Saggi ELISA: indiretti, sandwich e competitivi
1. ELISA indiretto
Un ELISA indiretto è quello in cui l'anticorpo antigene antigene-specifico primario è riconosciuto da un anticorpo coniugato secondario. Il seguente protocollo è un esempio di metodo ELISA indiretto, in cui i campioni di siero di topi infetti da virus dell'influenza A (IAV) vengono testati per la presenza di anticorpi IgG specifici per IAV. Un punto di forza di questo esempio è che possono essere utilizzati diversi anticorpi secondari che riconoscono tutti gli isotipi anticorpali o isotipi specifici (ad esempio, IgG).
Antigene di rivestimento alla micropiastra
- Rivestire i pozzetti di una piastra ELISA a 96 pozzetti con antigene purificato pipettando 50 μL di antigene purificato (2 mg/mL di virus A dell'influenza A A/PR/8 purificato in tampone Tris-HCl da 0,05 M (pH 9,5)) in ciascun pozzettino della piastra.
- Coprire la piastra con un coperchio adesivo e incubarla durante la notte a 4°C per consentire all'antigene di legarsi alla piastra.
- Al termine dell'incubazione, rimuovere la soluzione di rivestimento facendo scorrere la piastra su un lavandino.
Inceppamento
- Blocca i restanti siti di legame proteico nei pozzi rivestiti aggiungendo un tampone di blocco da 200 μL, qui viene utilizzato il siero d'asino al 5% in 1X PBS, per pozzo. I reagenti bloccanti alternativi includono il 5% di latte secco non grasso o BSA in PBS o siero normale da un animale in cui è stato generato l'anticorpo secondario.
- Incubare per almeno 2 ore a temperatura ambiente o durante la notte a 4°C.
- Dopo l'incubazione, rimuovere il tampone di blocco facendo scorrere la piastra e quindi lavare la piastra con PBS contenente l'1% di Tween-20.
Incubazione con l'anticorpo primario
- Preparare una diluizione seriale del campione di siero, che contiene l'anticorpo primario, per ottenere un intervallo di diluizione da 1 a 204.800, utilizzando 1X PBS. Per fare ciò, prima diluire il siero 1:12.5 e quindi eseguire una diluizione 4X (intervallo di diluizione - da 1:12,5 a 1:204.800).
- Aggiungere 100 μL dei campioni di siero diluiti in serie ai pozzi.
- Coprire la piastra con coperchio adesivo e incubare a temperatura ambiente per 1-2 ore.
- Dopo l'incubazione, far scorrere la piastra su un lavandino e lavare la piastra con PBS contenente l'1% di Tween-20.
Incubazione con l'anticorpo secondario
- Aggiungere 100 μL di un anticorpo secondario coniugato con enzima, perossidasi di rafano, asino coniugato HRP anti-topo secondario in questo esperimento, a ciascun pozzo.
- Incubare la piastra per 1 ora a temperatura ambiente.
- Dopo l'incubazione, far scorrere la piastra su un lavandino e quindi lavare la piastra con PBS contenente l'1% di Tween-20.
Scoperta
- Aggiungere 100 μL del substrato indicatore (3,3',5,5'-tetrametilbenzidina (TMB)) ad una concentrazione di 1 mg/mL a ciascun pozzettino.
- Incubare la piastra con il substrato per 5-10 minuti a temperatura ambiente.
- Dopo 10 min, interrompere la reazione enzimatica aggiungendo 100 μL 2N acido solforico (H2SO4).
Entro 30 minuti dall'aggiunta della soluzione di arresto, leggere la piastra utilizzando un lettore di micropiasse a 405 nm per determinare l'assorbanza dei pozzetti.
2. Sandwich ELISA
In questa versione ELISA, il campione sperimentale è "inserito" tra un anticorpo di cattura non coniugato e un anticorpo di rilevamento coniugato, entrambi specifici per la stessa proteina ma a epitopi diversi. Nel seguente esempio di ELISA sandwich, la concentrazione di TNFα umano è stata determinata in un campione sconosciuto utilizzando una curva standard generata dalla diluizione seriale 2,5X di un TNFα umano ricombinante standard noto (che indica una concentrazione di 75 pg / mL).
Anticorpo di cattura del rivestimento alla micropiastra
- Rivestire i pozzetti di una piastra ELISA a 96 pozzetti con anticorpo di cattura purificato aggiungendo 100 μL di anticorpo di cattura (intervallo 1-10 μg/mL) a ciascun pozzettino della piastra.
