Fonte: Perchet Thibaut1,2,3, Meunier Sylvain1,2,3, Sophie Novault4, Rachel Golub1,2,3
1 Unità di Linfopoiesi, Dipartimento di Immunologia, Istituto Pasteur, Parigi, Francia
2 INSERM U1223, Parigi, Francia
3 Université Paris Diderot, Sorbonne Paris Cité, Cellule Pasteur, Parigi, Francia
4 Platfrom, Citometria a flusso e biomarcatori UtechS, Center for Translational Science, Pasteur Institute, Parigi, Francia
La funzione generale del sistema immunitario è quella di difendere il corpo da organismi infettivi e altri invasori. I globuli bianchi, o leucociti, sono i giocatori chiave del sistema immunitario. Al momento dell’infezione, vengono attivati e iniziano una risposta immunitaria. I leucociti possono essere suddivisi in varie sotto-popolazioni (ad esempio, cellule mieloidi, linfociti, cellule dendritiche) in base a diversi parametri che possono essere biologici, fisici e / o funzionali (ad esempio, dimensioni, granularità e secrezione). Un modo per caratterizzare i leucociti è attraverso le loro proteine di superficie, che sono principalmente recettori. Ogni popolazione di leucociti esprime una specifica combinazione di recettori (ad esempio, recettori citotossici, attivanti, di migrazione) che possono definire sottoinsiemi tra le popolazioni. Poiché il sistema immunitario comprende una vasta gamma di popolazioni cellulari, è essenziale caratterizzarle per decifrare la loro partecipazione alla risposta immunitaria.
La citometria a flusso (FC o FCM) è un metodo ampiamente utilizzato per analizzare l’espressione della superficie cellulare e delle molecole intracellulari, caratterizzando e definendo diversi tipi di cellule in una miscela cellulare eterogenea. I citometri a flusso sono composti da tre sottosistemi principali: fluidica, ottica ed elettronica. Il sistema fluidico trasporta le cellule in un flusso tale che passano davanti a un laser una per una. Il sistema ottico è costituito da sorgenti luminose (laser) per illuminare le particelle, filtri ottici per dirigere la luce risultante e segnali fluorescenti verso rilevatori appropriati. Infine, il sistema elettronico converte i segnali luminosi rilevati in segnali elettronici che possono essere elaborati dal computer. Quando una singola cellula passa davanti al raggio laser, disperde la luce. Un rilevatore davanti al fascio misura la diffusione in avanti (FS) e diversi rilevatori per misurare lateralmente la diffusione laterale (SC). La FS è correlata alla dimensione delle cellule e sc è proporzionale alla granularità delle cellule. In questo modo, le popolazioni cellulari possono spesso essere distinte in base alle differenze nelle loro dimensioni e granularità da sole.
Oltre ad analizzare le dimensioni, la forma e la complessità di una cellula, la citometria a flusso è ampiamente utilizzata per rilevare l’espressione dei recettori di superficie cellulare (1). Ciò si ottiene utilizzando anticorpi monoclonali marcati con fluorocromo che si legano a recettori cellulari specifici noti. Dopo l’eccitazione, questi fluorocromi legati emettono una luce di lunghezza d’onda specifica, chiamata lunghezza d’onda di emissione, che può essere rilevata e valutata. Le misurazioni di fluorescenza forniscono dati quantitativi e qualitativi sui recettori di superficie cellulare etichettati con fluorocromo. Gli ematologi sono stati i primi a utilizzare FC per il follow-up terapeutico delle popolazioni di cellule immunitarie (2). Ora, viene utilizzato per una vasta gamma di applicazioni come l’immunofenotipizzazione, la vitalità cellulare, l’espressione genica, il conteggio cellulare e l’analisi GFP.
FACS (Fluorescent Activated Cell Sorter) è un tipo specializzato di citometria a flusso, che ordina una popolazione di cellule in sottopopolazione utilizzando l’etichettatura fluorescente. Proprio come la citometria a flusso convenzionale, vengono raccolti i primi dati FS, SC e fluorescenti. Quindi, la macchina applica una carica (negativa o positiva) e un sistema di deflessione elettrostatica (elettromagneti) facilita la raccolta di goccioline cariche contenenti celle in tubi appropriati.
