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Saggi ELISA: indiretti, sandwich e competitivi

ELISA Assays: Indirect, Sandwich, and Competitive

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Immunology

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ELISA Assays: Indirect, Sandwich, and Competitive

5.2: Magnetic Activated Cell Sorting (MACS): Isolation of Thymic T Lymphocytes

5.4: ELISPOT Assay: Detection of IFN-γ Secreting Splenocytes

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14:22 min

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April 30, 2023

Overview

Fonte: Whitney Swanson^1,2, Frances V. Sjaastad^2,3e Thomas S. Griffith^1,2,3,4
¹ Dipartimento di Urologia, Università del Minnesota, Minneapolis, MN 55455
² Centro di Immunologia, Università del Minnesota, Minneapolis, MN 55455
³ Programma di laurea in microbiologia, immunologia e biologia del cancro, Università del Minnesota, Minneapolis, MN 55455
⁴ Masonic Cancer Center, Università del Minnesota, Minneapolis, MN 55455

Il saggio di immunoassorbimento enzimatico (ELISA) viene spesso utilizzato per misurare la presenza e/o la concentrazione di un antigene, anticorpo, peptide, proteina, ormone o altra biomolecola in un campione biologico. È estremamente sensibile, in grado di rilevare basse concentrazioni di antigene. La sensibilità di ELISA è attribuita alla sua capacità di rilevare le interazioni tra un singolo complesso antigene-anticorpo (1). Inoltre, l’inclusione di un anticorpo antigene-specifico coniugato enzimatico consente la conversione di un substrato incolore in un prodotto cromogenico o fluorescente che può essere rilevato e facilmente quantificato da un lettore di piastre. Se confrontati con i valori generati dalle quantità titolate di un antigene noto di interesse, è possibile determinare la concentrazione dello stesso antigene nei campioni sperimentali. Diversi protocolli ELISA sono stati adattati per misurare le concentrazioni di antigene in una varietà di campioni sperimentali, ma tutti hanno lo stesso concetto di base (2). La scelta del tipo di ELISA da eseguire, indiretto, sandwich o competitivo, dipende da una serie di fattori, tra cui la complessità dei campioni da testare e gli anticorpi antigene-specifici disponibili per l’uso. L’ELISA indiretto viene spesso utilizzato per determinare l’esito di una risposta immunologica, come la misurazione della concentrazione di un anticorpo in un campione. L’ELISA sandwich è più adatto per l’analisi di campioni complessi, come supernatanti di coltura tissutale o lasasità tissutale, in cui l’analita, o antigene di interesse, fa parte di un campione misto. Infine, l’ELISA competitivo viene spesso utilizzato quando è disponibile un solo anticorpo per rilevare l’antigene di interesse. Gli ELISA competitivi sono anche utili per rilevare un piccolo antigene con un solo epitopo anticorpale che non può ospitare due anticorpi diversi a causa dell’ostacolo sterico. Il protocollo descriverà le procedure di base per i test ELISA indiretti, sandwich e competitivi.

Il saggio ELISA indiretto è comunemente usato per misurare la quantità di anticorpi nel siero o nel surnatante di una coltura di ibridoma. La procedura generale per il saggio ELISA indiretto è:

Rivestire i pozzezze con antigeni
Aggiungere siero o surnatante contenente surnatante di coltura di siero o ibridoma (anticorpo primario o 1°)
Incubare e lavare
Aggiungere un anticorpo secondario (o 2°) coniugato con enzimi
Incubare e lavare
Aggiungi substrato

Il test ELISA sandwich differisce dal test ELISA indiretto in quanto il metodo non prevede il rivestimento delle piastre con un antigene purificato. Invece, un anticorpo “cattura” viene utilizzato per rivestire i pozzetti della piastra. L’antigene è “inserito” tra l’anticorpo di cattura e un secondo anticorpo coniugato enzimatico “di rilevamento” – dove entrambi gli anticorpi sono specifici per lo stesso antigene, ma a epitopi diversi (3). Legandosi al complesso anticorpo/antigene di cattura, l’anticorpo di rilevamento rimane nella piastra. Gli anticorpi monoclonali o gli antisieri policlonali possono essere utilizzati come anticorpi di cattura e rilevamento. Il vantaggio principale del sandwich ELISA è che il campione non deve essere purificato prima dell’analisi. Inoltre, il test può essere abbastanza sensibile (4). Molti kit ELISA disponibili in commercio sono della varietà sandwich e utilizzano coppie di anticorpi testati e abbinati. La procedura generale per il test ELISA sandwich è:

Coat pozzi con anticorpo di cattura
Aggiungere campioni di prova contenenti antigene
Incubare e lavare
Aggiungere anticorpi di rilevamento coniugati con enzimi.
Incubare e lavare
Aggiungi substrato

La maggior parte dei kit ELISA sandwich disponibili in commercio sono dotati di anticorpi di rilevamento coniugati con enzimi. Nei casi in cui non è disponibile un anticorpo di rilevazione coniugato con enzima, può essere utilizzato un anticorpo secondario coniugato con enzima specifico per l’anticorpo di rilevamento. L’enzima sull’anticorpo secondario svolge lo stesso ruolo, che è quello di convertire il substrato incolore in un prodotto cromogenico o fluorescente. Il suddetto anticorpo secondario coniugato con enzima vorrebbe più essere utilizzato in un ELISA sandwich “fatto in casa” sviluppato da un investigatore che ha generato i propri anticorpi monoclonali, per esempio. Uno svantaggio dell’utilizzo di un anticorpo secondario coniugato con enzima è quello di essere sicuri che si leghi solo all’anticorpo di rilevamento e non all’anticorpo di cattura legato alla piastra. Ciò si tradurrebbe in un prodotto misurabile in tutti i pozzi, indipendentemente dalla presenza o dall’assenza di antigene o anticorpo di rilevamento.

Infine, il test ELISA competitivo viene utilizzato per rilevare antigeni solubili. È semplice da eseguire, ma è adatto solo quando l’antigene purificato è disponibile in una quantità relativamente grande. La procedura generale per il test ELISA competitivo è:

Rivestire i pozzezze con antigene
Incubare e lavare
Campione di prova preincubato con anticorpi primari coniugati con enzimi
Aggiungere bene la miscela
Incubare e lavare via qualsiasi anticorpo primario coniugato con enzimi non legati
Aggiungi substrato

La “competizione” in questo test deriva dal fatto che più antigene nel campione di prova utilizzato nella fase 3 si tradurrà in meno anticorpi disponibili per legarsi all’antigene che riveste il pozzo. Pertanto, l’intensità del prodotto cromogenico/fluorogenico nel pozzo alla fine del test è inversamente correlata alla quantità di antigene presente nel campione di prova.

