Magnetic Activated Cell Sorting (MACS): isolamento dei linfociti T timici

1. Preparazione

1. Prima di iniziare, indossare guanti da laboratorio e indumenti protettivi appropriati.
2. Lavare tutti gli strumenti di dissezione, prima con un detergente e poi con etanolo al 70% e poi asciugarli con un tovagliolo di carta pulito.
3. Preparare 200 ml di soluzione salina bilanciata di Hank (HBSS) contenente il 2% di siero fetale di vitello (FCS).

2. Dissezione

1. Appuntare un topo eutanasizzato su una piastra di dissezione in posizione supina.
2. Utilizzando forbici e pinza eseguire una laparotomia longitudinale per accedere alla cavità toracica.
3. Rimuovi il cuore per accedere al timo, che si trova sopra il cuore. Quindi, identifica il timo, che è composto da due lobi bianchi e si trova nella cavità toracica sopra il cuore.
4. Usando la pinica staccare accuratamente il timo e posizionarlo sulla capsula di Petri con 5 ml di HBSS 2% FCS.

3. Isolamento delle cellule immunitarie

1. Posizionare il timo su un colino cellulare da 40 μm sulla stessa capsula di Petri. Schiacciare il timo con uno stantuffo per dissociarlo nello stesso piatto.
2. Trasferire il timo dissociato e il fluido in un tubo centrifugo da 15 ml.
3. Lavare la capsula di Petri con 5 ml di HBSS 2% FCS e trasferire il mezzo lavato anche nello stesso tubo della centrifuga.
4. Centrifugare il tubo a 370 x g per 7 min a 20°C ed eliminare il surnatante evitando il pellet.
5. Ricaspendare il pellet in 2 ml di acetato di potassio per lisire gli eritrociti. Attendere 2 minuti e quindi portare il volume fino a 14 ml utilizzando HBSS 2% FCS.
6. Centrifugare nuovamente il tubo a 370 x g per 7 min a 20°C. Scartare il surnatante e ricaspenare il pellet in 5 ml di HBSS 2% FCS.
7. Stimare la concentrazione cellulare utilizzando il test di colorazione blu tripano e regolare la concentrazione cellulare finale a^{10 7} cellule / mL utilizzando un volume appropriato di HBSS 2% FCS.

4. Etichettatura magnetica delle cellule immunitarie

1. Prendi due tubi FACS. Etichettare un tubo, "cellule T non arricchite", e l'altro tubo, "cellule T arricchite", che saranno separati utilizzando l'etichettatura magnetica.
2. Distribuire la soluzione cellulare in ciascuno dei due tubi FACS.
3. Centrifugare il tubo "cellule T arricchite" a 370 x g per 3 min a 20°C ed eliminare il surnatante evitando il pellet.
4. Spese di sospensione del pellet in 250 μL di miscela di anticorpi biotinilati anti-CD3 (Tabella 1, Miscela 1).

Mescolare	Etichettatura dei reagenti	Diluizione
1	Anticorpo biotinilato anti-CD3	1/400 (in HBSS 2% FCS)
2	Pere accoppiate a streptavidina	1/5 (in HBSS 2% FCS)
3	Anti-CD3 BV421	1/200 (in HBSS 2% FCS)

Tabella 1: Composizione della miscela di anticorpi. Le miscele 1 e 2 sono utilizzate per la separazione magnetica. Mix 3 viene utilizzato per valutare l'arricchimento cellulare dopo la separazione magnetica.

5. Incubare la miscela di sospensione cellulare-anticorpo per 15 minuti a 4°C al buio.
6. Aggiungere 3 ml di HBSS 2% FCS a entrambi i tubi e centrifugarli nuovamente a 370 x g per 3 minuti a 20°C.
7. Scartare il surnatante e risospenare il pellet in perle accoppiate a streptaviduina da 250 μL (Tabella 1, Miscela 2).
8. Incubare la miscela cellulare e le perle per 20 minuti sul ghiaccio.
9. Quindi, aggiungere 3 ml di HBSS 2% FCS e mescolare bene e centrifugare nuovamente a 370 x g per 3 minuti a 20 ° C.
10. Rispendare il pellet in 2 ml di HBSS 2% FCS.