Figura 1: Rappresentazione schematica di FACS. Il campione (1) viene aspirato nel FACS (2) e passato davanti al laser (3). La fluorescenza cellulare viene percepita dai rivelatori a fluorescenza (4). Infine, le cellule sono incorporate in goccioline e le cellule di interesse vengono deviate da piastre di deflessione (5) e raccolte in un tubo di raccolta (6). Le celle rimanenti vanno nel cestino (7). Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
L’aspetto dello smistamento del FACS presenta molti vantaggi. Molti test possono aiutare a capire il ruolo di cellule specifiche nel sistema immunitario, come le analisi dell’espressione genica come RT-qPCR, ciclo cellulare o secrezione di citochine. Tuttavia, le cellule dovrebbero essere purificate a monte per ottenere risultati chiari e specifici. Qui, FACS è utile e le cellule desiderate possono essere ordinate con grande purezza, ottenendo risultati altamente affidabili e riproducibili. FACS può anche essere utilizzato per ordinare le cellule in base alla colorazione nucleare o ad altre colorazioni intracellulari e in base alla presenza, all’assenza e alla densità dei recettori di superficie. FACS è ora una tecnica standard per la purificazione di sottopopolazioni di cellule e ha la capacità di ordinare fino a quattro popolazioni contemporaneamente.
Questo esercizio di laboratorio dimostra come isolare i leucociti splenici e quindi come ordinare specificamente le cellule linfoidi B dalla miscela di cellule leucocitarie spleniche usando FACS.
1. Preparazione
2. Dissezione
3. Isolamento delle cellule immunitarie
4. Colorazione cellulare
Tabella 1: Composizione della miscela di anticorpi. Sei miscele di 200μL di anticorpi HBSS + sono state preparate per l’esperimento. Il mix 1 è per l’impostazione PMT, i mix da 2 a 5 sono per le impostazioni di compensazione e il mix 6 è per l’ordinamento delle celle.
5. Calibrazione FACS
6. Citometria a flusso e controllo della purezza
7. Analisi dei dati
Il sistema immunitario protegge il corpo dall’invasione di agenti patogeni generando leucociti, chiamati anche globuli bianchi. Quando un agente patogeno infetta con successo un organismo, viene attivata un’ampia varietà di leucociti e questa reazione coordinata è chiamata risposta immunitaria.
Spesso, è utile per i ricercatori essere in grado di identificare il tipo specifico e il numero di cellule immunitarie che sono state attivate in risposta a un agente patogeno. La citometria a flusso è una tecnica che consente ai ricercatori di separare le cellule in base a specifici epitopi espressi sulle loro superfici. Ciò si ottiene utilizzando anticorpi monoclonali marcati con fluorocromo che si legano a epitopi specifici delle cellule immunitarie noti e, dopo l’eccitazione, questi fluorocromi legati emettono una lunghezza d’onda della luce che può essere rilevata e segnata da un citometro a flusso.
I citometri a flusso sono composti da tre sistemi. Il sistema fluidico trasporta le cellule in un flusso tale che passano davanti a un laser una per una. Il sistema ottico è composto da laser e rivelatori che riconoscono la presenza o l’assenza dei fluorofori. Infine, il sistema elettronico converte i dati ottici raccolti in file elettronici per l’analisi.
Un’estensione della citometria a flusso è il Fluorescence-Activated Cell Sorter, o FACS, che consente l’arricchimento di specifiche popolazioni cellulari in modo che possano essere studiate in modo indipendente. Lo smistamento cellulare viene effettuato utilizzando un ugello vibrante all’interno del flusso fluidico che forma micro goccioline, ciascuna contenente una singola cella. Quindi, un rilevatore determina se la luce fluorescente viene emessa o meno da ciascuna goccia e, in base a tali informazioni, un elettromagnete dà a ciascuna cella una carica negativa o positiva. Successivamente, un forte campo elettrico ordina le goccioline diversamente cariche in contenitori separati. In definitiva, uno dei contenitori conterrà una popolazione omogenea di cellule basata sull’espressione di una specifica molecola di superficie cellulare.