Un componente chiave in qualsiasi tipo di ELISA sono gli standard titolati di concentrazioni note che consentiranno all’utente di determinare la concentrazione di antigene presente nei campioni di prova. Tipicamente, una serie di pozzi sono designati per la creazione di una curva standard, in cui quantità note di una proteina ricombinante purificata vengono aggiunte ai pozzetto in quantità decrescenti. Quando questi pozzetto vengono elaborati contemporaneamente ai campioni di prova, l’utente può quindi avere un set di riferimento di valori di assorbanza ottenuti da un lettore di micropiasche per le concentrazioni proteiche note da associare ai valori di assorbanza per i campioni di prova. L’utente può quindi calcolare una curva standard a cui è possibile confrontare i campioni di prova per determinare la quantità di proteina di interesse presente. La curva standard può anche determinare il grado di precisione della diluizione dell’utente.

Infine, l’ultimo passaggio in ciascuno dei tipi ELISA sopra elencati richiede l’aggiunta di un substrato. Il grado di conversione del substrato in prodotto è direttamente correlato alla quantità di enzima presente nel pozzo. La perossidasi di rafano (HRP) e la fosfatasi alcalina (AP) sono gli enzimi più comuni coniugati agli anticorpi. Come previsto, ci sono un certo numero di substrati disponibili specifici per entrambi gli enzimi che producono un prodotto cromogenico o fluorescente. Inoltre, i substrati sono disponibili in una gamma di sensibilità che possono aumentare la sensibilità complessiva del test. L’utente deve anche prendere in considerazione il tipo di strumentazione disponibile per la lettura della piastra alla fine dell’esperimento quando sceglie il tipo di substrato da utilizzare, insieme al corrispondente anticorpo coniugato con enzima.

I substrati cromogenici comunemente usati per l’HRP includono 2,2′-Azinobis [3-ethylbenzothiazoline-6-sulfonic acid]-diammonium salt (ABTS) e 3,3′,5,5′-tetramethylbenzidine (TMB), mentre p-Nitrophenyl Phosphate (PNPP) è usato per AP. ABTS e TMB producono rispettivamente prodotti di reazione di colore verde e blu solubili in acqua. Il prodotto ABTS verde ha due picchi di assorbanza principali, 410 e 650 nm, mentre il prodotto TMB blu è meglio rilevato a 370 e 652 nm. I colori di ABTS e TMB cambiano in giallo con l’aggiunta di una soluzione di arresto acido, che è meglio leggere a 450 nm. Lo sviluppo del colore per ABTS è lento, mentre è veloce per TMB. TMB è più sensibile di ABTS e può produrre un segnale di fondo più alto se la reazione enzimatica procede troppo a lungo. PNPP produce un prodotto solubile in acqua giallo dopo conversione AP che assorbe la luce a 405 nm.

Procedure

1. ELISA indiretto

Un ELISA indiretto è quello in cui l’anticorpo antigene antigene-specifico primario è riconosciuto da un anticorpo coniugato secondario. Il seguente protocollo è un esempio di metodo ELISA indiretto, in cui i campioni di siero di topi infetti da virus dell’influenza A (IAV) vengono testati per la presenza di anticorpi IgG specifici per IAV. Un punto di forza di questo esempio è che possono essere utilizzati diversi anticorpi secondari che riconoscono tutti gli isotipi anticorpali o isotipi specifici (ad esempio, IgG).

Antigene di rivestimento alla micropiastra

Rivestire i pozzetti di una piastra ELISA a 96 pozzetti con antigene purificato pipettando 50 μL di antigene purificato (2 mg/mL di virus A dell’influenza A A/PR/8 purificato in tampone Tris-HCl da 0,05 M (pH 9,5)) in ciascun pozzettino della piastra.
Coprire la piastra con un coperchio adesivo e incubarla durante la notte a 4°C per consentire all’antigene di legarsi alla piastra.
Al termine dell’incubazione, rimuovere la soluzione di rivestimento facendo scorrere la piastra su un lavandino.

Inceppamento

Blocca i restanti siti di legame proteico nei pozzi rivestiti aggiungendo un tampone di blocco da 200 μL, qui viene utilizzato il siero d’asino al 5% in 1X PBS, per pozzo. I reagenti bloccanti alternativi includono il 5% di latte secco non grasso o BSA in PBS o siero normale da un animale in cui è stato generato l’anticorpo secondario.
Incubare per almeno 2 ore a temperatura ambiente o durante la notte a 4°C.
Dopo l’incubazione, rimuovere il tampone di blocco facendo scorrere la piastra e quindi lavare la piastra con PBS contenente l’1% di Tween-20.

Incubazione con l’anticorpo primario

Preparare una diluizione seriale del campione di siero, che contiene l’anticorpo primario, per ottenere un intervallo di diluizione da 1 a 204.800, utilizzando 1X PBS. Per fare ciò, prima diluire il siero 1:12.5 e quindi eseguire una diluizione 4X (intervallo di diluizione – da 1:12,5 a 1:204.800).
Aggiungere 100 μL dei campioni di siero diluiti in serie ai pozzi.
Coprire la piastra con coperchio adesivo e incubare a temperatura ambiente per 1-2 ore.
Dopo l’incubazione, far scorrere la piastra su un lavandino e lavare la piastra con PBS contenente l’1% di Tween-20.

Incubazione con l’anticorpo secondario

Aggiungere 100 μL di un anticorpo secondario coniugato con enzima, perossidasi di rafano, asino coniugato HRP anti-topo secondario in questo esperimento, a ciascun pozzo.
Incubare la piastra per 1 ora a temperatura ambiente.
Dopo l’incubazione, far scorrere la piastra su un lavandino e quindi lavare la piastra con PBS contenente l’1% di Tween-20.