- Coprire la piastra con un coperchio adesivo e incubarla durante la notte a 4°C.
- Dopo l'incubazione, rimuovere la soluzione di rivestimento dalla piastra facendo scorrere la piastra su un lavandino.
Inceppamento
- Bloccare i restanti siti di legame proteico nei pozzi rivestiti di anticorpi aggiungendo 200 μL di soluzione bloccante, 5% di latte secco non grasso contenente PBS, ai pozzi.
- Incubare per almeno 2 ore a temperatura ambiente o durante la notte a 4°C.
- Dopo l'incubazione, rimuovere il tampone di blocco facendo scorrere la piastra e quindi lavare la piastra con PBS contenente l'1% di Tween-20.
Aggiungere campioni di antigene contenenti campioni di prova
- Aggiungere 100 μL del campione di prova ai pozzi. Sigillare la piastra con un coperchio adesivo.
- Incubare per 1-2 ore a temperatura ambiente o durante la notte a 4°C.
- Dopo l'incubazione, rimuovere i campioni facendo scorrere la piastra sul lavandino e quindi lavare i fori con 200 μL 1X PBS contenente l'1% di Tween-20.
Aggiungi anticorpo di rilevamento coniugato con enzima
- Aggiungere 100 μL di anticorpo di rilevamento coniugato con enzimi ai pozzetti a una concentrazione preottimizzata.
- Sigillare la piastra con un coperchio adesivo e incubare a temperatura ambiente per 2 ore.
- Rimuovere l'anticorpo di rilevamento non legato facendo scorrere la piastra su un lavandino e lavare i pozzetti con 200 μL 1X PBS contenente l'1% di Tween-20.
Scoperta
- Aggiungere 100 μL del substrato indicatore ad una concentrazione di 1 mg/mL. Qualsiasi anticorpo di rilevamento coniugato enzimatico legato convertirà il substrato in un segnale rilevabile.
- Incubare la piastra per 5-10 minuti a temperatura ambiente.
- Dopo 5-10 minuti, interrompere la reazione enzimatica aggiungendo 100 μL 2N H2SO4 ai pozzi. Entro 30 minuti dall'aggiunta della soluzione di arresto, leggere la piastra utilizzando un lettore di micropiasse per determinare l'assorbanza dei pozzetti.
3. ELISA competitivo
Le fasi di un ELISA competitivo sono diverse da quelle utilizzate nell'ELISA indiretto e sandwich, con la differenza principale che è la fase di legame competitivo tra l'antigene campione e l'antigene "add-in". L'antigene campione viene incubato con l'anticorpo primario non etichettato. Questi complessi anticorpo-antigene vengono quindi aggiunti alla piastra ELISA, che è stata pre-rivestita con lo stesso antigene. Dopo un periodo di incubazione, qualsiasi anticorpo non legato viene lavato via. Esiste una correlazione inversa tra la quantità di anticorpi liberi disponibili per legare l'antigene nel pozzo e la quantità di antigene nel campione originale. Ad esempio, un campione con antigene abbondante avrebbe più complessi di anticorpi antigene-primari, lasciando pochi anticorpi non legati per legarsi alla piastra ELISA. Un anticorpo secondario coniugato con enzimi specifico per l'anticorpo primario viene quindi aggiunto ai pozzi, seguito dal substrato.
Antigene di rivestimento alla micropiastra
- Rivestire i pozzetti di una piastra ELISA a 96 pozzetti con 100 μL di antigene purificato ad una concentrazione di 1-10 μg/mL.
- Coprire la piastra con un coperchio adesivo e incubare la piastra durante la notte a 4°C.
- Dopo l'incubazione, rimuovere la soluzione di antigene non legato dai pozzetti facendo scorrere la piastra su un lavandino.
Inceppamento
- Bloccare i restanti siti di legame proteico nei pozzi rivestiti aggiungendo 200 μL di tampone bloccante a ciascun pozzo, che può essere il 5% di latte secco non grasso o BSA in PBS.
- Incubare la piastra per almeno 2 ore a temperatura ambiente o durante la notte a 4°C.
Campione di incubazione (antigene) con l'anticorpo primario
- Mentre si bloccano i pozzezze, preparare la miscela antigene-anticorpo mescolando 150 μL di antigene campione e 150 μL di anticorpo primario per ciascun pozzeggio nel test.
- Incubare questa miscela per 1 ora a 37°C.
Aggiungere la miscela antigene-anticorpo al pozzo
- Ora, rimuovi il buffer di blocco dai pozzetti facendo scorrere la piastra su un lavandino.