In questo video, imparerai come utilizzare la citometria a flusso per isolare i leucociti dal tessuto della milza del topo e FACS per selezionare i linfociti B.
Per iniziare, indossare guanti da laboratorio e gli indumenti protettivi appropriati. Quindi, lavare un paio di forbici e pinza da dissezione prima con detergente e poi con etanolo al 70% e quindi asciugarli con un tovagliolo di carta pulito.
Quindi, aggiungere 49 millilitri di Hank’s Balanced Salt Solution, o HBSS, a un tubo da 50 millilitri. Aggiungere un millilitro di siero fetale per vitelli, o FCS, per creare una soluzione HBSS 2% FCS e mescolare delicatamente il pipettaggio su e giù circa 10 volte.
Quindi, posizionare un topo eutanasizzato in posizione supina su una piastra di dissezione. Con le forbici e la pinza, eseguire una laparotomia longitudinale per accedere alla cavità addominale. Utilizzare la pinza per spostare l’intestino sul lato destro dell’addome su un lato per esporre lo stomaco e la milza. La milza è attaccata allo stomaco. Quindi, con una pipetta, posizionare cinque millilitri di HBSS 2% FCS in una capsula di Petri. Usando la pinza, staccare con cura la milza dallo stomaco e posizionare la milza nella capsula di Petri.
Per isolare le cellule immunitarie, prima posizionare la milza su un colino cellulare da 40 micron in una capsula di Petri. Schiacciare la milza con uno stantuffo per dissociarla nel piatto. Quindi, pipettare la milza dissociata e il fluido dalla capsula di Petri in un tubo di centrifuga da 15 millilitri. Centrifugare il tubo a 370 volte g per sette minuti a 10 gradi Celsius e poi recuperare il tubo con attenzione in modo da non disturbare il pellet.
Ora, rimuovere il surnatante, evitando il pellet, e scartare il liquido in un contenitore di rifiuti appropriato. Quindi, aggiungere due millilitri di tampone di lisi ACK nel tubo della centrifuga per ricasospendare e lisi gli eritrociti. Attendere due minuti e quindi aggiungere HBSS 2% FCS per ottenere un volume totale di 15 millilitri. Ripetere la centrifugazione. Recuperare il tubo con attenzione ed scartare il surnatante. Rispendare nuovamente il pellet in cinque millilitri di HBSS 2% FCS.
Per contare le cellule riconsocie, diluire cinque microlitri della sospensione cellulare con cinque microlitri di Trypan Blue. Quindi, depositare delicatamente una goccia di cinque microliti di questa sospensione cellulare diluita tra il vetro di copertura e il vetrino Malassez. Ora, al microscopio con ingrandimento 40X, conta il numero di cellule presenti. Quindi, regolare la concentrazione cellulare a 10 a settima cella per millilitro aggiungendo il volume appropriato di HBSS 2% FCS.
Per macchiare le cellule immunitarie, iniziare etichettando sei tubi FACS da uno a sei. Quindi, trasferire 200 microlitri della soluzione cellulare in ciascuno dei sei tubi. Centrifugare questi tubi a 370 volte g per sette minuti a 10 gradi Celsius e rimuovere il surnatante.
Quindi, etichettare sei nuovi tubi FACS da uno a sei e pipettare 200 microlitri di HBSS 2% FCS in ciascuno. Preparare le sei nuove miscele di anticorpi aggiungendo la quantità appropriata di anticorpi a ciascun tubo secondo la tabella uno. Mix one è per cellule non macchiate senza aggiunta di anticorpi. Le miscele da due a cinque contengono ciascuna un singolo anticorpo diverso per le impostazioni di compensazione. Mix six contiene tutti e quattro gli anticorpi per le cellule multi-colorate da utilizzare per lo smistamento.
Quindi, trasferire queste miscele di anticorpi ai corrispondenti tubi FACS numerate. Incubare queste soluzioni per 20 minuti a quattro gradi Celsius o sul ghiaccio al buio. Quindi, aggiungere un millilitro di HBSS 2% FCS a ciascun tubo e quindi centrifugare di nuovo. Scartare il surnatante e quindi ricaspenare il pellet in 200 microlitri di HBSS 2% FCS. Infine, trasferire i pellet riconsospenati in nuovi tubi FACS etichettati.