Scoperta

Aggiungere 100 μL del substrato indicatore (3,3′,5,5′-tetrametilbenzidina (TMB)) ad una concentrazione di 1 mg/mL a ciascun pozzettino.
Incubare la piastra con il substrato per 5-10 minuti a temperatura ambiente.
Dopo 10 min, interrompere la reazione enzimatica aggiungendo 100 μL 2N acido solforico (H₂SO₄).
Entro 30 minuti dall’aggiunta della soluzione di arresto, leggere la piastra utilizzando un lettore di micropiasse a 405 nm per determinare l’assorbanza dei pozzetti.

2. Sandwich ELISA

In questa versione ELISA, il campione sperimentale è “inserito” tra un anticorpo di cattura non coniugato e un anticorpo di rilevamento coniugato, entrambi specifici per la stessa proteina ma a epitopi diversi. Nel seguente esempio di ELISA sandwich, la concentrazione di TNFα umano è stata determinata in un campione sconosciuto utilizzando una curva standard generata dalla diluizione seriale 2,5X di un TNFα umano ricombinante standard noto (che indica una concentrazione di 75 pg / mL).

Anticorpo di cattura del rivestimento alla micropiastra

Rivestire i pozzetti di una piastra ELISA a 96 pozzetti con anticorpo di cattura purificato aggiungendo 100 μL di anticorpo di cattura (intervallo 1-10 μg/mL) a ciascun pozzettino della piastra.
Coprire la piastra con un coperchio adesivo e incubarla durante la notte a 4°C.
Dopo l’incubazione, rimuovere la soluzione di rivestimento dalla piastra facendo scorrere la piastra su un lavandino.

Inceppamento

Bloccare i restanti siti di legame proteico nei pozzi rivestiti di anticorpi aggiungendo 200 μL di soluzione bloccante, 5% di latte secco non grasso contenente PBS, ai pozzi.
Incubare per almeno 2 ore a temperatura ambiente o durante la notte a 4°C.
Dopo l’incubazione, rimuovere il tampone di blocco facendo scorrere la piastra e quindi lavare la piastra con PBS contenente l’1% di Tween-20.

Aggiungere campioni di antigene contenenti campioni di prova

Aggiungere 100 μL del campione di prova ai pozzi. Sigillare la piastra con un coperchio adesivo.
Incubare per 1-2 ore a temperatura ambiente o durante la notte a 4°C.
Dopo l’incubazione, rimuovere i campioni facendo scorrere la piastra sul lavandino e quindi lavare i fori con 200 μL 1X PBS contenente l’1% di Tween-20.

Aggiungi anticorpo di rilevamento coniugato con enzima

Aggiungere 100 μL di anticorpo di rilevamento coniugato con enzimi ai pozzetti a una concentrazione preottimizzata.
Sigillare la piastra con un coperchio adesivo e incubare a temperatura ambiente per 2 ore.
Rimuovere l’anticorpo di rilevamento non legato facendo scorrere la piastra su un lavandino e lavare i pozzetti con 200 μL 1X PBS contenente l’1% di Tween-20.

Scoperta

Aggiungere 100 μL del substrato indicatore ad una concentrazione di 1 mg/mL. Qualsiasi anticorpo di rilevamento coniugato enzimatico legato convertirà il substrato in un segnale rilevabile.
Incubare la piastra per 5-10 minuti a temperatura ambiente.
Dopo 5-10 minuti, interrompere la reazione enzimatica aggiungendo 100 μL 2N H₂SO₄ ai pozzi. Entro 30 minuti dall’aggiunta della soluzione di arresto, leggere la piastra utilizzando un lettore di micropiasse per determinare l’assorbanza dei pozzetti.

3. ELISA competitivo

Le fasi di un ELISA competitivo sono diverse da quelle utilizzate nell’ELISA indiretto e sandwich, con la differenza principale che è la fase di legame competitivo tra l’antigene campione e l’antigene “add-in”. L’antigene campione viene incubato con l’anticorpo primario non etichettato. Questi complessi anticorpo-antigene vengono quindi aggiunti alla piastra ELISA, che è stata pre-rivestita con lo stesso antigene. Dopo un periodo di incubazione, qualsiasi anticorpo non legato viene lavato via. Esiste una correlazione inversa tra la quantità di anticorpi liberi disponibili per legare l’antigene nel pozzo e la quantità di antigene nel campione originale. Ad esempio, un campione con antigene abbondante avrebbe più complessi di anticorpi antigene-primari, lasciando pochi anticorpi non legati per legarsi alla piastra ELISA. Un anticorpo secondario coniugato con enzimi specifico per l’anticorpo primario viene quindi aggiunto ai pozzi, seguito dal substrato.

Antigene di rivestimento alla micropiastra

Rivestire i pozzetti di una piastra ELISA a 96 pozzetti con 100 μL di antigene purificato ad una concentrazione di 1-10 μg/mL.
Coprire la piastra con un coperchio adesivo e incubare la piastra durante la notte a 4°C.
Dopo l’incubazione, rimuovere la soluzione di antigene non legato dai pozzetti facendo scorrere la piastra su un lavandino.

Inceppamento

Bloccare i restanti siti di legame proteico nei pozzi rivestiti aggiungendo 200 μL di tampone bloccante a ciascun pozzo, che può essere il 5% di latte secco non grasso o BSA in PBS.
Incubare la piastra per almeno 2 ore a temperatura ambiente o durante la notte a 4°C.

Campione di incubazione (antigene) con l’anticorpo primario

Mentre si bloccano i pozzezze, preparare la miscela antigene-anticorpo mescolando 150 μL di antigene campione e 150 μL di anticorpo primario per ciascun pozzeggio nel test.
Incubare questa miscela per 1 ora a 37°C.

Aggiungere la miscela antigene-anticorpo al pozzo

Ora, rimuovi il buffer di blocco dai pozzetti facendo scorrere la piastra su un lavandino.
Quindi, lavare i pozzi con 1X PBS contenente Tween-20.
Aggiungere 100 μL della miscela antigene-anticorpo primario campione.
Incubare la piastra a 37°C per 1 ora.
Rimuovere la miscela campione facendo scorrere la piastra su un lavandino.
Quindi, lavare i pozzi con 1X PBS contenente l’1% di Tween-20 per rimuovere eventuali anticorpi non legati.

Aggiungere l’anticorpo secondario

Aggiungere 100 μL di un anticorpo secondario coniugato enzimatico, che in questo caso è un anticorpo coniugato AP, a ciascun pozzo.
Incubare la piastra per 1 ora a 37°C.
Dopo l’incubazione, lavare la piastra con 1X PBS contenente l’1% di Tween-20.

