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Fonte: Meunier Sylvain1,2,3, Perchet Thibaut1,2,3, Sophie Novault4, Rachel Golub1,2,3
1 Unità di Linfopoiesi, Dipartimento di Immunologia, Istituto Pasteur, Parigi, Francia
2 INSERM U1223, Parigi, Francia
3 Université Paris Diderot, Sorbonne Paris Cité, Cellule Pasteur, Parigi, Francia
4 Platfrom, Citometria a flusso e biomarcatori UtechS, Center for Translational Science, Pasteur Institute, Parigi, Francia
La difesa contro gli agenti patogeni dipende dalla sorveglianza da parte del sistema immunitario. Questo sistema è complesso e comprende molti tipi di cellule, ognuna con funzioni specifiche. Questa complessa composizione consente risposte immunitarie a una grande varietà di agenti patogeni e lesioni. L'immunità adattativa consente risposte specifiche contro agenti patogeni specifici. La maggior parte delle cellule responsabili di questo tipo di immunità sono i linfociti (cellule B e cellule T). Di solito, le cellule B rispondono alle infezioni extracellulari (come le infezioni batteriche) e le cellule T rispondono alle infezioni intracellulari (come le infezioni virali). I diversi tipi di cellule nelle popolazioni di linfociti possono essere caratterizzati dalla combinazione di proteine di superficie cellulare che esprimono e/o da un pannello di citochine secrete.
La selezione magnetica consente l'arricchimento di popolazioni cellulari mirate utilizzando proprietà magnetiche ed espressione di una o più proteine di superficie cellulare (1, 2). Questa tecnica consiste di tre passaggi. In primo luogo, le cellule vengono incubate con perle magnetiche che sono accoppiate con uno o più anticorpi monoclonali specifici. Le cellule che esprimono proteine di superficie che si legano a questi anticorpi si attaccano alle perle magnetiche. Quindi, le popolazioni cellulari mirate vengono catturate con un magnete. Per finire, le cellule bersaglio vengono eluite dal magnete. Alla fine, si ottengono due prodotti di selezione, uno contenente cellule non etichettate e il secondo contenente le cellule bersaglio accoppiate con le perli magnetiche. Le colonne possono essere utilizzate per migliorare l'efficienza dello smistamento magnetico. Nella colonna, un elemento non magnetico allunga il percorso della cella attraverso la colonna. Quindi, il flusso cellulare viene rallentato, facilitando la cattura cellulare da parte del magnete.
Figura 1: Rappresentazione schematica della separazione magnetica. I leucociti timici sono colorati con anticorpi biotinilati anti-CD3. Dopo il lavaggio, le perle accoppiate alla streptavitina (SAV) fissano specificamente la biotina sugli anticorpi anti-CD3. (1) Le celle vengono trasferite in una colonna. (2) Il magnete non trattiene le celle non etichettate, mentre le celle CD3-positive rimangono nella colonna. Infine, la colonna viene separata dal magnete e (3) le cellule CD3-positive vengono eluite nel mezzo. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Esistono due tipi di smistamento magnetico (3). Nella selezione positiva, le cellule di interesse vengono catturate con le pere magnetiche. Nella selezione negativa, le cellule indesiderate vengono rimosse catturando con le pere magnetiche che trasportano gli anticorpi appropriati. Questa tecnica MACS consente un buon arricchimento delle cellule bersaglio e migliora la percentuale di cellule recuperate dall'1-20% al 60-98% in un organo. Dopo lo smistamento, è necessario verificare la purezza cellulare e lo smistamento con metodi diversi (ad esempio citometria a flusso). La tecnica MACS è ideale per arricchire una popolazione target per altri esperimenti come la coltura cellulare o l'analisi del ciclo cellulare.
In questo esercizio di laboratorio, dimostriamo come isolare i leucociti timici e successivamente arricchire le cellule timiche CD3-positive dal mix usando la tecnica di selezione delle cellule magnetiche.