Per eseguire FACS, accendere prima il sorter. Quindi, selezionare il menu del citometro e fare clic su avvio fluidico. Seguire le istruzioni visualizzate sullo schermo.
Nella scheda del flusso, fai clic sulla croce rossa per accendere il flusso, quindi attendi 15 minuti affinché il flusso si stabilizzi. Regola l’ampiezza del flusso fino a quando non viene visualizzata una chiara goccia staccata nella scheda del flusso. Quindi, fai clic su sweet spot per completare la regolazione dell’ampiezza. Inserire il filtro Neutral Density, o ND, 1.0 davanti al laser.
Apri il menu del citometro nella parte superiore dello schermo e seleziona CST, che sta per Cytometer Setup and Tracking. Per eseguire il controllo di qualità giornaliero, prima diluire le perle CST con il mezzo FACS in un tubo FACS seguendo le istruzioni del produttore. Quindi, caricare il tubo nella macchina ed eseguire il controllo CST facendo clic su Esegui nella scheda CST.
Al termine del controllo CST, sostituire il filtro ND 1.0 con il filtro ND 2.0 sul citometro. Quindi, diluire le perline di ritardo della caduta nel mezzo FACS seguendo le istruzioni del produttore e quindi caricare il tubo nel FACS. Per garantire un corretto smistamento, eseguire il ritardo di caduta facendo prima clic sulla tensione e quindi sul filtro ottico. Il quadrante destro del filtro ottico deve essere uguale al 100%, indicando che il 100% delle gocce sono registrate dalla macchina. Se necessario, regolare la vite laser rossa sul citometro a sinistra oa destra per ottenere il 100% nel quadrante destro. È importante assicurarsi che il flusso cada nel tubo di raccolta. Per fare ciò, eseguire un test sort facendo clic su waste drawer e quindi test sort. Controllare che i flussi laterali cadano nei tubi di raccolta. In caso contrario, regolare la tensione sotto la scheda di ordinamento fino a quando non lo fanno.
Passare al modello sperimentale selezionando la scheda del browser e facendo clic su visualizzazione condivisa. Quindi, apri l’esperimento delay Accudrop_DROP e fai clic sul pulsante di ordinamento del layout. Ora, modifica la velocità di soglia sul dashboard di acquisizione manipolando la portata fino a raggiungere 3.000 eventi al secondo. Fare clic su tensione e quindi su filtro ottico. Il quadrante sinistro deve essere uguale a zero e il quadrante destro uguale a 100.
Infine, nella finestra di ordinamento del layout, fare clic su Ordina e quindi su Annulla. Il quadrante sinistro deve essere uguale a 100 e il quadrante destro uguale a zero. Se il quadrante sinistro è inferiore a 95, fare clic su Ritardo automatico per indicare al software di aumentare automaticamente la tensione per ottenere il 100% delle cadute nel quadrante sinistro.
Per iniziare la citometria a flusso, utilizzeremo prima le cellule non macchiate per definire la morfologia cellulare e i picchi negativi dei fluorocromi. Per fare ciò, posizionare il tubo uno contenente celle non macchiate nella macchina e sotto la scheda del cruscotto di acquisizione fare clic su Load. Nella scheda citometro, regolare le tensioni di dispersione avanti e laterale fino a quando non si vede la popolazione cellulare come una densa concentrazione di punti sullo schermo. I linfociti sono piccole cellule, quindi avranno una bassa dispersione in avanti e una bassa dispersione laterale.
Quindi, rimuovere la fluorescenza di fondo regolando la tensione per i fluorocromi nella scheda del citometro fino a quando le popolazioni cellulari a un livello negativo sono nel primo decennio nella scheda del foglio di lavoro globale. Nel menu del citometro, fare clic su Visualizza configurazione e verificare che tutti i fluorocromi siano presenti. Quindi, posizionare il tubo due nel citometro e fare clic sul carico. Regolare la sovrapposizione spettrale nella scheda del citometro fino a quando le mediane di popolazione negative e positive non sono allineate nella scheda del foglio di lavoro globale. Nella scheda acquisizione impostare il parametro di registrazione degli eventi su 10.000 e fare clic su Record. Ripeti questi passaggi con i tubi tre, quattro e cinque.
