6: Imaging a fluorescenza nel vicino-infrarosso di aneurismi dell'aorta addominale

La seguente procedura fornisce i passaggi dettagliati necessari per raccogliere immagini NIRF in vivo ed ex vivo da piccoli animali:

1. Configurazione sperimentale

1. Collegare una sorgente luminosa in fibra ottica al sistema di imaging a fluorescenza utilizzando una guida luminosa in fibra ottica.
2. Selezionare il filtro di eccitazione appropriato per l'esperimento. Il filtro di eccitazione determina la lunghezza d'onda della luce da consegnare al campione e deve essere scelto per corrispondere allo spettro di eccitazione del fluoroforo introdotto nel campione.
3. Selezionare il filtro di emissione appropriato. Il filtro di emissione blocca i componenti spettrali indesiderati, che possono essere attribuiti all'autofluorescenza, e dovrebbe essere scelto per corrispondere allo spettro di emissione del fluoroforo.

2. Preparazione del campione

1. In vivo
   1. Anestetizzare l'animale in una camera di induzione utilizzando isoflurano ad una concentrazione del 3-4% sul quadrante del flussometro.
   2. Trasferire l'animale in un cono nasale fissato nella fase di imaging e mantenere l'isoflurano ad una concentrazione dell'1-2%. Una fonte di calore non è necessaria perché gli animali vengono in genere ripresi solo per un breve periodo di tempo (> 5 minuti) e la loro temperatura corporea non diminuisce sostanzialmente.
   3. Proteggi le zampe dell'animale per ridurre al minimo gli artefatti di movimento. Rimuovere i capelli dalla regione di interesse applicando una crema depilatoria.
   4. Applicare la crema depilatoria sulla più piccola area necessaria. Dopo 30 s, pulirlo con una garza. Pulire l'area una seconda volta con un tampone di garza inumidito con alcool etilico per rimuovere completamente la crema depilatoria.
   5. Applicare unguento oftalmico agli occhi per prevenire l'essiccazione delle cornee.
   6. Iniettare la sonda molecolare fluorescente attivabile nell'animale. Per questa specifica applicazione, le sonde attivabili MMP2 sono state iniettate per via endovenosa nella vena della coda. A questo punto, il mouse può essere ripreso. Procedere alla "Acquisizione immagini" di questo protocollo per continuare. Monitorare l'animale per una respirazione regolare durante la breve procedura.
2. Ex Vivo
   1. Dopo l'iniezione della sonda fluorescente, l'eutanasia dell'animale in modo umano secondo le linee guida AVMA del 2013 per l'eutanasia degli animali. L'overdose di anidride carbonica (CO₂₎è una pratica standard per l'eutanasia di piccoli animali.
   2. Estrarre chirurgicamente il tessuto o l'organo di interesse e rimuovere con cura il tessuto adiposo in eccesso con una pinza.
   3. Risciacquare il tessuto in soluzione salina tamponata con fosfato per rimuovere il sangue residuo e posizionare il campione direttamente sulla fase di imaging.

3. Acquisizione di immagini

1. Aprire il software di imaging molecolare e accendere sia la sorgente luminosa a fibra ottica che il sistema di imaging a fluorescenza.
2. Aprire la finestra di acquisizione e specificare il tipo di esposizione appropriato per lo studio. Le esposizioni disponibili includono: Esposizione standard per acquisire una singola immagine, Esposizione time lapse per acquisire una serie di immagini in un intervallo di tempo fisso ed Esposizione progressiva per acquisire una sequenza continua di esposizioni in tempi di esposizione diversi.
3. Selezionare Transilluminazione UV come fonte di illuminazione.
4. Utilizzando l'immagine in anteprima come riferimento, regolare la messa a fuoco dell'obiettivo, il campo visivo e l'f-stop/apertura nella camera del sistema di acquisizione per ottimizzare la qualità dell'immagine campionata. Regolare il tempo di esposizione e la posizione del campione.
5. Chiudere la finestra di anteprima e assicurarsi che tutti i parametri nella finestra di acquisizione corrispondano alle impostazioni della fotocamera e del filtro.
6. Fai clic su'Esponi'per acquisire e salvare l'immagine.
7. Il software di imaging molecolare standard fornisce in genere una varietà di strumenti analitici, di misurazione e di correzione delle immagini per quantificare i segnali di fluorescenza per l'analisi delle immagini.
8. Al termine della sessione di imaging, rimuovere il campione/animale, spegnere il sistema e pulire lo stadio di imaging per ridurre al minimo i danni al sistema.

