Name: Preparazione di doppi strati artificiali per esperimenti Elettrofisiologia (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2008-10-31T00:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 38 s
Description: Impara a preparare doppi strati lipidici planari per esperimenti di elettrofisiologia a canale singolo. Questo protocollo dettagliato mostra la configurazione della camera, la pulizia e la preparazione degli elettrodi.

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Gli autori non hanno nulla da dichiarare.

preparazione di doppi strati artificiali per esperimenti elettrofisiologia

Preparation of Artificial Bilayers for Electrophysiology Experiments

Doppi strati lipidici planari, detti anche doppi strati lipidici artificiali, consentono di studiare ioni conduttore canali in un ambiente ben definito. Questi doppi strati possono essere utilizzati per molti diversi studi, come ad esempio la caratterizzazione di membrana attiva peptidi, la ricostituzione dei canali ionici o indagini su come i cambiamenti nelle proprietà doppio strato lipidico alterare la funzione del doppio strato-spanning canali. Qui, ci mostrano come a formare un doppio strato planare e come isolare piccole macchie dal doppio strato, e in un secondo video dimostri anche una procedura per l&#39;utilizzo di canali gramicidina per determinare le variazioni delle proprietà elastiche doppio strato lipidico. Abbiamo anche dimostrare i singoli passi necessari per preparare la camera di doppio strato, gli elettrodi e come prova che il doppio strato è adatto per singolo canale misurazioni.

Doppi strati lipidici planari, detti anche doppi strati lipidici artificiali, consentono di studiare ioni conduttore canali in un ambiente ben definito. In questo studio dimostriamo i singoli passi necessari per preparare la camera di doppio strato, gli elettrodi e come prova che il doppio strato è adatto per singolo canale misurazioni.

Preparazione di doppi strati artificiali per esperimenti Elettrofisiologia

I doppi strati lipidici planari, denominati anche doppi strati lipidici artificiali, consentono di studiare i canali a conduzione ionica in un ambiente ben definito. Questi doppi strati possono...

