Citometria a flusso e selezione cellulare attivata dalla fluorescenza (FACS): isolamento dei linfociti B della milza

1. Preparazione

1. Prima di iniziare, indossare guanti da laboratorio e gli indumenti protettivi appropriati.
2. Sterilizzare tutti gli strumenti di dissezione, prima con un detergente e poi con etanolo al 70% e poi asciugare accuratamente.
3. Preparare 50 ml di soluzione salina bilanciata di Hank (HBSS) contenente il 2% di siero fetale di vitello (FCS).

2. Dissezione

1. Utilizzando un sistema di rilascio di anidride carbonica, eutanasizzare il topo per ipossia. Fissare il topo eutanasizzato su una piastra di dissezione in posizione supina ed eseguire una laparotomia longitudinale usando forbici e pinza.
2. Usando la pinza, spostare l'intestino e lo stomaco sul lato destro dell'addome per esporre lo stomaco e la milza. La milza è attaccata allo stomaco.
3. Usando la pinza, staccare con cura la milza dallo stomaco e metterla nella capsula di Petri contenente 5 ml di HBSS 2% FCS.

3. Isolamento delle cellule immunitarie

1. Posizionare la milza in un colino cellulare da 40μm sulla stessa capsula di Petri. Schiacciare la milza con uno stantuffo per dissociarla nello stesso piatto.
2. Trasferire la milza dissociata e il fluido in un tubo centrifugo da 15 ml.
3. Centrifugare il tubo a 370 x g per 7 min a 10°C ed eliminare il surnatante, evitando il pellet.
4. Ripresa del pellet in 2mL di acetato di potassio per lisi degli eritrociti. Attendere 2 minuti e quindi portare il volume fino a 15 ml utilizzando HBSS 2% FCS.
5. Centrifugare nuovamente il tubo a 370 x g per 7 min a 10°C. Scartare il surnatante e ricaspenare il pellet in 5mL di HBSS 2% FCS.
6. Contare le cellule utilizzando un test di colorazione blu tripano e regolare la concentrazione cellulare finale a 10⁷ cellule / mL utilizzando un volume appropriato di HBSS 2% FCS.

4. Colorazione cellulare

1. Trasferire 200μL della sospensione cellulare in sei tubi FACS, etichettati da 1 a 6.
2. Centrifugare i tubi a 370 x g per 7 min a 10°C ed eliminare il surnatante evitando il pellet.
3. Successivamente, preparare sei nuove miscele di anticorpi aggiungendo una quantità appropriata di anticorpi a 200μL HBSS 2% FCS secondo la Tabella 1.
4. Quindi, trasferire queste miscele di anticorpi ai corrispondenti tubi FACS numerate.
5. Incubare le sospensioni cellulari mescolate con gli anticorpi per 20 minuti sul ghiaccio al buio.
6. Aggiungere 1 ml di HBSS 2% FCS a ciascun tubo e quindi centrifugare di nuovo a 370 x g per 3 minuti a 10 ° C.
7. Scartare il surnatante e ricaspenare il pellet in 200μL di HBSS 2% FCS.
8. Trasferire i pellet riconsodati in nuovi tubi FACS.

Tabella 1: Composizione della miscela di anticorpi. Sei miscele di 200μL di anticorpi HBSS + sono state preparate per l'esperimento. Il mix 1 è per l'impostazione PMT, i mix da 2 a 5 sono per le impostazioni di compensazione e il mix 6 è per l'ordinamento delle celle.

