Saggi ELISA: indiretti, sandwich e competitivi

1. ELISA indiretto

Un ELISA indiretto è quello in cui l'anticorpo antigene antigene-specifico primario è riconosciuto da un anticorpo coniugato secondario. Il seguente protocollo è un esempio di metodo ELISA indiretto, in cui i campioni di siero di topi infetti da virus dell'influenza A (IAV) vengono testati per la presenza di anticorpi IgG specifici per IAV. Un punto di forza di questo esempio è che possono essere utilizzati diversi anticorpi secondari che riconoscono tutti gli isotipi anticorpali o isotipi specifici (ad esempio, IgG).

Antigene di rivestimento alla micropiastra

1. Rivestire i pozzetti di una piastra ELISA a 96 pozzetti con antigene purificato pipettando 50 μL di antigene purificato (2 mg/mL di virus A dell'influenza A A/PR/8 purificato in tampone Tris-HCl da 0,05 M (pH 9,5)) in ciascun pozzettino della piastra.
2. Coprire la piastra con un coperchio adesivo e incubarla durante la notte a 4°C per consentire all'antigene di legarsi alla piastra.
3. Al termine dell'incubazione, rimuovere la soluzione di rivestimento facendo scorrere la piastra su un lavandino.

Inceppamento

4. Blocca i restanti siti di legame proteico nei pozzi rivestiti aggiungendo un tampone di blocco da 200 μL, qui viene utilizzato il siero d'asino al 5% in 1X PBS, per pozzo. I reagenti bloccanti alternativi includono il 5% di latte secco non grasso o BSA in PBS o siero normale da un animale in cui è stato generato l'anticorpo secondario.
5. Incubare per almeno 2 ore a temperatura ambiente o durante la notte a 4°C.
6. Dopo l'incubazione, rimuovere il tampone di blocco facendo scorrere la piastra e quindi lavare la piastra con PBS contenente l'1% di Tween-20.

Incubazione con l'anticorpo primario

7. Preparare una diluizione seriale del campione di siero, che contiene l'anticorpo primario, per ottenere un intervallo di diluizione da 1 a 204.800, utilizzando 1X PBS. Per fare ciò, prima diluire il siero 1:12.5 e quindi eseguire una diluizione 4X (intervallo di diluizione - da 1:12,5 a 1:204.800).
8. Aggiungere 100 μL dei campioni di siero diluiti in serie ai pozzi.
9. Coprire la piastra con coperchio adesivo e incubare a temperatura ambiente per 1-2 ore.
10. Dopo l'incubazione, far scorrere la piastra su un lavandino e lavare la piastra con PBS contenente l'1% di Tween-20.

Incubazione con l'anticorpo secondario

11. Aggiungere 100 μL di un anticorpo secondario coniugato con enzima, perossidasi di rafano, asino coniugato HRP anti-topo secondario in questo esperimento, a ciascun pozzo.
12. Incubare la piastra per 1 ora a temperatura ambiente.
13. Dopo l'incubazione, far scorrere la piastra su un lavandino e quindi lavare la piastra con PBS contenente l'1% di Tween-20.

Scoperta

14. Aggiungere 100 μL del substrato indicatore (3,3',5,5'-tetrametilbenzidina (TMB)) ad una concentrazione di 1 mg/mL a ciascun pozzettino.
15. Incubare la piastra con il substrato per 5-10 minuti a temperatura ambiente.
16. Dopo 10 min, interrompere la reazione enzimatica aggiungendo 100 μL 2N acido solforico (H₂SO₄).
    Entro 30 minuti dall'aggiunta della soluzione di arresto, leggere la piastra utilizzando un lettore di micropiasse a 405 nm per determinare l'assorbanza dei pozzetti.

2. Sandwich ELISA

In questa versione ELISA, il campione sperimentale è "inserito" tra un anticorpo di cattura non coniugato e un anticorpo di rilevamento coniugato, entrambi specifici per la stessa proteina ma a epitopi diversi. Nel seguente esempio di ELISA sandwich, la concentrazione di TNFα umano è stata determinata in un campione sconosciuto utilizzando una curva standard generata dalla diluizione seriale 2,5X di un TNFα umano ricombinante standard noto (che indica una concentrazione di 75 pg / mL).

Anticorpo di cattura del rivestimento alla micropiastra

1. Rivestire i pozzetti di una piastra ELISA a 96 pozzetti con anticorpo di cattura purificato aggiungendo 100 μL di anticorpo di cattura (intervallo 1-10 μg/mL) a ciascun pozzettino della piastra.
2. Coprire la piastra con un coperchio adesivo e incubarla durante la notte a 4°C.
3. Dopo l'incubazione, rimuovere la soluzione di rivestimento dalla piastra facendo scorrere la piastra su un lavandino.

Inceppamento

4. Bloccare i restanti siti di legame proteico nei pozzi rivestiti di anticorpi aggiungendo 200 μL di soluzione bloccante, 5% di latte secco non grasso contenente PBS, ai pozzi.
5. Incubare per almeno 2 ore a temperatura ambiente o durante la notte a 4°C.
6. Dopo l'incubazione, rimuovere il tampone di blocco facendo scorrere la piastra e quindi lavare la piastra con PBS contenente l'1% di Tween-20.