Ciao, sono il dottor Olaf Anderson del Dipartimento di Fisiologia e Biofisica del Weill Cornell Medical College di New York City. Ciao, sono Ruchi Kaur, studentessa in medicina e dottorato nel laboratorio del dottor Olaf Anderson. Ciao, mi chiamo John Kim.Sono un tecnico di ricerca. Oggi vi mostreremo come prepararsi per esperimenti con canali singoli in bilayer lipidici semplici. Vi mostreremo come preparare la camera e come preparare gli elettrodi per il Bilayer Punch.Abbiamo usato per isolare le piccole aree della membrana in cui effettuiamo le misurazioni. Quindi cominciamo. Il nostro apparato elettrofisiologico è costituito da quanto segue: un tavolo antivibrazione sospeso in aria per minimizzare le vibrazioni meccaniche, una gabbia di Faraday per schermare rumori elettrici, suoni e vibrazioni, e un supporto.Per la camera a bistrato, utilizziamo un rivestimento a circolazione d'acqua per il controllo della temperatura in cui viene posizionata la camera a bistrato e un micromanipolatore per montare la testa del preamplificatore patch-clamp. Un'unità di filtraggio elettronico viene utilizzata per filtrare ulteriormente l'uscita del preamplificatore patch-clamp a 500 hertz. Per visualizzare le transizioni della corrente, viene utilizzato un oscilloscopio per mostrare il segnale di corrente, sia l'uscita del preamplificatore patch-clamp che quella del filtro elettronico.Per ultimo, ma non meno importante, avrete bisogno di un computer dotato di un sistema di acquisizione dati che digitalizzi il segnale della tecnica del patch clamp. A 20 chilohertz, utilizziamo un software sviluppato internamente per la registrazione e l'analisi dei dati. Tutti gli apparecchi vengono accesi 20 minuti prima di iniziare.Successivamente, prepareremo la camera in cui vengono eseguiti gli esperimenti. La camera è divisa in due metà da un setto, costituito da un sottile foglio di teflon, spesso circa 100 micron, riempito con una soluzione elettrolitica. Formiamo il doppio strato sulla perforazione nel setto, che permette la connessione tra le soluzioni elettrolitiche.Il foro deve avere un diametro compreso tra uno e 1,5 millimetri. Utilizzando la vaselina come sigillante, posizionare una finestra di vetro nella metà anteriore della camera in Teflon; inserire viti in acciaio inox attraverso una staffa metallica e i quattro fori nella metà posteriore della camera. Utilizzando la vaselina come sigillante, posizionare una partizione circolare in Teflon in modo che venga inserita tra le due metà della camera assemblata.Assicurarsi che il foro nella partizione sia centrato. Applicare vaselina su entrambi i lati della partizione per garantire che i compartimenti dell'elettrolita siano stagni e isolati elettricamente. Continuare a inserire le viti attraverso la metà anteriore della camera e la staffa metallica anteriore.Serrare l'assemblaggio per assicurarsi che tutti i componenti siano saldamente fissati, ma senza stringere eccessivamente, in modo da poter pulire la camera e rimuovere la vaselina. Una pipetta Pasteur viene fiammata, lucidata e piegata ad angolo retto. La lucidatura della pipetta fino a ottenere una punta liscia aiuta a evitare graffi sul vetro o sul teflon.Successivamente, pulire la camera con una miscela in rapporto 2:1 di cloroformio e metanolo o con soluzione FCH. Utilizzando la pipetta, rimuovere l'eccesso di vaselina con la soluzione FCH senza spargerla su tutta la superficie in teflon e vetro. Utilizzare almeno 10 volumi di FCH.Una volta completata questa operazione, si aggiungono barrette agitatrici magnetiche nelle camere. Successivamente, si pulisce la camera con etanolo al 95%. E infine con acqua ad alta purezza, acqua distillata, acqua UE o un equivalente.Come in precedenza, utilizzare una pipetta con estremità arrotondata a fiamma per aspirare il liquido. Infine, ripetere la pulizia con etanolo FCH e acqua. Quindi acqua, etanolo e fol.Ora prepareremo la micropipetta in vetro per l'elettrodo, che servirà come connessione elettrica al compartimento posteriore della camera. Utilizzando un micropipettatore P-97 Flaming/Brown della Sutter Instruments, si tira il capillare di vetro per ottenere due micropipette, ciascuna con una punta affilata e un restringimento breve. Utilizziamo capillari in vetro borosilicato con un diametro esterno di 0,8 millimetri e un diametro interno di 0,5 millimetri. Un capillare di vetro viene inserito nel polarizzatore e fissato in preparazione per il tiro del filamento.Il polarizzatore deve essere in platino poiché non abbiamo ottenuto successo. Non è riuscita la preparazione delle pipette nei polarizzatori per elettrodi con filamenti di tungsteno; i prossimi passaggi verranno eseguiti in un microforno con un filamento di platino. Prima di utilizzare il microforno, è necessario accertarsi che il filamento sia ben ricoperto di vetro.