Successivamente, caricare il tubo sei che contiene le celle multi-macchiate. Per isolare i linfociti B, impostare prima i parametri per ordinare le cellule in base alla loro morfologia. Nella prima finestra, tracciate l’area di dispersione in avanti FSC-A sull’asse y e l’area di dispersione laterale SSC-A sull’asse x. Nel grafico a dispersione, ogni punto rappresenta una cella. Fare clic su polygon gate nel foglio di lavoro globale e quindi selezionare la popolazione con una dispersione in avanti bassa e una dispersione laterale intermedia. In una nuova finestra di dot plot, fare clic con il pulsante destro del mouse sulla finestra e selezionare Mostra popolazioni dal menu e fare clic su P1.
Quindi, nella nuova finestra, gate le celle CD45 positive vitali tracciando la vitalità sull’asse y e CD45 sull’asse x. Utilizzare il gate poligonale per circondare le celle con una bassa vitalità e un segnale CD45 elevato e selezionare P2 per visualizzare le celle selezionate in una nuova finestra. Nella finestra successiva, cancello per i leucociti CD45 positivi, esclusi i linfociti T. Con CD45 sull’asse x e CD3 sull’asse y, circondare la popolazione con un segnale CD45 elevato e un segnale CD3 negativo basso e selezionare P3. Infine, gate per le cellule CD19 positive che identificano i linfociti B. Con CD19 sull’asse y e CD3 sull’asse x, circondare la popolazione con un segnale CD19 alto e un segnale CD3 basso negativo e selezionare P4.
Tutti i parametri di ordinamento sono ora impostati. Successivamente, nella finestra del layout di ordinamento, selezionare la popolazione cellulare di interesse- P4, che è la quarta popolazione che è stata chiusa, e dice alla macchina di ordinare solo i linfociti B. Imposta gli eventi target su 10.000 celle e imposta la precisione sulla purezza. Stiamo smistando solo una popolazione. Tuttavia, è possibile ordinare fino a quattro diverse popolazioni contemporaneamente. Una volta pronto, fare clic su Ordina e OK. Quindi, attendere l’ordinamento delle celle.
Una volta completata la selezione delle celle, eseguire un controllo di purezza pipettando 10 microlitri delle celle smisate in un nuovo tubo FACS con 90 microlitri di HBSS 2% FCS. Posizionare il tubo nel citometro, fare clic su carica e quindi fare clic su Registra per analizzare i fenotipi delle cellule per verificare che la strategia di gating abbia funzionato come previsto.
Ora, analizzeremo le cellule ordinate per determinare la percentuale di linfociti B tra i leucociti che sono stati isolati dalla milza del topo. Per iniziare, fai doppio clic sull’icona FlowJo e trascina i file per ogni tubo nella finestra di tutti i campioni.
Fare clic su poligono e ricreare le strategie di gating utilizzate nella sezione precedente. Quindi, fare clic su Editor layout e trascinare le popolazioni di linfociti B di interesse dal tubo sei e il controllo di purezza nella scheda editor di layout. Appariranno dot plot che rappresentano i linfociti B. In questo esempio, il grafico in alto a destra rappresenta i linfociti B ordinati dalla sospensione totale delle cellule della milza e il grafico in basso a destra è il controllo della purezza. Le cellule dovrebbero apparire solo nella popolazione di interesse nel controllo della purezza.
Per verificare la purezza dei linfociti B nelle cellule ordinate, fare clic sull’editor della tabella. Trascinare la popolazione di linfociti B dal tubo sei e il controllo della purezza nella tabella. Nel menu statistico, selezionare la frequenza delle cellule CD45 positive per testare la purezza di questa popolazione cellulare. Quindi, fai clic su Crea tabella. I valori dei parametri vengono visualizzati in una nuova tabella. Nella finestra di controllo della purezza, controllare la frequenza dei linfociti B all’interno delle cellule CD45 positive, che dovrebbe essere superiore al 98%.