- Quindi, lavare i pozzi con 1X PBS contenente Tween-20.
- Aggiungere 100 μL della miscela antigene-anticorpo primario campione.
- Incubare la piastra a 37°C per 1 ora.
- Rimuovere la miscela campione facendo scorrere la piastra su un lavandino.
- Quindi, lavare i pozzi con 1X PBS contenente l'1% di Tween-20 per rimuovere eventuali anticorpi non legati.
Aggiungere l'anticorpo secondario
- Aggiungere 100 μL di un anticorpo secondario coniugato enzimatico, che in questo caso è un anticorpo coniugato AP, a ciascun pozzo.
- Incubare la piastra per 1 ora a 37°C.
- Dopo l'incubazione, lavare la piastra con 1X PBS contenente l'1% di Tween-20.
Scoperta
- Aggiungere 100 μL della soluzione di substrato a ciascun pozzo.
- Attendere 5-10 min.
- Dopo 10 minuti, interrompere la reazione enzimatica aggiungendo 100 μL di acido solforico 2N ai pozzi. Quindi, misurare l'assorbanza in un lettore di micropiasse entro 30 minuti dall'aggiunta della soluzione di arresto
Fonte: Whitney Swanson1,2, Frances V. Sjaastad2,3e Thomas S. Griffith1,2,3,4
1 Dipartimento di Urologia, Università del Minnesota, Minneapolis, MN 5545…
1. ELISA indiretto
Un ELISA indiretto è quello in cui l'anticorpo antigene antigene-specifico primario è riconosciuto da un anticorpo coniugato secondario. Il seguente protocollo è un esempio di metodo ELISA indiretto, in cui i campioni di siero di topi infetti da virus dell'influenza A (IAV) vengono testati per la presenza di anticorpi IgG specifici per IAV. Un punto di forza di questo esempio è che possono essere utilizzati diversi anticorpi secondari che riconoscono tutti gli isotipi anticorpali o isotipi specifici (ad esempio, IgG).
Antigene di rivestimento alla micropiastra
- Rivestire i pozzetti di una piastra ELISA a 96 pozzetti con antigene purificato pipettando 50 μL di antigene purificato (2 mg/mL di virus A dell'influenza A A/PR/8 purificato in tampone Tris-HCl da 0,05 M (pH 9,5)) in ciascun pozzettino della piastra.
- Coprire la piastra con un coperchio adesivo e incubarla durante la notte a 4°C per consentire all'antigene di legarsi alla piastra.
- Al termine dell'incubazione, rimuovere la soluzione di rivestimento facendo scorrere la piastra su un lavandino.
Inceppamento
- Blocca i restanti siti di legame proteico nei pozzi rivestiti aggiungendo un tampone di blocco da 200 μL, qui viene utilizzato il siero d'asino al 5% in 1X PBS, per pozzo. I reagenti bloccanti alternativi includono il 5% di latte secco non grasso o BSA in PBS o siero normale da un animale in cui è stato generato l'anticorpo secondario.
- Incubare per almeno 2 ore a temperatura ambiente o durante la notte a 4°C.
- Dopo l'incubazione, rimuovere il tampone di blocco facendo scorrere la piastra e quindi lavare la piastra con PBS contenente l'1% di Tween-20.
Incubazione con l'anticorpo primario
- Preparare una diluizione seriale del campione di siero, che contiene l'anticorpo primario, per ottenere un intervallo di diluizione da 1 a 204.800, utilizzando 1X PBS. Per fare ciò, prima diluire il siero 1:12.5 e quindi eseguire una diluizione 4X (intervallo di diluizione - da 1:12,5 a 1:204.800).
- Aggiungere 100 μL dei campioni di siero diluiti in serie ai pozzi.
- Coprire la piastra con coperchio adesivo e incubare a temperatura ambiente per 1-2 ore.
- Dopo l'incubazione, far scorrere la piastra su un lavandino e lavare la piastra con PBS contenente l'1% di Tween-20.
Incubazione con l'anticorpo secondario
- Aggiungere 100 μL di un anticorpo secondario coniugato con enzima, perossidasi di rafano, asino coniugato HRP anti-topo secondario in questo esperimento, a ciascun pozzo.
- Incubare la piastra per 1 ora a temperatura ambiente.
- Dopo l'incubazione, far scorrere la piastra su un lavandino e quindi lavare la piastra con PBS contenente l'1% di Tween-20.