1. Preparazione
2. Dissezione
3. Isolamento delle cellule immunitarie
4. Etichettatura magnetica delle cellule immunitarie
| Mescolare | Etichettatura dei reagenti | Diluizione |
| 1 | Anticorpo biotinilato anti-CD3 | 1/400 (in HBSS 2% FCS) |
| 2 | Pere accoppiate a streptavidina | 1/5 (in HBSS 2% FCS) |
| 3 | Anti-CD3 BV421 | 1/200 (in HBSS 2% FCS) |
Tabella 1: Composizione della miscela di anticorpi. Le miscele 1 e 2 sono utilizzate per la separazione magnetica. Mix 3 viene utilizzato per valutare l'arricchimento cellulare dopo la separazione magnetica.
5. Separazione magnetica delle cellule CD3-positive
6. Valutazione dell'arricchimento delle cellule bersaglio mediante citometria a flusso
7. Analisi dei dati
Lo smistamento cellulare attivato magneticamente, o MACS, è una tecnica che consente ai ricercatori di separare le cellule in base a specifici epitopi espressi sulle loro superfici.
Il processo inizia in genere con l'estrazione di un organo o tessuto, come il timo. Quindi, le cellule vengono separate meccanicamente, di solito schiacciando, fino a quando il tessuto non viene dissociato in singole cellule. Le cellule indesiderate possono essere rimosse in questa fase tramite l'aggiunta di sostanze chimiche. Ad esempio, il cloruro di ammonio-potassio o il tampone ACK possono essere utilizzati per lisi di eritrociti indesiderati.
Successivamente, un anticorpo coniugato a una molecola chiamata biotina viene aggiunto alla sospensione e questi complessi si legano agli epitopi della superficie delle cellule bersaglio. La biotina ha un'alta affinità per un'altra molecola chiamata streptavitina. Nella fase successiva, le molecole di streptavidina fuse in perle magnetiche vengono aggiunte alle cellule etichettate con anticorpi. Quando la biotina e la streptavitina entrano in contatto, si legano strettamente. Il risultato è che le cellule di interesse sono rivestite con perli magnetiche. Questo complesso è a volte indicato come un sandwich. In questo caso, CD3 sulla membrana cellulare sul fondo, quindi anti-CD3 coniugato alla biotina e, infine, streptavitina coniugata a perle magnetiche.
Queste celle etichettate possono ora essere collocate in una colonna contenente una matrice che, assistita dalla gravità, consente alle cellule di passare lentamente da un magnete. Mentre lo fanno, le celle con etichetta magnetica con perli si attaccheranno al bordo del tubo più vicino al magnete, mentre le celle non etichettate continueranno in un tubo di raccolta sottostante. Successivamente, le celle etichettate possono essere rimosse dalla colonna semplicemente rimuovendo il magnete, aggiungendo una soluzione di eluente e applicando una leggera pressione con uno stantuffo per sciacquarle fuori dalla colonna e in un nuovo tubo di raccolta. In definitiva, questo processo consente il recupero dal 60 al 98% delle cellule di interesse.
In questa procedura, isoleremo i leucociti timici da un topo e useremo MACS per risolvere le cellule T CD3-positive prima di confermare l'efficienza dello smistamento utilizzando FACS.
Per iniziare, indossare qualsiasi dispositivo di protezione appropriato, tra cui un camice da laboratorio e guanti. Quindi, lavare un paio di forbici e pinza di dissezione con etanolo al 70% e asciugarli con un tovagliolo di carta pulito. Quindi preparare 200 millilitri di siero fetale al polpaccio HBSS 2%, o FCS, mescolando quattro millilitri di FCS con 196 millilitri di HBSS.
Fissare un topo eutanasizzato in posizione supina su una piastra di dissezione. Usando forbici e pinza, eseguire una laparotomia longitudinale per accedere alla cavità toracica. In primo luogo, rimuovere il cuore per ottenere l'accesso al timo, che si trova sopra il cuore. Quindi identificare il timo, che è composto da due lobi bianchi. Usando la pinica, staccare con cura il timo e posizionarlo su una capsula di Petri con cinque millilitri di HBSS 2% FCS.