Scoperta

Aggiungere 100 μL della soluzione di substrato a ciascun pozzo.
Attendere 5-10 min.
Dopo 10 minuti, interrompere la reazione enzimatica aggiungendo 100 μL di acido solforico 2N ai pozzi. Quindi, misurare l’assorbanza in un lettore di micropiasse entro 30 minuti dall’aggiunta della soluzione di arresto

Enzyme-linked Immunosorbent Assay, o ELISA è un test quantitativo altamente sensibile comunemente usato per misurare la concentrazione di un analita come citochine e anticorpi in un campione biologico. Il principio generale di questo test prevede tre fasi: a partire dalla cattura, o immobilizzazione, dell’analita bersaglio su una micro piastra, seguita dalla rilevazione dell’analita da parte di proteine di rilevamento target-specifiche e, infine, reazione enzimatica, in cui un enzima coniugato converte il suo substrato in un prodotto colorato. Basato su diversi metodi di acquisizione e rilevamento, ELISA può essere di quattro tipi: diretto, indiretto, sandwich e competitivo.

Per l’ELISA diretto, l’antigene bersaglio viene prima legato alla piastra e quindi rilevato da uno specifico anticorpo di rilevamento. Questo metodo è comunemente usato per lo screening degli anticorpi per un antigene specifico. L’ELISA indiretto viene utilizzato per rilevare gli anticorpi in un campione al fine di quantificare le risposte immunitarie. La piastra viene prima rivestita con uno specifico antigene di cattura, che immobilizza l’anticorpo bersaglio, e questo complesso antigene-anticorpo viene quindi rilevato utilizzando un secondo anticorpo.

Nel caso dell’ELISA sandwich, l’analita bersaglio è un antigene, che viene catturato sulla piastra utilizzando un anticorpo di cattura e quindi rilevato dall’anticorpo di rilevamento, formando quindi un sandwich anticorpo-antigene-anticorpo. Questo metodo è utile per misurare la concentrazione di un antigene in un campione misto.

L’ELISA competitivo viene utilizzato quando è disponibile un solo anticorpo per un antigene bersaglio di interesse. La piastra viene prima rivestita con l’antigene purificato. Nel frattempo, il campione contenente l’antigene viene pre-incubato con l’anticorpo e quindi aggiunto alla piastra, per consentire a qualsiasi molecola di anticorpo libero di legarsi all’antigene immobilizzato. Maggiore è il segnale dalla piastra, minore è la concentrazione di antigene nel campione. In tutti e quattro i tipi di ELISA, diretto, indiretto, sandwich e competitivo, l’anticorpo di rilevamento è direttamente coniugato all’enzima o può essere indirettamente collegato ad esso attraverso un altro anticorpo o proteina.

Gli enzimi comunemente usati per la reazione sono la perossidasi di rafano o la fosfatasi alcalina con i rispettivi substrati, entrambi producono un prodotto solubile e colorato che può essere misurato e quantificato utilizzando un lettore di piastre. In questo video, osserverai come eseguire ELISA indiretto, ELISA sandwich ed ELISA competitivo, seguito da esempi di quantificazione dell’analita target dai metodi ELISA indiretti e sandwich.

Il primo esperimento dimostrerà come utilizzare l’ELISA indiretto per determinare la presenza di anticorpi anti-virus influenzali nel siero ottenuto da topi infetti da influenza.

Per iniziare, aggiungere 50 microlitri di antigene purificato – in questo caso, 2 milligrammi per millilitro di virus A/ PR / 8 Influenza A purificato – a ciascun pozzetto di una piastra ELISA da 96 pozzetti. Quindi, coprire la piastra con una copertura adesiva e incubarla durante la notte a 4 gradi Celsius per consentire all’antigene di legarsi alla piastra. Il giorno seguente, rimuovere la soluzione di rivestimento facendo scorrere la piastra su un lavandino. Successivamente, blocca i restanti siti di legame proteico nei pozzetti rivestiti aggiungendo 200 microlitri di un tampone bloccante – qui, il 5% di siero d’asino in 1X PBS – a ciascun pozzetto. Lasciare incubare la piastra per almeno 2 ore a temperatura ambiente. Dopo l’incubazione, rimuovere il tampone di blocco e quindi lavare la piastra aggiungendo 200 microlitri di 1X PBS contenenti l’1% di Tween-20. Far scorrere nuovamente la piastra sul lavandino per rimuovere il lavaggio.

Quindi, preparare i campioni di prova aggiungendo 460 microlitri di PBS a un tubo fresco e quindi aggiungendo 40 microlitri di siero per effettuare una diluizione da 1 a 12,5. Quindi, aggiungere 300 microlitri di PBS a un secondo tubo, quindi aggiungere 100 microlitri della prima diluizione. Continuare questo intervallo di diluizione seriale fino ad ottenere un campione finale con una diluizione da 1 a 204.800. Aggiungere i campioni di siero diluiti in serie in triplice copia ai pozzi. Coprire la piastra con un coperchio adesivo e incubare a temperatura ambiente per un’ora. Quindi, rimuovere i campioni facendo scorrere la piastra nel lavandino e quindi lavare la piastra aggiungendo 200 microlitri di 1X PBS contenenti l’1% di Tween-20. Ancora una volta, scorrere la piastra per rimuovere il lavaggio.

Ora, aggiungi 100 microlitri di un anticorpo secondario coniugato con enzimi, che in questo esperimento è una perossidasi di rafano, o HRP, asino coniugato anti-topo secondario, a ciascun pozzetti. Incubare la piastra per un’ora a temperatura ambiente e far scorrere la piastra per rimuovere il liquido in eccesso. Lavare la piastra con 1X PBS contenente l’1% di Tween-20 e quindi applicare 100 microlitri del substrato indicatore ad una concentrazione di un milligrammo per millilitro su ciascun pozzetto. Incubare la piastra con il substrato per 5-10 minuti a temperatura ambiente. In questo esempio, il substrato incolore 3,3′, 5,5′ – tetrametilbenzidina, o TMB, diventa di un colore blu quando è presente HRP. Dopo 10 minuti, interrompere la reazione enzimatica aggiungendo 100 microlitri di acido solforico 2N. I campioni si trasformeranno in un colore giallo.

Entro 30 minuti dall’aggiunta della soluzione di arresto, inserire la piastra in un lettore di micropiasche e leggere la piastra alla lunghezza d’onda appropriata per il substrato per determinare l’assorbanza dei pozzetti.