Scoperta
- Aggiungere 100 μL del substrato indicatore (3,3',5,5'-tetrametilbenzidina (TMB)) ad una concentrazione di 1 mg/mL a ciascun pozzettino.
- Incubare la piastra con il substrato per 5-10 minuti a temperatura ambiente.
- Dopo 10 min, interrompere la reazione enzimatica aggiungendo 100 μL 2N acido solforico (H2SO4).
Entro 30 minuti dall'aggiunta della soluzione di arresto, leggere la piastra utilizzando un lettore di micropiasse a 405 nm per determinare l'assorbanza dei pozzetti.
2. Sandwich ELISA
In questa versione ELISA, il campione sperimentale è "inserito" tra un anticorpo di cattura non coniugato e un anticorpo di rilevamento coniugato, entrambi specifici per la stessa proteina ma a epitopi diversi. Nel seguente esempio di ELISA sandwich, la concentrazione di TNFα umano è stata determinata in un campione sconosciuto utilizzando una curva standard generata dalla diluizione seriale 2,5X di un TNFα umano ricombinante standard noto (che indica una concentrazione di 75 pg / mL).
Anticorpo di cattura del rivestimento alla micropiastra
- Rivestire i pozzetti di una piastra ELISA a 96 pozzetti con anticorpo di cattura purificato aggiungendo 100 μL di anticorpo di cattura (intervallo 1-10 μg/mL) a ciascun pozzettino della piastra.
- Coprire la piastra con un coperchio adesivo e incubarla durante la notte a 4°C.
- Dopo l'incubazione, rimuovere la soluzione di rivestimento dalla piastra facendo scorrere la piastra su un lavandino.
Inceppamento
- Bloccare i restanti siti di legame proteico nei pozzi rivestiti di anticorpi aggiungendo 200 μL di soluzione bloccante, 5% di latte secco non grasso contenente PBS, ai pozzi.
- Incubare per almeno 2 ore a temperatura ambiente o durante la notte a 4°C.
- Dopo l'incubazione, rimuovere il tampone di blocco facendo scorrere la piastra e quindi lavare la piastra con PBS contenente l'1% di Tween-20.
Aggiungere campioni di antigene contenenti campioni di prova
- Aggiungere 100 μL del campione di prova ai pozzi. Sigillare la piastra con un coperchio adesivo.
- Incubare per 1-2 ore a temperatura ambiente o durante la notte a 4°C.
- Dopo l'incubazione, rimuovere i campioni facendo scorrere la piastra sul lavandino e quindi lavare i fori con 200 μL 1X PBS contenente l'1% di Tween-20.
Aggiungi anticorpo di rilevamento coniugato con enzima
- Aggiungere 100 μL di anticorpo di rilevamento coniugato con enzimi ai pozzetti a una concentrazione preottimizzata.
- Sigillare la piastra con un coperchio adesivo e incubare a temperatura ambiente per 2 ore.
- Rimuovere l'anticorpo di rilevamento non legato facendo scorrere la piastra su un lavandino e lavare i pozzetti con 200 μL 1X PBS contenente l'1% di Tween-20.
Scoperta
- Aggiungere 100 μL del substrato indicatore ad una concentrazione di 1 mg/mL. Qualsiasi anticorpo di rilevamento coniugato enzimatico legato convertirà il substrato in un segnale rilevabile.
- Incubare la piastra per 5-10 minuti a temperatura ambiente.
- Dopo 5-10 minuti, interrompere la reazione enzimatica aggiungendo 100 μL 2N H2SO4 ai pozzi. Entro 30 minuti dall'aggiunta della soluzione di arresto, leggere la piastra utilizzando un lettore di micropiasse per determinare l'assorbanza dei pozzetti.
3. ELISA competitivo
Le fasi di un ELISA competitivo sono diverse da quelle utilizzate nell'ELISA indiretto e sandwich, con la differenza principale che è la fase di legame competitivo tra l'antigene campione e l'antigene "add-in". L'antigene campione viene incubato con l'anticorpo primario non etichettato. Questi complessi anticorpo-antigene vengono quindi aggiunti alla piastra ELISA, che è stata pre-rivestita con lo stesso antigene. Dopo un periodo di incubazione, qualsiasi anticorpo non legato viene lavato via. Esiste una correlazione inversa tra la quantità di anticorpi liberi disponibili per legare l'antigene nel pozzo e la quantità di antigene nel campione originale. Ad esempio, un campione con antigene abbondante avrebbe più complessi di anticorpi antigene-primari, lasciando pochi anticorpi non legati per legarsi alla piastra ELISA. Un anticorpo secondario coniugato con enzimi specifico per l'anticorpo primario viene quindi aggiunto ai pozzi, seguito dal substrato.