Per isolare le cellule immunitarie, prima posizionare il timo su un colino cellulare da 40 micrometri nella capsula di Petri. Schiacciare il tessuto con uno stantuffo per dissociarlo nel piatto. Successivamente, sciacquare lo stantuffo e il filtro con HBSS 2% FCS per recuperare eventuali cellule aderenti. Quindi, pipettare le cellule di timo dissociate e il fluido dalla capsula di Petri in un tubo di centrifuga da 15 millilitri. Lavare la capsula di Petri con cinque millilitri di HBSS 2% FCS e trasferire questa soluzione di lavaggio anche nel tubo della centrifuga da 15 millilitri.
Quindi, centrifugare il tubo a 370 volte g per sette minuti a 20 gradi Celsius. Scartare il surnatante e risuscicare il pellet in due millilitri di tampone di lisi ACK per lisi degli eritrociti. Incubare per due minuti a temperatura ambiente sul piano di lavoro. Quindi, portare il volume a 14 millilitri con HBSS 2% FCS. Centrifugare il tubo a 370 volte g per sette minuti a 20 gradi Celsius. Quindi, scartare il surnatante e risospentare le cellule in cinque millilitri di HBSS 2% FCS.
Stimare la concentrazione cellulare utilizzando un vetrino di Malassez come mostrato nel protocollo per l'isolamento FACS dei linfociti B e regolare la concentrazione cellulare a 10-settima cellula per millilitro con HBSS 2% FCS.
Trasferire 500 microlitri di soluzione cellulare in due tubi FACS. Etichettare un tubo cellule T non arricchite e l'altro tubo T-cellule T arricchite, che saranno separate utilizzando l'etichettatura magnetica.
Centrifugare il tubo delle cellule T arricchito a 370 volte g per tre minuti a 20 gradi Celsius. Scartare il surnatante e risuspare il pellet in 250 microlitri di anticorpo anti CD3 accoppiato a biotina diluito uno su 400 in HBSS 2% FCS. Incubare le cellule per 20 minuti sul ghiaccio e al buio. Aggiungere tre millilitri di HBSS 2% FCS ai tubi e centrifugarli di nuovo a 370 volte g per tre minuti a 20 gradi Celsius. Scartare il surnatante e risuscidere il pellet in 250 microlitri di perle accoppiate a streptavidina diluite una su cinque in HBSS 2% FCS. Incubare la miscela di cellule e perle per 20 minuti sul ghiaccio. Quindi, aggiungere tre millilitri di HBSS 2% FCS al tubo, pipettare su e giù per mescolare e centrifugare di nuovo a 370 volte g per tre minuti a 20 gradi Celsius. Risusciendi il pellet in due millilitri di HBSS 2% FCS.
Posizionare la colonna sul magnete e aggiungere tre millilitri di HBSS 2% FCS per umidificare il sistema. Quindi, pipettare le celle colorate nella colonna. Dopo che la sospensione cellulare passa attraverso la colonna, lavare la colonna tre volte con tre millilitri di HBSS 2% FCS. Quindi, rimuovere la colonna dal magnete e posizionarla in un tubo da 15 millilitro. Per eluire le celle bersaglio, aggiungere cinque millilitri di HBSS 2% FCS alla colonna e sciacquare la colonna con uno stantuffo. Ripeti questo passaggio con altri cinque millilitri di HBSS 2% FCS.
Per valutare l'efficacia dell'isolamento delle cellule bersaglio, trasferire prima 500 microlitri di sospensione cellulare eluita in un tubo FACS ed etichettarlo con cellule T arricchite. Quindi, centrifugare sia i tubi arricchiti che quelli non arricchiti a 370 volte g per sette minuti a 20 gradi Celsius. Scartare il surnatante, quindi aggiungere 100 microlitri di anticorpi fluorescenti diluiti uno su 200 in HBSS 2% FCS a entrambi i tubi. Incubare le cellule per 20 minuti sul ghiaccio e al buio. Quindi, aggiungere tre millilitri di HBSS 2% FCS ai tubi e centrifugarli a 370 volte g per tre minuti a 20 gradi Celsius. Scartare il surnatante, quindi risospenare il pellet in 250 microlitri di HBSS 2% FCS. Ora, valuta il tasso di arricchimento cellulare CD3-positivo utilizzando la citometria a flusso come mostrato nel protocollo FACS.