5. Calibrazione FACS

1. Innanzitutto, accendi il sorter ed esegui "Fluidics Startup".
2. Accendi il flusso e attendi 15 minuti affinché il flusso si stabilizzi.
3. Regolare l'ampiezza del flusso per ottenere la formazione di gocce staccate. Quindi fare clic su "Sweet Spot" per completare la regolazione dell'ampiezza.
4. Metti il filtro a densità neutra (N.D.) - 1.0 e apri l'interfaccia "CST" che sta per configurazione e tracciamento del citometro.
5. Per eseguire il controllo di qualità giornaliero, prima diluire le perle CST con il supporto FACS seguendo le istruzioni del produttore e quindi eseguire il controllo CST.
6. Una volta completato il controllo CST, sostituire il filtro N.D. 1.0 con il filtro N.D. 2.0 sul citometro.
7. Successivamente, diluire le perline di ritardo della caduta nel mezzo FACS seguendo le istruzioni del produttore e quindi caricare nel FACS.
8. Per garantire un corretto ordinamento eseguire Drop Delay-
   1. Fare prima clic su "Tensione" e poi su "Filtro ottico". Il quadrante destro dovrebbe essere uguale al 100%. Se necessario, regolare la vite laser rossa sul citometro a sinistra oa destra per ottenere il 100% nel quadrante destro.
   2. Quindi, eseguire un ordinamento di prova per assicurarsi che il flusso cada nel tubo di raccolta. Per fare ciò, fare clic su "Cassetto rifiuti" e avviare "Test Sort". Verificare che i flussi laterali cadano nei tubi di raccolta. Se non lo fanno, regola la tensione fino a quando non lo fanno.
   3. Passare al modello sperimentale. Quindi, apri l'esperimento "Accudrop Drop Delay" e fai clic su "Sorting Layout".
   4. Modificare la portata per ottenere da 1000 a 3000 eventi al secondo.
   5. Fare clic su "Tensione" e quindi su "Filtro ottico". Il quadrante sinistro deve essere uguale a 0 e il quadrante destro a 100.
   6. Nella finestra "Ordina layout" fare clic su "Ordina" e quindi fare clic su "Annulla". Il quadrante sinistro deve essere uguale a 100 e il quadrante destro a 0. Se il quadrante sinistro è inferiore a 95, fare clic su "Ritardo automatico" per regolarlo automaticamente.

6. Citometria a flusso e controllo della purezza

1. Inizia la citometria a flusso iniziando con il tubo 1 (cellule non macchiate) per definire la morfologia cellulare e i picchi negativi dei fluorocromi. Impostare lo scatter avanti e laterale e definire le tensioni di ciascun parametro fluorescente. Posizionare la popolazione negativa nel primo decennio utilizzando le griglie su ciascun dot plot.
2. Quindi, caricare il tubo 2 (controllo del colore singolo) nel citometro. Regolare la sovrapposizione spettrale fino a quando le mediane di popolazione negative e positive non sono allineate o utilizzare il software di calcolo automatico. È importante mantenere il segnale sulla scala. I controlli di compensazione devono corrispondere alle impostazioni sperimentali dei fluorocromi e dei rivelatori. Registra 10.000 eventi.
3. Ripetere questi passaggi con i tubi 3, 4 e 5 (altri controlli a colore singolo).
4. Successivamente, caricare il tubo 6 (celle multi-macchiate) e definire le popolazioni cellulari di interesse utilizzando una strategia di gating specifica.
5. Nella finestra Layout ordinamento selezionare la popolazione di celle di interesse. Selezionare la soglia della cella in "Eventi target" e il livello di precisione in "Precisione". Qui viene ordinata una sola popolazione, tuttavia, quattro diverse popolazioni possono essere ordinate contemporaneamente.
6. Una volta pronto, fai clic su "Ordina" e "OK", quindi attendi l'ordinamento delle celle.
7. Una volta completata la selezione delle celle, eseguire un controllo di purezza pipettando prima 10μL di celle smisate in un nuovo tubo FACS con 90 microlitri di HBSS 2% FCS.
8. Quindi, caricare il tubo il citometro. Registrare e analizzare i fenotipi delle cellule per verificare che la strategia di gating abbia funzionato come previsto.

7. Analisi dei dati

1. Apri il software 'FlowJo' e trascina i file per ogni tubo nella finestra "Tutti i campioni".
2. Fare doppio clic su un file per aprirlo in una nuova finestra.
3. Clicca sul "Poligono" e ricrea la strategia di gating usata in precedenza.
4. Ripetere i passaggi con tutti gli altri file.
5. Per visualizzare i dot plot, fare clic su "Editor layout" e trascinare le popolazioni di interesse dal tubo 6 e dal controllo della purezza nella scheda editor di layout. Le cellule dovrebbero apparire solo nella popolazione di interesse per il controllo della purezza (vedi Figura 2).
6. Per verificare la purezza dei linfociti B nelle cellule ordinate, fare clic su "Editor tabelle". Trascinare la popolazione di linfociti B dal tubo 6 e il controllo della purezza nella tabella.
7. Nel menu"Statistiche"selezionare la frequenza delle celle CD45⁺ per testare la purezza di questa popolazione cellulare, quindi fare clic su "Crea tabella".
8. I valori dei parametri vengono visualizzati in una nuova tabella. Nella finestra di controllo della purezza, controllare la frequenza dei linfociti B all'interno delle cellule CD45^+, che dovrebbe essere superiore al 98% (vedere figura 2, pannello inferiore).