5. Separazione magnetica delle cellule CD3-positive

1. Posizionare la colonna sul magnete e aggiungere 3 ml di HBSS 2% FCS per umidificare il sistema. Attendere 5 minuti.
2. Quindi, pipettare le celle etichettate nella colonna.
3. Dopo che la sospensione cellulare passa attraverso la colonna, lavare la colonna X3 volte con 3 ml di HBSS 2% FCS.
4. Quindi, rimuovere la colonna dal magnete e posizionarla in un tubo di raccolta da 15 ml.
5. Per eluire le cellule bersaglio, aggiungere 5 ml di HBSS 2% FCS alla colonna e lavare la colonna con lo stantuffo.
6. Ripetere la fase di eluizione con altri 5 ml di HBSS 2% FCS.

6. Valutazione dell'arricchimento delle cellule bersaglio mediante citometria a flusso

1. Trasferire 500 μL di sospensione cellulare eluita in un tubo FACS etichettato come "cellule T arricchite". Trasferire 200 μL di sospensione di "cellule T non arricchite" in un secondo FACS.
2. Quindi, centrifugare entrambi i tubi a 370 x g per 7 minuti a 20°C.
3. Eliminare il surnatante, quindi aggiungere 100 μL di anticorpo fluorescente Mix 3 (vedere Tabella 1) in entrambe le provette.
4. Incubare entrambi i tubi per 20 minuti a 4°C al buio.
5. Quindi, aggiungere 3 ml di HBSS 2% FCS ai tubi e centrifugarli a 370 x g per 3 minuti a 20 °C.
6. Scartare il surnatante, quindi risusediare ogni tubo in 250 μL di HBSS 2% FCS.
7. Ora, valuta il tasso di arricchimento cellulare CD3-positivo mediante citometria a flusso.

7. Analisi dei dati

1. Apri l'icona 'FlowJo' e trascina i file per ogni tubo nella finestra "Tutti i campioni".
2. Fare doppio clic sul file "celle T arricchite" per visualizzare il dot plot che visualizza lo scatter in avanti (FSC-A) sull'asse X e lo scatter laterale (SSC-A) sull'asse Y.
3. Clicca su"Poligono"per cerchiare le popolazioni di linfociti.
4. Quindi, fai doppio clic sulla popolazione cerchiata per creare una nuova finestra.
5. Selezionare "FSC-W" sull'asse Y e "FSC-A" sull'asse X, e cerchiare le celle negative FSA-W. Nella finestra"Identificazione sottopopolazione",denominare la popolazione cellulare "celle singole".
6. Fare doppio clic sulla popolazione cerchiata per creare una nuova finestra. Selezionare "CD3" sull'asse Y e cerchiare le celle CD3-positive. Nella finestra"Identificazione sottopopolazione"denominare la popolazione cellulare "Cellule T".
7. Ripeti con le "cellule T non arricchite".
8. Per visualizzare la popolazione cellulare, fare clic su "Editor layout" e trascinare la popolazione "cellule T" dai file "cellule T arricchite" e "cellule T non arricchite" nella scheda.
9. Appariranno i dot plot che rappresentano i linfociti CD3+. Le cellule CD3+ dovrebbero apparire solo nella popolazione di interesse nel tubo arricchito CD3+.
10. Per valutare l'arricchimento dei linfociti CD3+ nelle cellule ordinate, fare clic su"Editor tabelle",quindi trascinare la popolazione di "cellule T" dai file "cellule T arricchite" e "cellule T non arricchite" nella tabella.
11. Nel menu "Statistiche", selezionare " Frequenza delle celluledei linfociti" per controllare la percentuale di cellule CD3 + in tutti i linfociti, quindi fare clic su "Crea tabella".
12. I valori dei parametri verranno visualizzati in una nuova tabella. Per le "cellule T arricchite", la frequenza delle cellule CD3+ dovrebbe essere di circa l'80%.