Question 1

Perché la SEM è migliore della microscopia ottica per l'imaging di campioni biologici?

Accepted Answer

SEM raggiunge una risoluzione fino a 0,5 nanometri, rispetto al limite di 200 nanometri della microscopia ottica. Questa risoluzione superiore deriva dalla lunghezza d'onda di 1 nanometro del fascio di elettroni rispetto alla lunghezza d'onda di 500 nanometri della luce visibile. Il SEM fornisce anche una maggiore profondità di campo, rendendolo ideale per visualizzare strutture biologiche tridimensionali e nanostrutture che i microscopi ottici non possono risolvere chiaramente.

Question 2

Cosa succede quando un fascio di elettroni colpisce un campione biologico nel SEM?

Accepted Answer

Il fascio di elettroni causa due tipi di emissioni di elettroni: elettroni secondari ed elettroni retrodiffusi. Gli elettroni secondari sono elettroni a bassa energia emessi dalla superficie del campione, fornendo informazioni topografiche sulla struttura. Gli elettroni retrodiffusi si riflettono all'opposto del fascio incidente e aumentano di intensità con il peso atomico, consentendo l'analisi compositiva e distinguendo le differenze dei materiali.

Question 3

Perché i campioni biologici devono essere essiccati prima dell'imaging SEM?

Accepted Answer

SEM opera in un ambiente di alto vuoto, che è incompatibile con l'alto contenuto d'acqua dei campioni biologici. L'acqua evapora rapidamente nel vuoto, causando il collasso delle strutture del campione, specialmente nelle cellule delicate. I campioni sono trattati con fissativi, risciacquati e lentamente disidratati utilizzando concentrazioni crescenti di etanolo per preservare la struttura nativa rimuovendo l'acqua.

Question 4

Cos'è il rivestimento per sputtering e perché è necessario per l'imaging SEM?

Accepted Answer

Il rivestimento tramite sputtering deposita uno strato sottile di metallo, tipicamente oro di quattro-sei nanometri di spessore, sui campioni biologici. Poiché i materiali biologici non sono conduttivi, questo rivestimento metallico previene l'accumulo di carica dal fascio di elettroni, che distorcerebbe le immagini. La superficie conduttiva permette una rilevazione accurata degli elettroni e migliora la qualità dell'immagine durante l'analisi SEM.

Question 5

Come differisce l'SEM ambientale dall'SEM convenzionale per l'imaging di campioni sensibili?

Accepted Answer

L'Environmental SEM (ESEM) mantiene un ambiente gassoso nella camera del campione, permettendo l'imaging di campioni bagnati o non ricoperti senza necessità di essiccazione. Due aperture separano la camera della pistola elettronica ad alto vuoto dalla camera del campione. Sebbene le molecole di gas disperdano il fascio elettronico, l'energia del fascio rimane sufficiente per l'imaging, preservando strutture cellulari non collassate e consentendo la visualizzazione di campioni biologici idratati.

Question 6

Quali passaggi di preparazione sono critici per l'imaging di strutture biologiche delicate come i tessuti vegetali?

Accepted Answer

I tessuti delicati richiedono la fissazione con soluzioni come formalina/acido acetico per stabilizzare la struttura. I tessuti vengono poi sezionati in etanolo, posti in contenitori a maglie e disidratati attraverso una serie di etanolo al 70%, 80%, 90% e 100%. Infine, l'essiccazione a punto critico rimuove il solvente rimanente senza causare collasso, seguita da un rivestimento per spruzzatura con metallo prima dell'imaging SEM.

Question 7

Quali informazioni può rivelare il SEM sui materiali biologici che altre tecniche non possono?

Accepted Answer

SEM rivela strutture tridimensionali porose con caratteristiche fibrose più piccole di 25 micron, che sono difficili da visualizzare con imaging di campioni biologici con microscopia ottica e confocale a causa della profondità di campo limitata. La SEM fornisce anche dettagli topografici, composizione elementare e informazioni sulla cristallinità attraverso l'analisi degli elettroni secondari e retrodiffusi, consentendo una caratterizzazione completa delle nano e microstrutture.

Imaging di campioni biologici con microscopio elettronico a scansione (SEM) - Quiz di valutazione