Ora, determineremo la frequenza dei linfociti CD3-positivi tra tutti i timociti che sono stati isolati dal timo del topo. Per iniziare, fai doppio clic sull'icona FlowJo e trascina i file per ciascun tubo nella finestra di tutti i campioni. Quindi, fare doppio clic sul file delle celle T arricchito per visualizzare le celle registrate da quel campione su un dot plot che visualizza lo scatter in avanti, FSCA, sull'asse x e lo scatter laterale, SSCA, sull'asse y.
Clicca sul poligono per cerchiare le popolazioni di linfociti. Quindi, fai doppio clic sulla popolazione cerchiata per creare una nuova finestra. Selezionare FSC-W sull'asse y e FSC-A sull'asse x e cerchiare le celle FSA-W negative. Nella finestra di identificazione della sottosomis popolazione, denominare la popolazione cellulare Celle singole. Quindi, fai clic su OK nella finestra di identificazione della popolazione secondaria, quindi fai doppio clic sulla popolazione cerchiata per creare una nuova finestra. Selezionate CD3 sull'asse y e circondate le celle CD3-positive. Nella finestra di identificazione della sottosopecificazione, assegnare un nome alle cellule T della popolazione cellulare. Ripetere l'operazione con il file delle cellule T non arricchite. Per visualizzare la popolazione di celle, fare clic su Editor layout e trascinare la popolazione di cellule T da cellule T arricchite e file di cellule T non arricchite nella scheda.
Appariranno dot plot che rappresentano i linfociti CD3-positivi. Le cellule CD3-positive dovrebbero apparire solo nella popolazione di interesse nel tubo arricchito CD3-positivo. Per valutare l'arricchimento dei linfociti CD3-positivi nelle cellule ordinate, fare clic su Editor tabella e quindi trascinare la popolazione di cellule T da cellule T arricchite e file di cellule T non arricchite nella tabella. Nel menu statistico, selezionare Frequenza delle cellule linfocitarie per controllare la percentuale di cellule CD3-positive in tutti i linfociti. Quindi, fai clic su Crea tabella. I valori dei parametri verranno visualizzati in una nuova tabella. Per le cellule T arricchite, la frequenza delle cellule CD3-positive dovrebbe essere di circa l'80% o superiore.
La selezione cellulare attivata magneticamente, o MACS, è una tecnica che consente ai ricercatori di separare le cellule in base a specifici epitopi espressi sulla loro superficie.
Il processo inizia in genere con l'estrazione di un organo o di un tessuto, come il timo. Quindi, le cellule vengono separate meccanicamente, di solito mediante frantumazione, fino a quando il tessuto non viene dissociato in singole cellule. Le cellule indesiderate possono essere rimosse in questa fase tramite l'aggiunta di sostanze chimiche. Ad esempio, il tampone ammonio-cloruro-potassio, o tampone ACK, può essere utilizzato per lisare gli eritrociti indesiderati.
Successivamente, un anticorpo coniugato a una molecola chiamata biotina viene aggiunto alla sospensione e questi complessi si legano agli epitopi della superficie delle cellule bersaglio. La biotina ha un'elevata affinità per un'altra molecola chiamata streptavidina. Nella fase successiva, le molecole di streptavidina fuse a biglie magnetiche vengono aggiunte alle cellule marcate con anticorpi. Quando la biotina e la streptavidina entrano in contatto, si legano strettamente. Il risultato è che le celle di interesse sono rivestite con perline magnetiche. Questo complesso è talvolta indicato come sandwich. In questo caso, CD3 sulla membrana cellulare sul fondo, poi anti-CD3 coniugato a biotina e, infine, streptavidina coniugata a biglie magnetiche.