Antigene di rivestimento alla micropiastra
- Rivestire i pozzetti di una piastra ELISA a 96 pozzetti con 100 μL di antigene purificato ad una concentrazione di 1-10 μg/mL.
- Coprire la piastra con un coperchio adesivo e incubare la piastra durante la notte a 4°C.
- Dopo l'incubazione, rimuovere la soluzione di antigene non legato dai pozzetti facendo scorrere la piastra su un lavandino.
Inceppamento
- Bloccare i restanti siti di legame proteico nei pozzi rivestiti aggiungendo 200 μL di tampone bloccante a ciascun pozzo, che può essere il 5% di latte secco non grasso o BSA in PBS.
- Incubare la piastra per almeno 2 ore a temperatura ambiente o durante la notte a 4°C.
Campione di incubazione (antigene) con l'anticorpo primario
- Mentre si bloccano i pozzezze, preparare la miscela antigene-anticorpo mescolando 150 μL di antigene campione e 150 μL di anticorpo primario per ciascun pozzeggio nel test.
- Incubare questa miscela per 1 ora a 37°C.
Aggiungere la miscela antigene-anticorpo al pozzo
- Ora, rimuovi il buffer di blocco dai pozzetti facendo scorrere la piastra su un lavandino.
- Quindi, lavare i pozzi con 1X PBS contenente Tween-20.
- Aggiungere 100 μL della miscela antigene-anticorpo primario campione.
- Incubare la piastra a 37°C per 1 ora.
- Rimuovere la miscela campione facendo scorrere la piastra su un lavandino.
- Quindi, lavare i pozzi con 1X PBS contenente l'1% di Tween-20 per rimuovere eventuali anticorpi non legati.
Aggiungere l'anticorpo secondario
- Aggiungere 100 μL di un anticorpo secondario coniugato enzimatico, che in questo caso è un anticorpo coniugato AP, a ciascun pozzo.
- Incubare la piastra per 1 ora a 37°C.
- Dopo l'incubazione, lavare la piastra con 1X PBS contenente l'1% di Tween-20.
Scoperta
- Aggiungere 100 μL della soluzione di substrato a ciascun pozzo.
- Attendere 5-10 min.
- Dopo 10 minuti, interrompere la reazione enzimatica aggiungendo 100 μL di acido solforico 2N ai pozzi. Quindi, misurare l'assorbanza in un lettore di micropiasse entro 30 minuti dall'aggiunta della soluzione di arresto
Il saggio di immunoassorbimento enzimatico, o ELISA, è un test quantitativo altamente sensibile comunemente utilizzato per misurare la concentrazione di un analita come citochine e anticorpi in un campione biologico. Il principio generale di questo test prevede tre fasi: l'inizio con la cattura, o immobilizzazione, dell'analita bersaglio su una micropiastra, seguita dalla rilevazione dell'analita da parte di proteine di rilevamento specifiche del bersaglio e, infine, la reazione enzimatica, in cui un enzima coniugato converte il suo substrato in un prodotto colorato. Basato su diversi metodi di acquisizione e rilevamento, l'ELISA può essere di quattro tipi: diretto, indiretto, a sandwich e competitivo.
Per l'ELISA diretto, l'antigene bersaglio viene prima legato alla piastra e quindi rilevato da uno specifico anticorpo di rilevazione. Questo metodo è comunemente usato per lo screening degli anticorpi per un antigene specifico. L'ELISA indiretto viene utilizzato per rilevare gli anticorpi in un campione al fine di quantificare le risposte immunitarie. La piastra viene prima rivestita con uno specifico antigene di cattura, che immobilizza l'anticorpo bersaglio, e questo complesso antigene-anticorpo viene quindi rilevato utilizzando un secondo anticorpo.
Nel caso dell'ELISA a sandwich, l'analita bersaglio è un antigene, che viene catturato sulla piastra utilizzando un anticorpo di cattura e quindi rilevato dall'anticorpo di rilevamento, formando così un sandwich anticorpo-antigene-anticorpo. Questo metodo è utile per misurare la concentrazione di un antigene in un campione misto.