L'imaging a fluorescenza nel vicino infrarosso è una tecnica ottica che utilizza sonde fluorescenti per visualizzare complessi assemblaggi biomolecolari nei tessuti. Questa tecnica di imaging non invasiva, nota anche come NIRF, è rapida e non richiede radiazioni ionizzanti.

Nella NIRF, le sonde fluorescenti possono essere coniugate con piccole molecole per una maggiore specificità per studiare il cancro e la progressione delle malattie cardiovascolari. Sono eccitati dalla luce del vicino infrarosso che penetra in profondità nei tessuti e possono essere utilizzati per delineare il tessuto sano dal tessuto malato che altera la concentrazione di queste molecole bersaglio.

Questo video illustrerà i principi alla base dell'imaging a fluorescenza nel vicino infrarosso e come eseguire esperimenti in vivo ed ex vivo in piccoli animali per studiare una varietà di malattie.

Come suggerisce il nome, l'imaging a fluorescenza nel vicino infrarosso utilizza la luce all'interno della prima finestra nel vicino infrarosso che varia da 650 nanometri a 900 nanometri per fornire fotoni nei tessuti. Le molecole fluorescenti specifiche per il bersaglio, chiamate fluorofori, vengono in genere introdotte in un animale attraverso l'ingegneria genetica o l'iniezione prima dell'imaging.

Questi fluorofori assorbono l'energia dei fotoni che aumenta l'energia delle molecole dallo stato fondamentale S0 allo stato eccitato instabile S1 primo. Poiché questo stato è instabile, le molecole si rilasseranno al livello di energia vibrazionale più basso all'interno dello stato eccitato rilasciando la loro energia sotto forma di calore. I fluorofori, ora nello stato eccitato rilassato S1, ritornano quindi allo stato fondamentale, emettendo luce di una specifica lunghezza d'onda.

Questa luce ha una lunghezza d'onda più lunga rispetto alla luce originariamente introdotta nel fluoroforo a causa dell'energia che si dissipa sotto forma di calore quando la molecola si rilassa al livello di energia vibrazionale più basso. La luce emessa viene quindi catturata e registrata utilizzando un sistema di imaging a fluorescenza.

Un grafico degli spettri di assorbimento ed emissione per il fluoroforo mostra la gamma di lunghezze d'onda che il fluoroforo può assorbire ed emettere rispettivamente. Questo spostamento fondamentale, che è la differenza in nanometri tra le lunghezze d'onda di picco di assorbimento e di picco di emissione, è chiamato spostamento di Stokes. Ogni fluoroforo ha uno spostamento di Stokes distinto che consente di distinguere la luce di emissione dalla luce eccitante e rende possibili tecniche di imaging come la NIRF.

Dopo aver esaminato i principi fondamentali dell'imaging a fluorescenza nel vicino infrarosso, esaminiamo ora la procedura passo dopo passo per preparare e visualizzare un animale.

Innanzitutto, utilizzare una guida di luce a fibre ottiche per collegare una sorgente di luce a fibre ottiche al sistema di imaging a fluorescenza. Selezionare il filtro di eccitazione che corrisponde allo spettro di eccitazione della fluorescenza da introdurre nel campione per garantire che venga erogata la corretta lunghezza d'onda della luce.

Quindi, selezionare il filtro di emissione appropriato in modo che corrisponda allo spettro di emissione del fluoroforo che bloccherà le componenti spettrali indesiderate che possono essere attribuite all'autofluorescenza.

Per iniziare la preparazione per l'imaging in vivo, utilizzare l'isoflurano per anestetizzare l'animale in una camera di abbattimento. Trasferire l'animale su un cono di muso fissato sul tavolino di imaging. Fissa le zampe dell'animale per ridurre al minimo gli artefatti di movimento. Applicare una crema depilatoria per rimuovere i peli dalla zona di interesse. Quindi, applica un unguento oftalmico sugli occhi dell'animale per evitare che le cornee si secchino.

Successivamente, iniettare la sonda molecolare fluorescente attivabile nell'animale. Per iniziare l'acquisizione dell'immagine, aprire il software di imaging molecolare. Accendere sia la sorgente luminosa a fibre ottiche che il sistema di imaging a fluorescenza.

Successivamente, aprire la finestra di acquisizione e specificare il tipo di esposizione appropriata per lo studio. Le esposizioni disponibili includono l'esposizione standard per acquisire una singola immagine, l'esposizione time lapse per acquisire una serie di immagini in un intervallo di tempo fisso e l'esposizione progressiva per acquisire una sequenza continua di esposizioni a diversi tempi di esposizione.