In questo protocollo, abbiamo purificato i linfociti B splenici utilizzando la tecnologia FACS. Per prima cosa abbiamo isolato i leucociti dalla milza e li abbiamo macchiati. Utilizzando una combinazione di marcatori di superficie delle celle B, abbiamo creato una strategia di gating per ordinarli (Figura 2, pannello superiore). Alla fine dell’esperimento abbiamo verificato se le cellule nella provetta di raccolta erano cellule B tramite un “test di purezza”. Abbiamo mantenuto la stessa strategia di gating e abbiamo osservato che oltre il 98% delle cellule erano effettivamente cellule B (Figura 2, pannello inferiore). Pertanto, FACS è un protocollo efficace per isolare le popolazioni di cellule immunitarie con un alto grado di purezza. Le cellule raccolte possono quindi essere utilizzate per esperimenti a valle come colture cellulari, RT-qPCR e saggi di citotossicità.
Figura 2: Strategia di Gating e test di purezza post-ordinamento. (A) Le cellule sono state prima recintate in base alla loro morfologia (a sinistra: FSC-A, SSC-A), poi solo vive (al centro a sinistra: vitalità, CD45), le cellule CD45+ (CD45, CD3) sono state tracciate contro CD19 e CD3. Solo le celle CD19+ sono state ordinate. (B) Risultati della prova di purezza di una frazione di cellule ottenuta dopo la cernita cellulare. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
La citometria a flusso è una tecnica di prima mano per caratterizzare e ordinare le popolazioni di cellule immunitarie con un alto grado di purezza. È uno strumento primordiale in campo di ricerca in quanto consente l’arricchimento di specifiche popolazioni cellulari e di decifrare la risposta immunitaria ai patogeni. Con l’aumento del numero di fluorocromi e citometri disponibili, il numero di parametri rilevabili è notevolmente aumentato. Di conseguenza, l’analisi bioinformatica dei dati FACS ha iniziato ad emergere e ha aperto nuovi orizzonti alla citometria a flusso (3). La citometria a flusso offre altre applicazioni in ematologia e oncologia (4) dove viene utilizzata per lo sviluppo di strumenti diagnostici.
The immune system protects the body from invading pathogens by generating leukocytes, also called white blood cells. When a pathogen successfully infects an organism, a wide variety of leukocytes are activated and this coordinated reaction is called an immune response.
Frequently, it is useful for researchers to be able to identify the specific type and number of immune cells that have been activated in response to a pathogen. Flow cytometry is a technique that allows researchers to separate cells based on specific epitopes expressed on their surfaces. This is accomplished using fluorochrome-tagged monoclonal antibodies which bind to known immune cell specific epitopes, and upon excitation, these bound fluorochromes emit a wavelength of light which can be detected and scored by a flow cytometer.
Flow cytometers are composed of three systems. The fluidic system transports cells in a stream such that they pass in front of a laser one by one. The optical system is composed of lasers and detectors which recognize the presence or absence of the fluorophores. Finally, the electronic system converts the collected optical data into electronic files for analysis.
An extension of flow cytometry is the Fluorescence-Activated Cell Sorter, or FACS, which allows for the enrichment of specific cell populations so they can be studied independently. Cell sorting is accomplished using a vibrating nozzle within the fluidics stream which forms micro droplets, each containing a single cell. Then, a detector determines whether or not fluorescent light is being emitted from each droplet, and based on that information, an electromagnet gives each cell a negative or positive charge. Next, a strong electric field sorts the differently charged droplets into separate containers. Ultimately, one of the containers will contain a homogenous population of cells based on the expression of a specific cell surface molecule.
In this video, you will learn how to use flow cytometry to isolate leukocytes from mouse spleen tissue and FACS to select for B lymphocytes.
To begin, put on laboratory gloves and the appropriate protective clothing. Next, wash a pair of dissecting scissors and forceps first with detergent and then with 70% ethanol and then dry them with a clean paper towel.
Then, add 49 milliliters of Hank’s Balanced Salt Solution, or HBSS, to a 50 milliliter tube. Add one milliliter of Fetal Calf Serum, or FCS, to create an HBSS 2% FCS solution and mix by gently pipetting up and down approximately 10 times.