L'ELISA competitivo viene utilizzato quando è disponibile un solo anticorpo per un antigene bersaglio di interesse. La piastra viene prima rivestita con l'antigene purificato. Nel frattempo, il campione contenente l'antigene viene pre-incubato con l'anticorpo e quindi aggiunto alla piastra, per consentire alle molecole di anticorpi libere di legarsi all'antigene immobilizzato. Più alto è il segnale dalla piastra, minore è la concentrazione di antigene nel campione. In tutti e quattro i tipi di ELISA, diretto, indiretto, a sandwich e competitivo, l'anticorpo di rilevamento è direttamente coniugato all'enzima o può essere indirettamente collegato ad esso attraverso un altro anticorpo o proteina.
Gli enzimi comunemente utilizzati per la reazione sono la perossidasi di rafano o la fosfatasi alcalina con i rispettivi substrati, entrambi producono un prodotto solubile e colorato che può essere misurato e quantificato utilizzando un lettore di piastre. In questo video, osserverai come eseguire ELISA indiretto, ELISA a sandwich ed ELISA competitivo, seguito da esempi di quantificazione dell'analita target dai metodi ELISA indiretto e a sandwich.
Il primo esperimento dimostrerà come utilizzare l'ELISA indiretto per determinare la presenza di anticorpi anti-virus influenzali nel siero ottenuto da topi infetti da influenza.
Per iniziare, aggiungere 50 microlitri di antigene purificato - in questo caso, 2 milligrammi per millilitro di virus dell'influenza A A/PR/8 purificato - a ciascun pozzetto di una piastra ELISA a 96 pozzetti. Quindi, coprire la piastra con un coperchio adesivo e incubarla per una notte a 4 gradi Celsius per consentire all'antigene di legarsi alla piastra. Il giorno seguente, rimuovere la soluzione di rivestimento facendo scorrere la piastra su un lavandino. Quindi, bloccare i restanti siti di legame proteico nei pozzetti rivestiti aggiungendo 200 microlitri di un tampone bloccante - qui, il 5% di siero d'asina in 1X PBS - a ciascun pozzetto. Lasciare incubare la piastra per almeno 2 ore a temperatura ambiente. Dopo l'incubazione, rimuovere il tampone bloccante e quindi lavare la piastra aggiungendo 200 microlitri di 1X PBS contenente l'1% di Tween-20. Sposta ancora una volta la piastra sul lavandino per rimuovere il bucato.
Quindi, preparare i campioni di prova aggiungendo 460 microlitri di PBS a una provetta nuova, quindi aggiungendo 40 microlitri di siero per ottenere una diluizione da 1 a 12,5. Quindi, aggiungere 300 microlitri di PBS in un secondo tubo, quindi aggiungere 100 microlitri della prima diluizione. Continuare questo intervallo di diluizione seriale fino ad ottenere un campione finale con una diluizione da 1 a 204.800. Aggiungere i campioni di siero diluiti in serie in triplicato ai pozzetti. Coprire la piastra con un coperchio adesivo e incubare a temperatura ambiente per un'ora. Quindi, rimuovere i campioni inserendo la piastra nel lavandino e quindi lavare la piastra aggiungendo 200 microlitri di 1X PBS contenente l'1% di Tween-20. Ancora una volta, muovi la piastra per rimuovere il lavaggio.
Ora, aggiungi 100 microlitri di un anticorpo secondario coniugato con un enzima, che in questo esperimento è una perossidasi di rafano, o HRP, asino coniugato anti-topo secondario, a ciascun pozzetto. Incubare la piastra per un'ora a temperatura ambiente e agitare la piastra per rimuovere il liquido in eccesso. Lavare la piastra con 1X PBS contenente l'1% di Tween-20 e quindi applicare 100 microlitri del substrato indicatore a una concentrazione di un milligrammo per millilitro su ciascun pozzetto. Incubare la piastra con il substrato per 5-10 minuti a temperatura ambiente. In questo esempio, il substrato incolore 3,3', 5,5' - tetrametilbenzidina, o TMB, assume un colore blu quando è presente HRP. Dopo 10 minuti, interrompere la reazione enzimatica aggiungendo 100 microlitri di acido solforico 2N. I campioni diventeranno di colore giallo.
Entro 30 minuti dall'aggiunta della soluzione di arresto, inserire la piastra in un lettore di micropiastre e leggere la piastra alla lunghezza d'onda appropriata per il substrato per determinare l'assorbanza dei pozzetti.