Per iniziare il sandwich ELISA, la piastra deve essere rivestita con anticorpi di cattura purificati. Per fare ciò, aggiungere 100 microlitri dell’anticorpo di cattura ad una concentrazione all’interno dell’intervallo 1-10 microgrammi per millilitro, a ciascun pozzetto di una piastra ELISA a 96 pozzetti. Quindi, coprire la piastra con un coperchio adesivo e quindi incubare la piastra durante la notte a 4 gradi Celsius. Dopo l’incubazione, rimuovere la soluzione di rivestimento facendo scorrere la piastra su un lavandino.

Ora, blocca i restanti siti di legame proteico nei pozzi rivestiti aggiungendo 200 microlitri di latte secco non grasso al 5% ai pozzi. Incubare la piastra a temperatura ambiente per almeno 2 ore. Quindi, rimuovere il buffer di blocco, quindi lavare i fori con 1X PBS contenente l’1% di Tween-20. Rimuovere il lavaggio facendo scorrere la piastra sul lavandino. Ora, aggiungere 100 microlitri del campione di prova ai pozzi, sigillare la piastra con un coperchio adesivo e quindi incubarla a temperatura ambiente per 2 ore. Dopo l’incubazione, rimuovere i campioni facendo scorrere la piastra sul lavandino e quindi lavare i pozzi con 200 microlitri di 1X PBS contenente l’1% di Tween-20. Far scorrere la piastra sul lavandino per rimuovere il lavaggio e quindi aggiungere 100 microlitri di anticorpi di rilevamento coniugati con enzimi ai pozzi.

Sigillare la piastra con un coperchio adesivo. Lasciare incubare la piastra a temperatura ambiente per 2 ore. Dopo l’incubazione, rimuovere l’anticorpo di rilevamento non legato facendo scorrere la piastra su un lavandino e lavare i pozzetti con 200 microlitri di 1X PBS contenente l’1% di Tween-20. Quindi, aggiungere 100 microlitri del substrato indicatore ad una concentrazione di 1 milligrammo per millilitro e incubare la piastra per 5-10 minuti a temperatura ambiente. Dopo 10 minuti, interrompere la reazione enzimatica aggiungendo 100 microlitri di acido solforico 2N ai pozzetti e quindi leggere la piastra entro 30 minuti dall’aggiunta della soluzione di arresto in un lettore di micropiastre.

Per eseguire un ELISA competitivo, prima rivestire i pozzetti di una piastra ELISA a 96 pozzetti con 100 microlitri di antigene purificato ad una concentrazione di 1-10 microgrammi per millilitro. Coprire la piastra con un coperchio adesivo e quindi incubare durante la notte a 4 gradi Celsius. Successivamente, rimuovere la soluzione di antigene non legato dai pozzetti facendo scorrere la piastra su un lavandino.

Quindi, bloccare i restanti siti di legame proteico nei pozzi rivestiti aggiungendo 200 microlitri di tampone bloccante a ciascun pozzo – qui, il 5% di latte secco non grasso in PBS. Incubare la piastra per almeno 2 ore a temperatura ambiente. Mentre si bloccano i pozzezze, preparare la miscela antigene-anticorpo in un 1. Tubo da 5 millilitri aggiungendo 150 microlitri di antigene campione a 150 microlitri di anticorpo primario per ciascun pozzetto nel test. Incubare questa miscela per 1 ora a 37 gradi Celsius. Ora, rimuovi il buffer di blocco dai pozzetti facendo scorrere la piastra su un lavandino. Quindi, lavare i pozzeggi con 1X PBS contenente Tween 20 e quindi aggiungere 100 microlitri della miscela antigene-anticorpo primario campione.

Lasciare incubare la piastra a 37 gradi Celsius per un’ora. Quindi, rimuovere la miscela campione facendo scorrere la piastra su un lavandino e quindi lavare i pozzetti con 1X PBS contenente l’1% di Tween-20 per rimuovere eventuali anticorpi non legati. Aggiungere 100 microlitri di un anticorpo secondario coniugato con enzimi a ciascun pozzo e incubare la piastra per un’ora a 37 gradi Celsius. Successivamente, lavare la piastra con 1X PBS contenente l’1% di Tween-20 e quindi aggiungere 100 microlitri della soluzione di substrato a ciascun pozzo. Attendere 5-10 minuti. Dopo 10 minuti, interrompere la reazione enzimatica aggiungendo 100 microlitri di acido solforico 2N e quindi misurare l’assorbanza in un lettore di micropiastre entro 30 minuti dall’aggiunta della soluzione di arresto.

Per il test ELISA indiretto semi-quantitativo, la presenza di anticorpi del virus dell’influenza A in campioni diluiti in serie di siero da topi infetti da influenza A è stata determinata leggendo l’assorbanza di ciascun pozzetti a 405 nanometri in un lettore di piastre. Questi dati grezzi vengono esportati in un foglio di calcolo a scopo di calcolo. In questo esperimento, i campioni di siero diluiti in serie, che vanno da 1 – 12,5, a 1 – 204.800, sono stati ripetuti in triplice copia.

Per analizzare i dati, il valore medio di assorbanza viene quindi calcolato per ogni insieme di triplicati aggiungendo tutti i valori per ogni diluizione e dividendo la somma per 3. Una volta determinata la media per ogni serie di triplicati, le letture OD450 media vengono tracciate rispetto alle diluizioni seriali. Le letture OD diminuiscono man mano che il siero viene diluito, indicando che si trovano meno anticorpi nei campioni più diluiti. Nel sandwich quantitativo ELISA, le diluizioni dello standard noto, in questo caso il TNFalpha umano ricombinato, sono state aggiunte a una piastra a 96 pozzetti e lette insieme ai campioni sconosciuti.

Per creare la curva standard, è stato calcolato il valore medio di assorbanza per ogni serie di letture delle concentrazioni note. Quindi, il valore medio di assorbanza è stato tracciato sull’asse y, rispetto alle concentrazioni proteiche note sull’asse x. Una curva di adattamento migliore viene aggiunta attraverso i punti nel grafico.