Next, place a euthanized mouse in the supine position on a dissection plate. With the scissors and forceps, perform a longitudinal laparotomy to access the abdominal cavity. Use the forceps to move the intestines on the right side of the abdomen to one side to expose the stomach and spleen. The spleen is attached to the stomach. Then, with a pipette, place five milliliters of the HBSS 2% FCS into a Petri dish. Using forceps, carefully detach the spleen from the stomach and place the spleen into the Petri dish.
To isolate the immune cells, first place the spleen on a 40 micron cell strainer in a Petri dish. Crush the spleen with a plunger to dissociate it into the dish. Then, pipette the dissociated spleen and fluid from the Petri dish into a 15 milliliter centrifuge tube. Centrifuge the tube at 370 times g for seven minutes at 10 degrees Celsius and then retrieve the tube carefully so as not to disturb the pellet.
Now, remove the supernatant, avoiding the pellet, and discard the liquid in an appropriate waste container. Then, add two milliliters of ACK lysing buffer into the centrifuge tube to resuspend and lyse the erythrocytes. Wait two minutes and then add HBSS 2% FCS to obtain a total volume of 15 milliliters. Repeat the centrifugation. Retrieve the tube carefully and discard the supernatant. Resuspend the pellet again in five milliliters of HBSS 2% FCS.
To count the resuspended cells, dilute five microliters of the cell suspension with five microliters of Trypan Blue. Then, gently deposit a five microliter drop of this diluted cell suspension between the coverglass and the Malassez slide. Now, under a microscope at 40X magnification, count the number of cells present. Then, adjust the cell concentration to 10 to the seventh cells per milliliter by adding the appropriate volume of HBSS 2% FCS.
To stain the immune cells, start by labeling six FACS tubes from one to six. Then, transfer 200 microliters of the cell solution into each of the six tubes. Centrifuge these tubes at 370 times g for seven minutes at 10 degrees Celsius and remove the supernatant.
Then, label six new FACS tubes as one through six and pipette 200 microliters of HBSS 2% FCS into each. Prepare the six novel antibody mixes by adding the appropriate amount of antibody to each tube according to table one. Mix one is for unstained cells with no addition of antibody. Mixes two through five each contain a different single antibody for compensation settings. Mix six contains all four antibodies for multi-stained cells to be used for sorting.
Next, transfer these antibody mixes to the corresponding numbered FACS tubes. Incubate these solutions for 20 minutes at four degrees Celsius or on ice in the dark. Next, add one milliliter of HBSS 2% FCS to each tube and then centrifuge again. Discard the supernatant and then resuspend the pellets in 200 microliters of HBSS 2% FCS. Finally, transfer the resuspended pellets to new labeled FACS tubes.
To perform FACS, first turn on the sorter. Then, select the cytometer menu and click fluidics startup. Follow the instructions on the screen.
On the stream tab, click on the red cross to turn on the stream and then wait 15 minutes for the stream to stabilize. Adjust the amplitude of the stream until you see a clear detached drop appear on the stream tab. Then, click sweet spot to complete the amplitude adjustment. Insert the Neutral Density, or ND, filter 1.0 in front of the laser.
Open the cytometer menu at the top of the screen and select CST, which stands for Cytometer Setup and Tracking. To perform daily quality control, first dilute CST beads with FACS medium in a FACS tube following the manufacturer’s instructions. Then, load the tube into the machine and perform the CST control by clicking run on the CST tab.
When the CST control is complete, replace the ND 1.0 filter with the ND 2.0 filter on the cytometer. Next, dilute drop delay beads in FACS medium following the manufacturer’s instructions and then load the tube into the FACS. To ensure proper sorting, perform drop delay by first clicking voltage and then optical filter. The right quadrant of the optical filter should be equal to 100%, indicating that 100% of the drops are registered by the machine. If necessary, adjust the red laser screw on the cytometer left or right to obtain 100% in the right quadrant. It is important to ensure that the stream falls into the collection tube. To do so, perform a test sort by clicking on waste drawer and then test sort. Check that the side streams fall into the collection tubes. If they do not, adjust the voltage under the sorting tab until they do.
