Question 1

Che cos'è il cell sorting magneticamente attivato e come separa le cellule?

Accepted Answer

Magnetico-cellula di ordinamento attivata, o MACS, è una tecnica che separa le cellule basandosi su specifici epitopi espressi sulle loro superfici. Gli anticorpi coniugati alla biotine si legano alle cellule bersaglio, poi le perle magnetiche accoppiate con streptavidin si attaccano alla biotina. Le cellule etichettate si attaccano a un magnete in una colonna mentre le cellule non etichettate passano attraverso, ottenendo un recupero del 60 al 98% delle cellule bersaglio.

Question 2

Come funziona l'interazione biotine-streptoavidina nei MACS?

Accepted Answer

La biotina, legata ad anticorpi che prendono di mira specifici marcatori di superficie cellulare, ha un'alta affinità per le molecole di streptavidina fuse a perle magnetiche. Quando la biotina e la streptavidina entrano in contatto, si legano saldamente, rivestendo le cellule bersaglio con perle magnetiche. Questo complesso sandwich di marcatore di superficie cellulare, anticorpo e perla magnetica permette la cattura magnetica e la separazione.

Question 3

Quali passaggi sono coinvolti nella preparazione del tessuto timinico per l'isolamento tramite MACS?

Accepted Answer

Il timo viene estratto e meccanicamente dissociato in cellule singole utilizzando un filtro per cellule e un pistone. Gli eritrociti indesiderati vengono lisi utilizzando il buffer ACK. Le cellule vengono quindi centrifugate e risospese in HBSS con siero di vitello fetale. La concentrazione cellulare viene regolata a 10 alla settima cellule per millilitro prima dell'etichettatura magnetica con anticorpi anti-CD3.

Question 4

Come vengono etichettate e catturate le cellule T CD3-positive durante il MACS?

Accepted Answer

Le cellule vengono incubate con anticorpi anti-CD3 accoppiati con biotina sul ghiaccio per 20 minuti, poi lavate. Vengono aggiunte perline magnetiche accoppiate con streptavidina e incubate per 20 minuti. La sospensione cellulare marcata viene pipette in una colonna posizionata su un magnete, dove le cellule CD3-positive aderiscono mentre le cellule non marcate fluiscono attraverso in un tubo di raccolta.

Question 5

Qual è lo scopo di utilizzare una colonna nel processo di separazione MACS?

Accepted Answer

La colonna contiene una matrice non magnetica che allunga il percorso che le cellule compiono attraverso il sistema. Questo rallenta il flusso cellulare, consentendo più tempo alle perline magnetiche di catturare efficacemente le cellule bersaglio. La colonna migliora l'efficienza di separazione e aumenta la percentuale di cellule recuperate rispetto alla separazione magnetica diretta senza colonna.

Question 6

Come viene verificata l'efficienza di arricchimento delle cellule T CD3-positive dopo MACS?

Accepted Answer

Campioni di cellule arricchite e non arricchite sono colorati con anticorpi anti-CD3 fluorescenti e analizzati utilizzando flow citometria. I dot plot mostrano i linfociti CD3-positivi, che dovrebbero apparire prevalentemente nel campione arricchito. Si calcola la frequenza delle cellule CD3-positive tra tutti i linfociti, con le cellule T arricchite che tipicamente mostrano l'80% o più di cellule CD3-positive.

Question 7

Quali sono le differenze tra la separazione magnetica positiva e negativa?

Accepted Answer

Nell'ordinamento positivo, le cellule di interesse vengono catturate utilizzando perle magnetiche accoppiate ad anticorpi che prendono di mira i marcatori di superficie desiderati. Nell'ordinamento negativo, le cellule indesiderate vengono rimosse catturandole con perle magnetiche che trasportano anticorpi appropriati. Entrambi gli approcci utilizzano lo stesso principio MACS ma differiscono per la popolazione cellulare che viene trattenuta rispetto a quella scartata.

Magnetic Activated Cell Sorting (MACS): isolamento dei linfociti T timici - Quiz di valutazione