È possibile utilizzare un vetro molle al sodio-calcio oppure un vetro borosilicato più duro. È necessario regolare il calore del microfornello in modo che il vetro scorra uniformemente e ricopra il filamento con uno strato sottile e omogeneo. Posizionare ora la micropipetta nel microfornello e rompere la punta.Lo facciamo ammorbidendo delicatamente il rivestimento di vetro sul filamento con un calore relativamente basso. Successivamente si avvicina delicatamente la punta della micropipetta al rivestimento di vetro sul filamento, in modo che i due materiali si fondano insieme; quindi si spegne il calore sul filamento, che si ritrae e provoca la rottura della pipetta. Ora rimane un'apertura affilata e regolare di circa 30 micron di diametro.Di nuovo, utilizzando il microfornello, creare una curvatura ad angolo retto nella micropipetta a tre-quattro millimetri dalla punta, posizionare la pipetta alcune centinaia di micron sopra il filamento e quindi accendere il riscaldamento in modo che il filamento diventi rosso. Il filamento si sposterà a causa dell'espansione termica. Successivamente, abbassare delicatamente la pipetta sul filamento e il filamento si piegherà.Si controlla la quantità di curvatura mediante la temperatura del filamento. Quando la curvatura raggiunge circa 80 gradi, si sposta rapidamente la pipetta verso l'alto e in avanti. Questa manovra richiede una certa coordinazione.Si desidera ottenere una curvatura di 90 gradi utilizzando le stesse impostazioni. Riscaldare leggermente la punta della micropipetta per lucidarla, mantenendo il filamento ricoperto di vetro. Ora silanizziamo la punta della pipetta con una soluzione al 10% di triottilsilene in benzene.Questo rende la superficie della pipetta idrofobica, in modo che interagisca bene con la membrana. Lasciare risalire la soluzione di alcuni millimetri all'interno della pipetta per azione capillare. Far evaporare la soluzione utilizzando il microfornello a bassa temperatura e il procedimento è completato.Ora vi mostreremo come preparare l'elettrodo di argento. Prendete un pezzo di filo di argento lungo cinque centimetri e con un diametro di circa un millimetro. Arrotolatelo da tre a quattro volte a formare una spirale con un diametro interno di due-tre millimetri.Mantenere il resto come una coda che si piegherà in modo da formare un angolo retto con l'elica. Rivestire la coda e i cinque-dieci millimetri adiacenti del filo d'argento con cloruro d'argento fuso. Preparare ora la soluzione per la formazione del bilayer.Nel nostro caso, il lipide dial fosfatidilcolina si trova nell'endecano. Il lipide è conservato in provette di vetro a meno 40 gradi Celsius sotto forma di aliquote da 150 microlitri di lipide e cloroformio. Prelevare una provetta dal congelatore, lasciarla raggiungere la temperatura ambiente ed evaporare il cloroformio sotto un getto di azoto secco.In una cappa chimica, aggiungere 50 microlitri di decano terminale ed eseguire un vortex. Per ottenere un buon contatto tra la soluzione formante il doppio strato e il Teflon che circonda il foro sul quale formiamo il doppio strato, ritinteggiamo la partizione in Teflon intorno al foro. Innanzitutto, pulire una pipetta Pasteur lucidata a fuoco con fch.Quindi immergere la pipetta pulita nel 2,5% di fosfolipidi in decano terminale, lasciando salire il lipide di circa un millimetro all'interno della pipetta. Depositare una goccia di lipide sotto forma di film sulla cavità nella partizione in Teflon. Lasciare asciugare il lipide per circa 10-15 minuti e ripetere l'operazione. Ciao.Oggi vi abbiamo mostrato come preparare bilayer lipidici per esperimenti su canali singoli. Nel video allegato, vi mostreremo come isolare piccole porzioni di membrana, come registrare l'attività di canali singoli, come modificare l'attività mediante molecole piccole e come analizzare i risultati. Ok, questo è tutto.Grazie per aver guardato. Buona fortuna con il tuo esperimento.

