è energeticamente così onerosa. Un modificatore può aumentare frequenza e durata incrementando l'elasticità della membrana o influenzando la curvatura.

Ora abbiamo mostrato come utilizzare i canali cromogeni per verificare se le piccole molecole alterano le proprietà elastiche del doppio strato lipidico. E questo è tutto. Grazie per averci seguito.

In bocca al lupo per i tuoi esperimenti.