Per iniziare l'ELISA a sandwich, la piastra deve essere rivestita con anticorpi di cattura purificati. Per fare ciò, aggiungere 100 microlitri di anticorpo di cattura a una concentrazione compresa tra 1 e 10 microgrammi per millilitro, a ciascun pozzetto di una piastra ELISA a 96 pozzetti. Quindi, coprire la piastra con un coperchio adesivo e quindi incubare la piastra per una notte a 4 gradi Celsius. Dopo l'incubazione, rimuovere la soluzione di rivestimento facendo scorrere la piastra su un lavandino.
Ora, bloccare i restanti siti di legame delle proteine nei pozzetti rivestiti aggiungendo 200 microlitri di latte secco scremato al 5% ai pozzetti. Incubare la piastra a temperatura ambiente per almeno 2 ore. Quindi, rimuovere il tampone di blocco, quindi lavare i pozzetti con 1X PBS contenente l'1% di Tween-20. Rimuovere il lavaggio facendo scorrere la piastra sul lavandino. Ora, aggiungi 100 microlitri del campione di prova ai pozzetti, sigilla la piastra con un coperchio adesivo e poi incubala a temperatura ambiente per 2 ore. Dopo l'incubazione, rimuovere i campioni facendo scorrere la piastra sul lavandino e quindi lavare i pozzetti con 200 microlitri di 1X PBS contenente l'1% di Tween-20. Passare la piastra sopra il lavandino per rimuovere il lavaggio e quindi aggiungere 100 microlitri di anticorpo di rilevamento coniugato con enzimi ai pozzetti.
Sigillare la piastra con un coperchio adesivo. Lasciare incubare la piastra a temperatura ambiente per 2 ore. Dopo l'incubazione, rimuovere l'anticorpo di rilevamento non legato facendo scorrere la piastra su un lavandino e lavare i pozzetti con 200 microlitri di 1X PBS contenente l'1% di Tween-20. Quindi, aggiungere 100 microlitri del substrato indicatore a una concentrazione di 1 milligrammo per millilitro e incubare la piastra per 5-10 minuti a temperatura ambiente. Dopo 10 minuti, arrestare la reazione enzimatica aggiungendo 100 microlitri di acido solforico 2N ai pozzetti e quindi leggere la piastra entro 30 minuti dall'aggiunta della soluzione di arresto in un lettore di micropiastre.
Per eseguire un ELISA competitivo, rivestire prima i pozzetti di una piastra ELISA a 96 pozzetti con 100 microlitri di antigene purificato a una concentrazione di 1-10 microgrammi per millilitro. Coprire la piastra con un coperchio adesivo e poi incubare per una notte a 4 gradi Celsius. Successivamente, rimuovere la soluzione di antigene non legato dai pozzetti facendo scorrere la piastra su un lavandino.
Quindi, bloccare i restanti siti di legame proteico nei pozzetti rivestiti aggiungendo 200 microlitri di tampone bloccante a ciascun pozzetto, in questo caso, il 5% di latte in polvere scremato in PBS. Incubare la piastra per almeno 2 ore a temperatura ambiente. Mentre ostruisce i pozzetti, preparare la miscela antigene-anticorpo in una miscela 1. Provetta da 5 millilitri aggiungendo 150 microlitri di antigene del campione a 150 microlitri di anticorpi primari per ogni pozzetto del saggio. Incubare questa miscela per 1 ora a 37 gradi Celsius. Ora, rimuovi il tampone di blocco dai pozzetti facendo scorrere la piastra su un lavandino. Quindi, lavare i pozzetti con 1X PBS contenente Tween 20 e quindi aggiungere 100 microlitri della miscela antigene-anticorpo primario del campione.
Lasciare incubare la piastra a 37 gradi Celsius per un'ora. Quindi, rimuovere la miscela campione facendo scorrere la piastra su un lavandino e quindi lavare i pozzetti con 1X PBS contenente l'1% di Tween-20 per rimuovere eventuali anticorpi non legati. Aggiungere 100 microlitri di un anticorpo secondario coniugato con un enzima a ciascun pozzetto e incubare la piastra per un'ora a 37 gradi Celsius. Successivamente, lavare la piastra con 1X PBS contenente l'1% di Tween-20 e quindi aggiungere 100 microlitri della soluzione di substrato a ciascun pozzetto. Attendere 5-10 minuti. Dopo 10 minuti, interrompere la reazione enzimatica aggiungendo 100 microlitri di acido solforico 2N e quindi misurare l'assorbanza in un lettore di micropiastre entro 30 minuti dall'aggiunta della soluzione di arresto.