Una volta generata la curva standard, la quantità di proteina TNFalpha nel campione di prova può essere determinata calcolando prima il valore medio di assorbanza per il campione di prova. In questo esempio, i campioni di prova hanno fornito letture OD450 di 0,636 e 0. 681. Sommando questi valori e dividendo la somma per 2 si ottiene una media di 0,659. Dall’asse y sul grafico della curva standard, estendete una linea orizzontale da questo valore di assorbanza alla curva standard. Nel punto di intersezione, estendere una linea verticale all’asse x e leggere la concentrazione corrispondente che, in questo campione di prova, corrisponde a una concentrazione di TNFalpha di 38,72 picogrammi per millilitro.

Results

Nel seguente esempio di ELISA indiretto, è stata determinata la presenza di IgG specifiche del virus dell’influenza A (IAV) nel siero di topi infetti da IAV. I topi C57Bl/6 sono stati infettati dal virus dell’influenza A (A/PR/8;^{10 5} PFU in 100 μL PBS i.p.) e il siero è stato raccolto 28 giorni dopo. Per quantificare la quantità di IgG IAV-specifico nel siero, le piastre ELISA a 96 pozzetti sono state rivestite con virus A/PR/8 influenzale purificato (50 μL/pozzetti di virus PBS da 2 mg/ml) durante la notte a 4°C. Le piastre rivestite sono state bloccate per 1 ora a temperatura ambiente con il 5% di siero d’asino normale in PBS, seguito da incubazione con campioni di siero diluiti da topi sfidati da IAV durante la notte a 4 ° C. Il siero è stato inizialmente diluito 1:12.5, seguito da diluizioni 1:4 (intervallo di diluizione – da 1:12,5 a 1:204.800). Dopo il lavaggio, le piastre sono state incubate con un asino coniugato con fosfatasi alcalina (AP) anti-topo IgG per 1 ora. Le piastre sono state lavate e quindi è stato aggiunto p-nitrofenil fosfato (PNPP; 1 mg / mL, 100 μL / pozzo). La soluzione PNPP incolore si trasforma in un colore giallo quando è presente AP. Dopo 5-10 min, la reazione enzimatica è stata interrotta aggiungendo 100 μL/well 2N H₂SO₄. La piastra è stata letta su un lettore di micropiasse a 405 nm. I risultati ottenuti sono riportati nella Tabella 1 e nella Figura 1.

Campione	Wells	OD₄₀₅	Significare
Siero 1:12.5	A1	2.163	2.194
	B1	2.214
	C1	2.204
Siero 1:50	A1	1.712	1.894
	B1	2.345
	C1	1.624
Siero 1:200	A1	1.437	1.541
	B1	1.73
	C1	1.456
Siero 1:800	A1	1.036	0.957
	B1	0.912
	C1	0.923
Siero 1:3200	A1	0.579	0.48
	B1	0.431
	C1	0.429
Siero 1:12800	A1	0.296	0.281
	B1	0.312
	C1	0.236
Siero 1:51200	A1	0.308	0.283
	B1	0.299
	C1	0.243
Siero 1:204800	A1	0.315	0.303
	B1	0.298
	C1	0.297

Tabella 1: Dati del saggio ELISA indiretto. Diluizioni sieriche (da 1:12,5 a 1:204.800), di topi infetti dal virus dell’influenza A (IAV) contenenti IgG specifiche per IAV, valori di densità ottica (OD) (405 nm) e valori medi di OD_405.

Figura 1: Grafico a dispersione indiretta del saggio ELISA dei valori medi OD₄₀₅ (+ S. D.) e delle diluizioni sieriche (da 1:12,5 a 1:204.800), delle IgG specifiche del virus dell’influenza A (IAV) nel siero di topi infetti da IAV. I valori di OD₄₀₅ possono essere inversamente correlati alle diluizioni sieriche.

Nel seguente esempio di un sandwich ELISA, una diluizione 1:2.5 degli standard TNFα umani ricombinanti (a partire da una concentrazione di 75 pg / mL) è stata aggiunta ai pozzetti indicati di una piastra a fondo piatto a 96 pozzetti. Questi standard hanno portato a un corrispondente cambiamento di 2,5 volte nelle letture di assorbanza.

Campione	Concentrazione (pg/mL)	Wells	Valori	Valore medio	Calcolo della concentrazione posteriore	Nella media
Standard 1	75	A1	1.187	1.169	76.376	75.01
		A2	1.152		73.644
Standard 2	30	B1	0.534	0.52	30.827	29.962
		B2	0.506		29.098
Standard 3	12	C1	0.23	0.217	12.838	12.105
		C2	0.204		11.372
Standard 4	4.8	D1	0.09	0.084	5.055	4.726
		D2	0.078		4.398
Standard 5	1.92	E1	0.033	0.031	1.941	1.86
		E2	0.03		1.778
Standard 6	0.768	F1	0.009	0.011	0.626	0.764
		F2	0.014		0.901
Standard 7	0.307	G1	0.002	0.004	0.238	0.377
		G2	0.007		0.516

Tabella 2: Dati della curva standard ELISA sandwich TNFα. Una diluizione 1:2.5 degli standard TNFα umani ricombinanti (da 75 a 0,3 pg/mL), valori OD (450 nm), valori medi OD_450, calcoli di concentrazione posteriore e loro medie.

Figura 2: Curva standard per TNFα sandwich ELISA. Una diluizione 1:2.5 degli standard TNFα umani ricombinanti (da 75 a 0,3 pg/mL) è stata analizzata utilizzando ELISA sandwich. I valori OD₄₅₀ possono essere direttamente correlati alle concentrazioni di diluizione standard. La quantità di proteina TNFα nel campione di prova è stata determinata utilizzando la curva standard, che corrisponde a una concentrazione di 38,72 pg/mL.

Una volta generata la curva standard, è stata determinata la quantità di proteina TNFα nel campione di prova. In questo esempio ELISA sandwich, i campioni di prova hanno fornito letture OD₄₅₀ di 0,636 e 0,681, che danno una media di 0,6585. Quando si traccia questa lettura di OD450 sul grafico sopra, ciò corrisponde a una concentrazione di TNFα di 38,72 pg / ml.