Queste celle marcate possono ora essere collocate in una colonna contenente una matrice che, assistita dalla gravità, permette alle cellule di passare lentamente attraverso un magnete. Mentre lo fanno, le celle marcate con perline magnetiche si attaccheranno al bordo del tubo più vicino al magnete, mentre le celle non marcate continueranno in un tubo di raccolta sottostante. Successivamente, le celle marcate possono essere rimosse dalla colonna semplicemente rimuovendo il magnete, aggiungendo una soluzione di eluente e applicando una leggera pressione con uno stantuffo per espellerle dalla colonna e inserirle in una nuova provetta di raccolta. In definitiva, questo processo consente un recupero dal 60 al 98% delle cellule di interesse.
In questa procedura, isoleremo i leucociti timici da un topo e utilizzeremo il MACS per selezionare le cellule T CD3-positive prima di confermare l'efficienza dello smistamento utilizzando il FACS.
Per iniziare, indossa tutti i dispositivi di protezione appropriati, inclusi camice da laboratorio e guanti. Quindi, lava un paio di forbici da dissezione e pinze con etanolo al 70% e asciugale con un tovagliolo di carta pulito. Quindi preparare 200 millilitri di siero fetale di vitello HBSS al 2%, o FCS, mescolando quattro millilitri di FCS con 196 millilitri di HBSS.
Appuntare un topo soppresso in posizione supina su una piastra di dissezione. Utilizzando forbici e pinze, eseguire una laparotomia longitudinale per accedere alla cavità toracica. Per prima cosa, rimuovi il cuore per accedere al timo, che si trova sopra il cuore. Quindi identifica il timo, che è composto da due lobi bianchi. Usando una pinza, staccare con cura il timo e posizionarlo su una piastra di Petri con cinque millilitri di HBSS 2% FCS.
Per isolare le cellule immunitarie, posizionare prima il timo su un colino cellulare da 40 micrometri nella capsula di Petri. Schiacciare il fazzoletto con uno stantuffo per dissociarlo nel piatto. Successivamente, sciacquare lo stantuffo e il filtro con HBSS 2% FCS per recuperare eventuali cellule aderenti. Quindi, pipettare le cellule dissociate del timo e il fluido dalla piastra di Petri in una provetta da centrifuga da 15 millilitri. Lavare la capsula di Petri con cinque millilitri di HBSS 2% FCS e trasferire questa soluzione di lavaggio anche nella provetta da centrifuga da 15 millilitri.
Quindi, centrifugare la provetta a 370 volte g per sette minuti a 20 gradi Celsius. Scartare il surnatante e risospendere il pellet in due millilitri di tampone lisanti ACK per lisare gli eritrociti. Incubare per due minuti a temperatura ambiente sul piano di lavoro. Quindi, portare il volume a 14 millilitri con HBSS 2% FCS. Centrifugare la provetta a 370 volte g per sette minuti a 20 gradi Celsius. Quindi, scartare il surnatante e risospendere le cellule in cinque millilitri di HBSS 2% FCS.
Stimare la concentrazione cellulare utilizzando un vetrino di Malassez come mostrato nel protocollo per l'isolamento FACS dei linfociti B e regolare la concentrazione cellulare da 10 a una settima cellula per millilitro con HBSS 2% FCS.
Trasferire 500 microlitri di soluzione cellulare in due provette FACS. Etichettare una provetta con cellule T non arricchite e l'altra con provetta, che verranno separate mediante marcatura magnetica.
Centrifugare la provetta di cellule T arricchite a 370 volte g per tre minuti a 20 gradi Celsius. Scartare il surnatante e risospendere il pellet in 250 microlitri di anticorpo anti CD3 accoppiato a biotina diluito uno su 400 in HBSS 2% FCS. Incubare le cellule per 20 minuti con ghiaccio e al buio. Aggiungere tre millilitri di HBSS 2% FCS alle provette e centrifugarle nuovamente a 370 volte g per tre minuti a 20 gradi Celsius. Scartare il surnatante e risospendere il pellet in 250 microlitri di perle accoppiate a streptavidina diluite una su cinque in HBSS 2% FCS. Incubare la miscela di cellule e perle per 20 minuti con ghiaccio. Quindi, aggiungere tre millilitri di HBSS 2% FCS alla provetta, pipettare su e giù per mescolare e centrifugare di nuovo a 370 volte g per tre minuti a 20 gradi Celsius. Risospendere il pellet in due millilitri di HBSS 2% FCS.