Per il test ELISA indiretto semiquantitativo, la presenza di anticorpi del virus dell'influenza A in campioni diluiti in serie di siero di topi infetti con influenza A è stata determinata leggendo l'assorbanza di ciascun pozzetto a 405 nanometri in un lettore di piastre. Questi dati grezzi vengono esportati in un foglio di calcolo a scopo di calcolo. In questo esperimento, i campioni di siero diluiti in serie, che vanno da 1 a 12,5 a 1 a 204.800, sono stati ripetuti in triplicato.
Per analizzare i dati, il valore medio di assorbanza viene quindi calcolato per ogni serie di triplicati sommando tutti i valori per ogni diluizione e dividendo la somma per 3. Una volta determinata la media per ogni serie di triplicati, le letture medie di OD450 vengono confrontate con le diluizioni seriali. Le letture OD diminuiscono man mano che il siero viene diluito, indicando che si trovano meno anticorpi nei campioni più diluiti. Nell'ELISA a sandwich quantitativo, le diluizioni di TNFalfa umano standard, in questo caso ricombinato, sono state aggiunte a una piastra a 96 pozzetti e lette insieme ai campioni sconosciuti.
Per creare la curva standard, è stato calcolato il valore medio di assorbanza per ogni serie di letture delle concentrazioni note. Quindi, il valore medio di assorbanza è stato tracciato sull'asse y, rispetto alle concentrazioni proteiche note sull'asse x. Una curva di adattamento viene aggiunta attraverso i punti nel grafico.
Una volta generata la curva standard, la quantità di proteina TNFalfa nel campione di prova può essere determinata calcolando prima il valore medio di assorbanza per il campione di prova. In questo esempio, i campioni di prova hanno fornito letture OD450 di 0,636 e 0. 681. Sommando questi valori e dividendo la somma per 2 si ottiene una media di 0,659. Dall'asse y sul grafico della curva standard, estendere una linea orizzontale da questo valore di assorbanza alla curva standard. Nel punto di intersezione, estendere una linea verticale fino all'asse x e leggere la concentrazione corrispondente che, in questo campione di prova, corrisponde a una concentrazione di TNFalfa di 38,72 picogrammi per millilitro.
Q1: What are the three main steps in an ELISA assay?
ELISA involves three sequential steps: capture or immobilization of the target analyte on a microplate, detection of the analyte using target-specific detection proteins, and enzyme reaction where a conjugated enzyme converts its substrate to a colored product. This three-step process forms the foundation for all ELISA variants, enabling sensitive quantification of biomolecules in biological samples.
Q2: How does indirect ELISA differ from sandwich ELISA?
Indirect ELISA coats the plate with a specific capture antigen to detect antibodies in a sample, measuring immune responses. Sandwich ELISA uses a capture antibody to coat the plate and detects antigens sandwiched between capture and detection antibodies. Sandwich ELISA is better suited for analyzing complex samples like tissue culture supernatants where the antigen is part of a mixed sample.
Q3: When should competitive ELISA be used instead of other ELISA types?
Competitive ELISA is used when only one antibody is available for a target antigen or when detecting small antigens with a single epitope that cannot accommodate two different antibodies due to steric hindrance. The plate is coated with purified antigen, and higher signal indicates lower antigen concentration in the sample, creating an inverse relationship.
Q4: What enzymes are commonly used in ELISA and what do they do?
Horseradish peroxidase (HRP) and alkaline phosphatase (AP) are the most common enzymes conjugated to antibodies in ELISA. These enzymes convert colorless substrates into soluble, colored products that can be measured and quantified using a plate reader, enabling detection and quantification of antigen-antibody complexes.
Q5: How is a standard curve created and used in sandwich ELISA?
A standard curve is generated by adding known concentrations of purified recombinant protein to designated wells and processing them alongside test samples. Mean absorbance values for known concentrations are plotted on the y-axis against protein concentrations on the x-axis. Test sample absorbance values are then compared to this curve to determine the unknown antigen concentration in the sample.
Q6: Why is blocking an important step in ELISA protocols?
Blocking prevents non-specific binding of antibodies and proteins to empty sites on the microplate. After coating the plate with antigen or antibody, blocking buffer fills remaining protein-binding sites, reducing background signal and improving assay specificity. This step ensures that only target-specific interactions are detected.
Q7: What information does serial dilution provide in indirect ELISA analysis?
Serial dilution of serum samples reveals antibody concentration patterns by showing how absorbance decreases as samples become more diluted. When mean absorbance values from serially diluted samples are plotted against dilution factors, the resulting curve demonstrates that less antibody is present in more diluted samples, enabling semi-quantitative assessment of immune response.
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