Quindi, selezionare UV Transillumination come sorgente di illuminazione. Utilizzando l'immagine di anteprima come riferimento, regolare la messa a fuoco, il campo visivo e l'F-stop nella camera del sistema di acquisizione per ottimizzare la qualità dell'immagine campionata. Regolare il tempo di esposizione e la posizione del campione secondo necessità. Successivamente, chiudi la finestra di anteprima. Assicurarsi che tutti i parametri nella finestra di acquisizione corrispondano alle impostazioni della fotocamera e del filtro. Fare clic su "Espone" per acquisire e salvare l'immagine.

Per prepararsi all'imaging ex vivo, sopprimere l'animale in modo umano dopo l'iniezione della sonda fluorescente. Usando una pinza, rimuovere con cura il grasso periaortico in eccesso. Successivamente, estrai chirurgicamente il tessuto o l'organo di interesse. Sciacquare il tessuto in soluzione salina tamponata con fosfato per rimuovere il sangue residuo. Quindi, posizionare il campione direttamente sul tavolino di imaging.

Visualizzare il tessuto ex vivo seguendo lo stesso protocollo descritto per l'imaging in vivo. Al termine, rimuovere il campione dal tavolino. Spegnere il sistema e pulire la fase di imaging.

Ora che abbiamo completato il protocollo per ottenere immagini di campo nel vicino infrarosso, esaminiamo i risultati di queste scansioni.

In queste immagini rappresentative, una sonda fluorescente attivabile viene iniettata sistemicamente attraverso la vena caudale per visualizzare la metalloproteinasi della matrice o MMP2. Qui vediamo un'immagine NIRF in vivo di un topo carente di apolipoproteina E che ha sviluppato un aneurisma dell'aorta addominale dopo l'infusione di angiotensina II. Mentre la maggior parte delle piccole macchie ad alto segnale provengono dall'autofluorescenza cutanea, il sistema vascolare si presenta visivamente come strutture tubolari con alti segnali fluorescenti.

La seconda immagine rappresentativa confronta le immagini NIRF degli aneurismi dell'aorta addominale da due diversi modelli animali. Uno, un aneurisma dell'aorta addominale surrenale in un topo carente di apolipoproteina-E infusa con angiotensina II. E due, un aneurisma dell'aorta addominale infrarenale in un ratto infuso con elastasi pancreatica suina.

In ciascuno di essi, vediamo un aumento dell'attività di MMP2 nella regione aneurismatica dell'aorta addominale. Le sonde fluorescenti in eccesso vengono filtrate e accumulate nei reni, spiegando i segnali fluorescenti luminosi osservati lì.

Diamo ora un'occhiata ad alcune altre applicazioni dell'imaging di campo nel vicino infrarosso. In primo luogo, l'imaging NIRF può essere utilizzato per studiare le malattie cardiovascolari in modelli murini.

In questo studio, i topi knockout vengono iniettati con due diverse sonde fluorescenti nel vicino infrarosso. Le aorte vengono prelevate 24 ore dopo e valutate tramite imaging NIRF. I risultati mostrano una significativa risposta NIRF, indicando la presenza di un'estesa calcificazione che co-localizza con l'accumulo di macrofagi.

L'imaging NIRF può essere utilizzato anche per localizzare e valutare i tumori in vivo. In questo studio, vengono creati fantocci di tessuto che simulano il seno contenenti inclusioni fluorescenti che simulano il tumore. Vengono quindi simulate le applicazioni dell'imaging NIRF durante la chirurgia conservativa del seno.

I risultati mostrano che le inclusioni tumorali sono rilevabili dal NIRF fino a una profondità di circa due centimetri. Le inclusioni più profonde di questa sono rilevabili dopo che le incisioni sono state praticate nel tessuto fantasma sovrapposto. Dopo che le inclusioni sono state rimosse, il chirurgo valuta le immagini NIRF. L'eventuale fluorescenza residua, che indica la presenza di tumori, indica una rimozione incompleta e viene quindi asportata.

Hai appena visto l'introduzione di JoVE all'imaging nel vicino infrarosso. A questo punto è necessario comprendere i principi dell'eccitazione e dell'emissione dei fluorofori, come preparare un animale per l'imaging NIRF in vivo ed ex vivo e alcune applicazioni biomediche. Grazie per l'attenzione!