Navigate to the experimental template by selecting the browser tab and clicking shared view. Then, open the Accudrop_DROP DELAY experiment and click the sorting layout button. Now, change the threshold rate on the acquisition dashboard by manipulating the flow rate until it reaches 3,000 events per second. Click voltage and then click optical filter. The left quadrant should be equal to zero and right quadrant equal to 100.
Finally, in the sort layout window, click sort and then click cancel. The left quadrant should be equal to 100 and the right quadrant equal to zero. If the left quadrant is less than 95, click auto delay to instruct the software to automatically increase the voltage to obtain 100% of the drops in the left quadrant.
To begin flow cytometry, we will first use unstained cells to define the cell morphology and the negative peaks of the fluorochromes. To do so, place tube one containing unstained cells in the machine and under the acquisition dashboard tab click load. In the cytometer tab, adjust the forward and side scatter voltages until you see your cell population as a dense concentration of dots on the screen. Lymphocytes are small cells, so they will have a low forward scatter and low side scatter.
Next, remove background fluorescence by adjusting the voltage for the fluorochromes in the cytometer tab until the cell populations at a negative level are in the first decade in the global worksheet tab. In the cytometer menu, click on view configuration and verify that all of the fluorochromes are present. Next, place tube two in the cytometer and click load. Adjust the spectral overlap in the cytometer tab until the negative and positive population medians are aligned in the global worksheet tab. On the acquisition tab, set the events to record parameter to 10,000 and click record. Repeat these steps with tubes three, four, and five.
Next, load tube six which contains the multi-stained cells. To isolate B lymphocytes, first set up the parameters to sort the cells based on their morphology. In the first window, plot FSC-A forward scatter area on the y-axis and SSC-A side scatter area on the x-axis. In the scatter plot, each dot represents a cell. Click on polygon gate on the global worksheet and then select the population with a low forward scatter and an intermediate side scatter. On a new dot plot window, right-click on the window and select show populations from the menu and click P1.
Then, in the new window, gate the viable CD45 positive cells by plotting viability on the y-axis and CD45 on the x-axis. Use polygon gate to circle the cells with a low viability and high CD45 signal and select P2 to display the selected cells in a new window. In the next window, gate for CD45 positive leukocytes, excluding T lymphocytes. With CD45 on the x-axis and CD3 on the y-axis, circle the population with a high CD45 signal and low negative CD3 signal and select P3. Finally, gate for CD19 positive cells which identify the B lymphocytes. With CD19 on the y-axis and CD3 on the x-axis, circle the population with a high CD19 signal and a low negative CD3 signal and select P4.
All the sorting parameters are now set. Next, in the sorting layout window, select your cell population of interest- P4, which is the fourth population that was gated, and tells the machine to only sort B lymphocytes. Set target events to 10,000 cells and set precision to purity. We are only sorting one population. However, up to four different populations can be sorted at the same time. Once ready, click sort and OK. Then, wait for cell sorting.
Once cell sorting is complete, perform a purity control by pipetting 10 microliters of the sorted cells into a new FACS tube with 90 microliters of HBSS 2% FCS. Place the tube in the cytometer, click load and then click record to analyze the phenotypes of the cells to verify that the gating strategy worked as intended.
Now, we will analyze the sorted cells to determine the percentage of B lymphocytes among the leukocytes that were isolated from the mouse spleen. To start, double click on the FlowJo icon and drag the files for each tube into the all sample window.
Click on polygon and recreate the gating strategies that were used in the previous section. Next, click layout editor and drag the B lymphocyte populations of interest from tube six and the purity control into the layout editor tab. Dot plots representing B lymphocytes will appear. In this example, the plot on the top right represents the sorted B lymphocytes from the total spleen cell suspension and the plot on the bottom right is the purity control. Cells should only appear in the population of interest in the purity control.
To check the purity of B lymphocytes in the sorted cells, click on table editor. Drag the B lymphocyte population from tube six and purity control in the table. On the statistic menu, select frequency of CD45 positive cells to test the purity of this cell population. Then, click on create table. Parameter values appear in a new table. In the purity control window, check the frequency of B lymphocytes within the CD45 positive cells, which should be higher than 98%.
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