Applications and Summary

Come dimostrato, una serie di saggi immunologici (con lievi variazioni nei protocolli) rientrano nella famiglia delle tecniche ELISA. La determinazione della versione di ELISA da utilizzare dipende da una serie di fattori, tra cui l’antigene rilevato, l’anticorpo monoclonale disponibile per un particolare antigene e la sensibilità desiderata del test (5). Alcuni punti di forza e di debolezza delle diverse ELISA qui descritte sono:

ELISA	Punti di forza	Debolezze
Indiretto	1) Alta sensibilità dovuta al fatto che più anticorpi secondari coniugati con enzimi possono legarsi all’anticorpo primario	1) Può verificarsi un segnale di fondo elevato perché il rivestimento dell’antigene di interesse per la piastra non è specifico (cioè, tutte le proteine nel campione rivestiranno la piastra)
	2) Molti anticorpi primari diversi possono essere riconosciuti da un singolo anticorpo secondario coniugato con enzima dando all’utente la flessibilità di utilizzare lo stesso anticorpo secondario coniugato con enzima in molti ELISA diversi (indipendentemente dall’antigene rilevato)
	3) Scelta migliore quando è disponibile un solo anticorpo per l’antigene di interesse
Sandwich	1) L’uso di anticorpi monoclonali di cattura e rilevazione antigene-specifici aumenta la sensibilità e la specificità del test (rispetto all’ELISA indiretto)	1) Ottimizzare le concentrazioni degli anticorpi monoclonali di cattura e rilevazione può essere difficile (soprattutto per i kit non commerciali)
	2) La scelta migliore per rilevare una proteina di grandi dimensioni con più epitopi (come una citochina)
Competitivo	1) È possibile utilizzare campioni impuri	1) Richiede una grande quantità di antigene altamente puro da utilizzare per rivestire la piastra
	2) Minore sensibilità agli effetti di diluizione dei reagenti
	3) Ideale per rilevare piccole molecole (come un hapten)

Tabella 3: Riepilogo. Una sintesi dei punti di forza e di debolezza delle diverse tecniche ELISA.

Mentre una tecnica semplice e utile, ci sono anche alcuni inconvenienti per qualsiasi ELISA. Uno è l’incertezza della quantità di proteine di interesse nei campioni di prova. Se la quantità è troppo alta o troppo bassa, i valori di assorbanza ottenuti dal lettore di micropiasse possono scendere rispettivamente al di sopra o al di sotto dei limiti della curva standard. Ciò renderà difficile determinare con precisione la quantità di proteine presenti nei campioni di prova. Se i valori sono troppo alti, il campione di prova può essere diluito prima di aggiungerlo ai pozzi della piastra. I valori finali dovrebbero quindi essere regolati in base al fattore di diluizione. Come accennato, i kit fatti in casa spesso richiedono un’attenta ottimizzazione delle concentrazioni di anticorpi utilizzate per produrre un elevato rapporto segnale-rumore.

References

Porstmann, T. and Kiessig S.T. Enzyme immunoassay techniques. An overview. Journal of Immunological Methods. 150 (1-2), 5-21 (1992).
Suleyman Aydin. A short history, principles, and types of ELISA, and our laboratory experience with peptide/protein analyses using ELISA. Peptides, 72, 4-15 (2015).
Gan. S. D. and Patel K. R. Enzyme Immunoassay and Enzyme-Linked Immunosorbent Assay. Journal of Investigative Dermatology, 133 (9), 1-3 (2013).
Kohl, T. O. and Ascoli C.A. Immunometric Antibody Sandwich Enzyme-Linked Immunosorbent Assay. Cold Spring Harbor Protocols, 1 (6), (2017).
Sakamoto, S., Putalun, W., Vimolmangkang, S., Phoolcharoen, W., Shoyama, Y., Tanaka, H., and Morimoto S. Enzyme-linked immunosorbent assay for the quantitative/qualitative analysis of plant secondary metabolites. Journal of natural medicines, 72 (1), 32-42 (2018).

Transcript

Enzyme-linked Immunosorbent Assay, or ELISA is a highly sensitive quantitative assay commonly used to measure the concentration of an analyte like cytokines and antibodies in a biological sample. The general principle of this assay involves three steps: starting with capture, or immobilization, of the target analyte on a micro plate, followed by the detection of the analyte by target-specific detection proteins, and lastly, enzyme reaction, where a conjugated enzyme converts its substrate to a colored product. Based on different methods of capture and detection, ELISA can be of four types: direct, indirect, sandwich, and competitive.

For direct ELISA, the target antigen is first bound to the plate, and is then detected by a specific detection antibody. This method is commonly used for screening antibodies for a specific antigen. Indirect ELISA is used for detecting antibodies in a sample in order to quantify immune responses. The plate is first coated with a specific capture antigen, which immobilizes the target antibody, and this antigen-antibody complex is then detected using a second antibody.

In the case of sandwich ELISA, the target analyte is an antigen, which is captured on the plate using a capture antibody and then detected by the detection antibody, hence forming an antibody-antigen-antibody sandwich. This method is useful for measuring the concentration of an antigen in a mixed sample.

Competitive ELISA is used when only one antibody is available for a target antigen of interest. The plate is first coated with the purified antigen. Meanwhile, the sample containing the antigen is pre-incubated with the antibody and then added to the plate, to allow any free antibody molecules to bind to the immobilized antigen. The higher the signal from the plate, the lower the antigen concentration in the sample. In all of the four types of ELISA, direct, indirect, sandwich, and competitive, the detection antibody is either directly conjugated to the enzyme or can be indirectly linked to it through another antibody or protein.

The enzymes commonly used for the reaction are horseradish peroxidase or alkaline phosphatase with their respective substrates, both producing a soluble, colored product that can be measured and quantified using a plate reader. In this video, you will observe how to perform indirect ELISA, sandwich ELISA, and competitive ELISA, followed by examples of quantification of the target analyte from the indirect and sandwich ELISA methods.

The first experiment will demonstrate how to use indirect ELISA to determine the presence of anti-influenza virus antibodies in serum obtained from influenza-infected mice.

To begin, add 50 microliters of purified antigen – in this case, 2 milligrams per milliliter of purified A/PR/8 Influenza A virus- to each well of a 96-well ELISA plate. Next, cover the plate with an adhesive cover and incubate it overnight at 4 degrees celsius to allow the antigen to bind to the plate. The following day, remove the coating solution by flicking the plate over a sink. Next, block the remaining protein-binding sites in the coated wells by adding 200 microliters of a blocking buffer- here, 5% donkey serum in 1X PBS- to each well. Leave the plate to incubate for at least 2 hours at room temperature. Following the incubation, remove the blocking buffer and then wash the plate by adding 200 microliters of 1X PBS containing 1% Tween-20. Flick the plate over the sink once more to remove the wash.

