EliSPOT Assay: Rilevamento di splenociti secernenti IFN-γ

Il test Enzyme-linked Immunospot, o ELISPOT, è un metodo per analizzare la risposta immunitaria a un agente patogeno o a un danno cellulare. Consente di quantificare l'attivazione di diverse cellule immunitarie rilevando proteine specifiche che secernono. Ad esempio, ELISPOT è comunemente usato per misurare le risposte delle cellule T in seguito all'esposizione a un antigene estraneo rilevando le citochine secrete.

Per un saggio ELISPOT basato su citochine, il processo inizia con il rivestimento di una micropiastra ELISPOT con un anticorpo di cattura, che è specifico per la citochina bersaglio. Dopo il rivestimento dell'anticorpo, le cellule T vengono aggiunte ai pozzetti e stimolate da un agente esterno, come ad esempio l'anticorpo anti-CD3. Le cellule secernono quindi la citochina bersaglio, che viene immediatamente immobilizzata dall'anticorpo di cattura. Poiché la proteina viene catturata istantaneamente dopo la secrezione da cellule vive, senza diluizione o degradazione, questo test ha un'elevata precisione. Dopo che la citochina bersaglio è stata immobilizzata, viene aggiunto un anticorpo di rilevamento, che si lega anche alla citochina catturata.

La tecnica ELISPOT può essere utilizzata anche per quantificare le cellule B di memoria dopo un'infezione o una vaccinazione analizzando la loro produzione di anticorpi specifici. In un ELISPOT basato su anticorpi, viene utilizzato un antigene specifico al posto di un anticorpo sia per la fase di cattura, in cui l'antigene sarà legato alla piastra, sia nella fase di rilevamento, in cui l'antigene rileva l'anticorpo bersaglio dopo la cattura. In tutte le varianti del processo, per le cellule T o le cellule B, l'anticorpo o l'antigene di rilevamento è biotinilato, il che gli consente di legarsi a un enzima di rilevamento coniugato con streptavidina, come la perossidasi di rafano. Quindi, dopo l'aggiunta del substrato della perossidasi, AEC, viene prodotto un precipitato scuro e insolubile. Questo precipitato segna la posizione della proteina catturata e ogni cellula secretoria risulta in una macchia visibile, che può essere quantificata utilizzando un lettore ELISPOT o un microscopio. La dimensione delle macchie è una stima relativa della quantità di proteine secrete da ciascuna cellula. Questo test è in grado di rilevare le risposte immunitarie di singole cellule, anche in sottopopolazioni relativamente piccole di cellule secretorie, rendendolo utile per lo studio delle risposte immunitarie a livello cellulare.

In questo video imparerai come eseguire un test ELISPOT e quindi quantificare i punti che rappresentano le cellule secretorie.

Durante l'esperimento, garantire condizioni sterili lavorando in un cappuccio a flusso laminare e indossando guanti.

Tutti i calcoli di questo protocollo si basano sul volume necessario per una piastra da 96 pozzetti.

Innanzitutto, diluire l'anticorpo di cattura anti-citochine. Per fare ciò, trasferire 10 millilitri di tampone in una provetta conica sterile da 15 millilitri. Quindi, utilizzare una pipetta per aggiungere 10 microlitri di un milligrammo per millilitro di anticorpo monoclonale al tampone per creare una soluzione con una concentrazione finale di un microgrammo per millilitro. Successivamente, versare la soluzione di anticorpi di cattura in un serbatoio sterile e, utilizzando una pipetta multicanale, distribuire 100 microlitri in ciascun pozzetto di una piastra ELISPOT a 96 pozzetti.

Coprire la piastra con un coperchio per piastre, sigillarla per evitare l'evaporazione e incubare per una notte a quattro gradi Celsius. Il giorno successivo, scoprire la piastra ELISPOT nella cappa a flusso laminare. Capovolgere rapidamente la piastra su salviette sterili per rimuovere la soluzione di anticorpi di cattura da ciascun pozzetto. Quindi, utilizzare una pipetta multicanale per aggiungere 200 microlitri di terreno di coltura cellulare a ciascun pozzetto. Questo passaggio bloccherà il legame non specifico durante il saggio. Riposizionare il coperchio della piastra e incubare in un'incubatrice a 37 gradi Celsius per due ore.