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Supportati doppi strati planari sono strumenti potenti che possono essere utilizzati per modellare le interazioni molecolari in una sinapsi immunologica. Qui vi mostriamo i metodi per l'ancoraggio delle proteine ​​di adesione cellulare conosciuto per modulare la formazione di sinapsi il foglio superiore della bilyer lipidi e visualizzare formazione di sinapsi usando la microscopia TIRF.

Supportato bilayers Planar per la formazione degli Studi di sinapsi immunologica e Kinapse

Funzione di proteine ​​della membrana è regolata dalla composizione lipidica della membrana cellulare. Questo video-articolo i dettagli come formare una patch usando elettrodi cerotto doppio strato, così come il modo di utilizzare i canali gramicidina come reporter di proprietà della membrana alterata.

Metodi di singola molecola per monitorare l&#39;evoluzione a doppio strato: Proprietà meccaniche

Procedure per la ricostituzione completa di un canale del potassio voltaggio-dipendenti prototipo nelle membrane lipidiche sono descritti. I canali ricostituiti sono adatti per saggi biochimici, registrazioni elettriche, screening ligando e studi cristallografici di elettroni. Questi metodi possono avere applicazioni generali agli studi strutturali e funzionali di altre proteine ​​di membrana.

La ricostituzione di un canale Kv in membrane lipidiche per gli studi strutturali e funzionali

Canali meccanosensibili batteriche possono essere usati come trasduttori mechanoelectrical nei dispositivi biomolecolari. Bistrati interfaccia Droplet (DIB), cellula di ispirazione blocchi di costruzione di tali dispositivi, rappresentano nuove piattaforme per incorporare e stimolare canali meccanosensibili. Qui, dimostriamo un nuovo metodo basato micropipetta-di formare DIB, permettendo lo studio di canali meccanosensibili sotto stimolazione meccanica.

Multifunzionale, Metodo Micropipetta-based per la Costituzione e la stimolazione della batteriche meccanosensibili Ion Canali in Droplet Interface bilayers

Abbiamo dimostrato un, trasportabile sistema di formazione doppio strato lipidico memorizzabili. Una membrana a doppio strato lipidico possono essere formate entro 1 ora con tasso di successo superiore all'80% quando un precursore membrana congelato è portato a temperatura ambiente. Questo sistema consentirà di ridurre i processi laboriosi e competenze associate a canali ionici.

Formazione automatizzato doppio strato lipidico della membrana Utilizzando un Polidimetilsilossano Thin Film

Qui, presentiamo un protocollo per la formazione di lipidici utilizzando un metodo di doppio strato di contatto bolla. Una bolla di acqua è soffiata in un solvente organico, per cui un monostrato è formato all'interfaccia acqua-olio. Due pipette sono manipolati per ancorare le bolle per formare un doppio strato.

Esperimenti di Bilayer del lipido con contatto bolla lipidici per Patch-affrancate

Morbido, bassa potenza, biomolecolari memristors sfruttare simile composizione, struttura e meccanismi di bio-sinapsi di commutazione. Presentato qui è un protocollo da assemblare e caratterizzazione biomolecolare memristors ottenuto da isolante lipidici formate tra le goccioline di acqua in olio. L'incorporazione di tensione-attivato alameticina risultati di peptidi in memristive conduttanza ionica attraverso la membrana.

Assemblaggio e caratterizzazione biomolecolare Memristors costituito da membrane lipidiche drogato con scanalatura dello ione

Questo protocollo descrive in dettaglio l'uso di un sistema di riscaldamento a temperatura controllata a retroazione per promuovere l'assemblaggio monostrato lipidico e la formazione di bistrati di interfaccia a goccia per lipidi con temperature di fusione elevate e misurazioni della capacità per caratterizzare i cambiamenti guidati dalla temperatura nella membrana.

Assemblaggio a temperatura controllata e caratterizzazione di un bistrato di interfaccia a goccia

Questo protocollo descrive la formazione di vescicole unilipidiche e multilipidiche, doppi strati lipidici supportati e doppi strati lipidici sospesi. Questi modelli in vitro possono essere adattati per incorporare una varietà di tipi di lipidi e possono essere utilizzati per studiare varie interazioni molecolari e macromolecole.

Assemblaggio di modelli di doppio strato lipidico supportati e sospesi per lo studio delle interazioni molecolari

Qui viene presentato un protocollo per eseguire e analizzare il legame, la mobilità e l'assemblaggio di singole molecole su membrane lipidiche affollate artificiali utilizzando la microscopia a fluorescenza a riflessione interna totale a singola molecola (smTIRF).

Diffusione e assemblaggio di singole molecole su membrane lipidiche affollate di polimeri

Viene presentato un protocollo sperimentale per assemblare, stimolare elettricamente e analizzare i bilayer di interfaccia gocce dopate con gramicidina A. Le relazioni struttura-funzione lipido-proteina sono quantificate misurando le variazioni nell'area della membrana, nel flusso ionico e nella conduttanza a canale singolo, e collegando queste risposte a cambiamenti simili alla plasticità nella conduzione ionica in un modello di membrana ispirato alle sinapsi elettriche.

Caratterizzazione della struttura e funzione della membrana lipido-proteina utilizzando i bistrati dell'interfaccia delle gocce

Impara a preparare doppi strati lipidici planari per esperimenti di elettrofisiologia a canale singolo. Questo protocollo dettagliato mostra la configurazione della camera, la pulizia e la preparazione degli elettrodi.

Preparazione di doppi strati artificiali per esperimenti Elettrofisiologia

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