Then, prepare the test samples by adding 460 microliters of PBS to a fresh tube, and then adding 40 microliters of serum to make a 1 to 12.5 dilution. Then, add 300 microliters of PBS to a second tube, and then add 100 microliters of the first dilution. Continue this serial dilution range until obtaining a final sample with a dilution of 1 to 204,800. Add the serially diluted serum samples in triplicate to the wells. Cover the plate with an adhesive cover and incubate at room temperature for an hour. Next, remove the samples by flicking the plate into the sink and then wash the plate by adding 200 microliters of 1X PBS containing 1% Tween-20. Once again, flick the plate to remove the wash.

Now, add 100 microliters of an enzyme-conjugated secondary antibody, which in this experiment is a horseradish peroxidase, or HRP, conjugated donkey anti-mouse secondary, to each well. Incubate the plate for one hour at room temperature, and flick the plate to remove any excess liquid. Wash the plate with 1X PBS containing 1% Tween-20 and then apply 100 microliters of the indicator substrate at a concentration of one milligram per milliliter to each well. Incubate the plate with the substrate for 5 to 10 minutes at room temperature. In this example, the colorless 3,3′, 5,5′ – tetramethylbenzidine, or TMB, substrate turns a blue color when HRP is present. After 10 minutes, stop the enzymatic reaction by adding 100 microliters of 2N sulfuric acid. The samples will turn a yellow color.

Within 30 minutes of adding the stop solution, insert the plate into a microplate reader and read the plate at the appropriate wavelength for the substrate to determine the absorbance of the wells.

To begin the sandwich ELISA, the plate must be coated with purified capture antibody. To do this, add 100 microliters of the capture antibody at a concentration within the 1-10 microgram per milliliter range, to each well of a 96-well ELISA plate. Next, cover the plate with an adhesive plate cover and then incubate the plate overnight at 4 degrees celsius. After the incubation, remove the coating solution by flicking the plate over a sink.

Now, block the remaining protein- binding sites in the coated wells by adding 200 microliters of 5% nonfat dry milk to the wells. Incubate the plate at room temperature for at least 2 hours. Next, remove the blocking buffer, and then wash the wells with 1X PBS containing 1% Tween-20. Remove the wash by flicking the plate over the sink. Now, add 100 microliters of the test sample to the wells, seal the plate with an adhesive cover, and then incubate it at room temperature for 2 hours. After incubation, remove the samples by flicking the plate over the sink and then wash the wells with 200 microliters of 1X PBS containing 1% Tween-20. Flick the plate over the sink to remove the wash and then add 100 microliters of enzyme-conjugated detection antibody to the wells.

Seal the plate with an adhesive cover. Leave the plate to incubate at room temperature for 2 hours. After the incubation, remove the unbound detection antibody by flicking the plate over a sink and wash the wells with 200 microliters of 1X PBS containing 1% Tween-20. Next, add 100 microliters of the indicator substrate at a concentration of 1 milligram per milliliter, and incubate the plate for 5 to 10 minutes at room temperature. After 10 minutes, stop the enzymatic reaction by adding 100 microliters of 2N sulfuric acid to the wells and then read the plate within 30 minutes of adding the stop solution in a microplate reader.

To perform a competitive ELISA, first coat the wells of a 96-well ELISA plate with 100 microliters of purified antigen at a concentration of 1-10 micrograms per milliliter. Cover the plate with an adhesive plate cover and then incubate overnight at 4 degrees celsius. Following this, remove the unbound antigen solution from the wells by flicking the plate over a sink.

Next, block the remaining protein-binding sites in the coated wells by adding 200 microliters of blocking buffer to each well- here, 5% nonfat dry milk in PBS. Incubate the plate for at least 2 hours at room temperature. While blocking the wells, prepare the antigen-antibody mixture in a 1. 5 milliliter tube by adding 150 microliters of sample antigen to 150 microliters of primary antibody for each well in the assay. Incubate this mixture for 1 hour at 37 degrees celsius. Now, remove the blocking buffer from the wells by flicking the plate over a sink. Then, wash the wells with 1X PBS containing Tween 20 and then add 100 microliters of the sample antigen- primary antibody mixture.

Leave the plate to incubate at 37 degrees celsius for one hour. Next, remove the sample mixture by flicking the plate over a sink and then wash the wells with 1X PBS containing 1% Tween-20 to remove any unbound antibody. Add 100 microliters of an enzyme-conjugated secondary antibody to each well and incubate the plate for one hour at 37 degrees celsius. Following this, wash the plate with 1X PBS containing 1% Tween-20 and then add 100 microliters of the substrate solution to each well. Wait for 5-10 minutes. After 10 minutes, stop the enzymatic reaction by adding 100 microliters of 2N sulfuric acid and then measure the absorbance in a microplate reader within 30 minutes of adding the stop solution.

For the semi-quantitative indirect ELISA assay, the presence of influenza A virus antibodies in serially diluted samples of serum from influenza A- infected mice was determined by reading the absorbance of each well at 405 nanometers in a plate reader. This raw data is exported to a spread sheet for calculation purposes. In this experiment, the serially diluted serum samples, which range from 1 – 12.5, to 1 – 204,800, were repeated in triplicate.

To analyze the data, the mean absorbance value is therefore calculated for each set of triplicates by adding all the values for each dilution and dividing the sum by 3. Once the mean for each set of triplicates is determined, the mean OD450 readings are plotted against the serial dilutions. The OD readings decrease as the serum is diluted, indicating that less antibodies are found in the more diluted samples. In the quantitative sandwich ELISA, dilutions of known standard, in this case recombinate Human TNFalpha, were added to a 96-well plate and read along with the unknown samples.

To create the standard curve, the mean absorbance value for each set of readings of the known concentrations was calculated. Then, the mean absorbance value was plotted on the y-axis, against the known protein concentrations on the x-axis. A best fit curve is added through the points in the graph.

Once the standard curve is generated, the amount of TNFalpha protein in the test sample can be determined by first calculating the mean absorbance value for the test sample. In this example, the test samples gave OD450 readings of 0.636 and 0. 681. Adding these values and dividing the sum by 2 gives an average of 0.659. From the y-axis on the standard curve graph, extend a horizontal line from this absorbance value to the standard curve. At the point of intersection, extend a vertical line to the x-axis and read the corresponding concentration which, in this test sample, corresponds to a TNFalpha concentration of 38.72 picograms per milliliter.

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