Aggiungere campioni di antigene contenenti campioni di prova

7. Aggiungere 100 μL del campione di prova ai pozzi. Sigillare la piastra con un coperchio adesivo.
8. Incubare per 1-2 ore a temperatura ambiente o durante la notte a 4°C.
9. Dopo l'incubazione, rimuovere i campioni facendo scorrere la piastra sul lavandino e quindi lavare i fori con 200 μL 1X PBS contenente l'1% di Tween-20.

Aggiungi anticorpo di rilevamento coniugato con enzima

10. Aggiungere 100 μL di anticorpo di rilevamento coniugato con enzimi ai pozzetti a una concentrazione preottimizzata.
11. Sigillare la piastra con un coperchio adesivo e incubare a temperatura ambiente per 2 ore.
12. Rimuovere l'anticorpo di rilevamento non legato facendo scorrere la piastra su un lavandino e lavare i pozzetti con 200 μL 1X PBS contenente l'1% di Tween-20.

Scoperta

13. Aggiungere 100 μL del substrato indicatore ad una concentrazione di 1 mg/mL. Qualsiasi anticorpo di rilevamento coniugato enzimatico legato convertirà il substrato in un segnale rilevabile.
14. Incubare la piastra per 5-10 minuti a temperatura ambiente.
15. Dopo 5-10 minuti, interrompere la reazione enzimatica aggiungendo 100 μL 2N H₂SO₄ ai pozzi. Entro 30 minuti dall'aggiunta della soluzione di arresto, leggere la piastra utilizzando un lettore di micropiasse per determinare l'assorbanza dei pozzetti.

3. ELISA competitivo

Le fasi di un ELISA competitivo sono diverse da quelle utilizzate nell'ELISA indiretto e sandwich, con la differenza principale che è la fase di legame competitivo tra l'antigene campione e l'antigene "add-in". L'antigene campione viene incubato con l'anticorpo primario non etichettato. Questi complessi anticorpo-antigene vengono quindi aggiunti alla piastra ELISA, che è stata pre-rivestita con lo stesso antigene. Dopo un periodo di incubazione, qualsiasi anticorpo non legato viene lavato via. Esiste una correlazione inversa tra la quantità di anticorpi liberi disponibili per legare l'antigene nel pozzo e la quantità di antigene nel campione originale. Ad esempio, un campione con antigene abbondante avrebbe più complessi di anticorpi antigene-primari, lasciando pochi anticorpi non legati per legarsi alla piastra ELISA. Un anticorpo secondario coniugato con enzimi specifico per l'anticorpo primario viene quindi aggiunto ai pozzi, seguito dal substrato.

Antigene di rivestimento alla micropiastra

1. Rivestire i pozzetti di una piastra ELISA a 96 pozzetti con 100 μL di antigene purificato ad una concentrazione di 1-10 μg/mL.
2. Coprire la piastra con un coperchio adesivo e incubare la piastra durante la notte a 4°C.
3. Dopo l'incubazione, rimuovere la soluzione di antigene non legato dai pozzetti facendo scorrere la piastra su un lavandino.

Inceppamento

4. Bloccare i restanti siti di legame proteico nei pozzi rivestiti aggiungendo 200 μL di tampone bloccante a ciascun pozzo, che può essere il 5% di latte secco non grasso o BSA in PBS.
5. Incubare la piastra per almeno 2 ore a temperatura ambiente o durante la notte a 4°C.

Campione di incubazione (antigene) con l'anticorpo primario

6. Mentre si bloccano i pozzezze, preparare la miscela antigene-anticorpo mescolando 150 μL di antigene campione e 150 μL di anticorpo primario per ciascun pozzeggio nel test.
7. Incubare questa miscela per 1 ora a 37°C.

Aggiungere la miscela antigene-anticorpo al pozzo

8. Ora, rimuovi il buffer di blocco dai pozzetti facendo scorrere la piastra su un lavandino.
9. Quindi, lavare i pozzi con 1X PBS contenente Tween-20.
10. Aggiungere 100 μL della miscela antigene-anticorpo primario campione.
11. Incubare la piastra a 37°C per 1 ora.
12. Rimuovere la miscela campione facendo scorrere la piastra su un lavandino.
13. Quindi, lavare i pozzi con 1X PBS contenente l'1% di Tween-20 per rimuovere eventuali anticorpi non legati.

Aggiungere l'anticorpo secondario

14. Aggiungere 100 μL di un anticorpo secondario coniugato enzimatico, che in questo caso è un anticorpo coniugato AP, a ciascun pozzo.
15. Incubare la piastra per 1 ora a 37°C.
16. Dopo l'incubazione, lavare la piastra con 1X PBS contenente l'1% di Tween-20.

Scoperta

17. Aggiungere 100 μL della soluzione di substrato a ciascun pozzo.
18. Attendere 5-10 min.
19. Dopo 10 minuti, interrompere la reazione enzimatica aggiungendo 100 μL di acido solforico 2N ai pozzi. Quindi, misurare l'assorbanza in un lettore di micropiasse entro 30 minuti dall'aggiunta della soluzione di arresto