Posizionare la colonna sul magnete e aggiungere tre millilitri di HBSS 2% FCS per umidificare il sistema. Quindi, pipettare le cellule colorate nella colonna. Dopo che la sospensione cellulare è passata attraverso la colonna, lavare la colonna tre volte con tre millilitri di HBSS 2% FCS. Quindi, rimuovi la colonna dal magnete e posizionala in un tubo da 15 millilitri. Per eluire le cellule bersaglio, aggiungere cinque millilitri di HBSS 2% FCS alla colonna e lavare la colonna con uno stantuffo. Ripetere questo passaggio con altri cinque millilitri di HBSS 2% FCS.
Per valutare l'efficacia dell'isolamento delle cellule bersaglio, trasferire prima 500 microlitri di sospensione cellulare eluita in una provetta FACS ed etichettarla con cellule T arricchite. Quindi, centrifugare sia le provette arricchite che quelle non arricchite a 370 volte g per sette minuti a 20 gradi Celsius. Scartare il surnatante, quindi aggiungere 100 microlitri di anticorpo fluorescente diluito uno su 200 in HBSS 2% FCS a entrambe le provette. Incubare le cellule per 20 minuti con ghiaccio e al buio. Quindi, aggiungere tre millilitri di HBSS 2% FCS alle provette e centrifugarle a 370 volte g per tre minuti a 20 gradi Celsius. Scartare il surnatante, quindi risospendere i pellet in 250 microlitri di HBSS 2% FCS. Ora, valutare il tasso di arricchimento cellulare CD3-positivo utilizzando la citometria a flusso, come mostrato nel protocollo FACS.
Ora determineremo la frequenza dei linfociti CD3-positivi tra tutti i timociti che sono stati isolati dal timo di topo. Per iniziare, fare doppio clic sull'icona FlowJo e trascinare i file per ogni tubo nella finestra di tutti i campioni. Quindi, fare doppio clic sul file delle cellule T arricchito per visualizzare le cellule registrate da quel campione su un grafico a punti che visualizza la dispersione in avanti, FSCA, sull'asse x, e la dispersione laterale, SSCA, sull'asse y.
Fare clic sul poligono per cerchiare le popolazioni di linfociti. Quindi, fai doppio clic sulla popolazione cerchiata per creare una nuova finestra. Selezionare FSC-W sull'asse y e FSC-A sull'asse x e cerchiare le celle negative FSA-W. Nella finestra di identificazione della sottopopolazione, denominare la popolazione cellulare Celle singole. Quindi, fai clic su OK nella finestra di identificazione della sottopopolazione, quindi fai doppio clic sulla popolazione cerchiata per creare una nuova finestra. Selezionare CD3 sull'asse y e cerchiare le celle CD3-positive. Nella finestra di identificazione della sottopopolazione, assegna un nome alle cellule T della tua popolazione cellulare. Ripetere con il file di cellule T non arricchite. Per visualizzare la popolazione cellulare, fare clic su Editor layout e trascinare la popolazione di cellule T dai file di cellule T arricchite e cellule T non arricchite nella scheda.
Appariranno i grafici a punti che rappresentano i linfociti CD3-positivi. Le cellule CD3-positive dovrebbero comparire solo nella popolazione di interesse nella provetta arricchita CD3-positiva. Per valutare l'arricchimento dei linfociti CD3-positivi nelle cellule ordinate, fare clic su Editor tabelle e quindi trascinare la popolazione di cellule T dai file di cellule T arricchite e cellule T non arricchite nella tabella. Nel menu delle statistiche, selezionare Frequenza delle cellule linfocitarie per controllare la percentuale di cellule CD3-positive in tutti i linfociti. Quindi, fai clic su Crea tabella. I valori dei parametri verranno visualizzati in una nuova tabella. Per le cellule T arricchite, la frequenza delle cellule CD3-positive dovrebbe essere di circa l'80% o superiore.
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