Mentre la piastra è in incubazione, preparare una soluzione di mitogeno 2X aggiungendo un microlitro di PMA e 20 microlitri di ionomicina a 10 millilitri di terreno di coltura cellulare per ottenere una concentrazione finale di 15 nanogrammi per millilitro di PMA e un micromolare di ionomicina.

Anche le sospensioni cellulari di splenociti di topo devono essere preparate in questo momento in un cappuccio sterile. Utilizzando un microscopio e un emocitometro, misurare la concentrazione di cellule e regolare il volume totale fino a raggiungere una concentrazione di due milioni di cellule per millilitro.

Al termine dell'incubazione, capovolgere rapidamente la piastra su salviette sterili per rimuovere il terreno di coltura cellulare da ciascun pozzetto. Quindi, aggiungere 200 microlitri della soluzione madre di sospensione cellulare preparata ai pozzetti nella fila superiore della piastra ELISPOT. Impostare l'esperimento in triplice copia, in modo che ogni tipo di cella testato venga placcato in un insieme di tre colonne raggruppate. Al di sotto di questo, aggiungere 100 microlitri di terreno di coltura cellulare semplice alle cinque file successive della piastra, sotto le file contenenti la soluzione madre cellulare.

Successivamente, eseguire una diluizione seriale pipettando 100 microlitri di sospensione cellulare dalla fila superiore a quella direttamente sotto, pipettando delicatamente la soluzione su e giù per distribuire uniformemente le cellule. Ripetere questo processo per le file rimanenti, spostando 100 microlitri dalla riga precedente alla riga sottostante ad ogni passaggio, continuando fino a quando la quinta fila non è stata diluita in serie. Lasciare la sesta fila con il solo terreno di coltura cellulare, che funga da controllo. Per stimolare le cellule nei pozzetti sperimentali della piastra, aggiungere 100 microlitri della soluzione di mitogeno preparata alle sospensioni cellulari in ciascun pozzetto delle file da uno a cinque. Assicurati di lasciare la sesta fila, che fungerà da controllo, non stimolata. Riposizionare il coperchio e incubare la piastra a 37 gradi Celsius e 5% di CO2 per 24-48 ore.

Preparare l'anticorpo anti-citochina biotinilato diluito. Per prima cosa, preparare 50 millilitri di diluente per il dosaggio aggiungendo 5 millilitri di siero fetale bovino al 10% a 45 millilitri di PBS. Quindi, diluire l'anticorpo di rilevamento a una concentrazione di 2 microgrammi per millilitro nel diluente del saggio. Inoltre, preparare da 20 a 25 millilitri di tampone di lavaggio in questo momento, mescolando 0,05% Tween-20 e PBS.

Al termine dell'incubazione, stappare la piastra e capovolgerla rapidamente per rimuovere tutto il liquido dai pozzetti. Lavare la piastra aggiungendo circa 200 microlitri di tampone di lavaggio ad ogni pozzetto. Espellere questo liquido capovolgendo rapidamente e facendo scorrere la piastra su un lavandino. Ripetere questo processo altre quattro volte per un totale di cinque lavaggi. Quindi, aggiungere 100 microlitri della soluzione di anticorpi di rilevamento diluita in ciascun pozzetto, riposizionare il coperchio e incubare a temperatura ambiente per due ore. Dopo l'incubazione, espellere la soluzione di anticorpi di rilevamento dai pozzetti della piastra capovolgendola e facendo scorrere la piastra sul lavandino.

Come prima, lavare la piastra cinque volte con il tampone di lavaggio, espellendo il liquido tra un lavaggio e l'altro. Dopo il lavaggio finale, preparare la soluzione di streptavidina-perossidasi di rafano diluendola secondo le istruzioni del produttore. Successivamente, con i pozzetti della piastra vuoti, aggiungere 100 microlitri di soluzione diluita di streptavidina-perossidasi di rafano a ciascun pozzetto. Riposizionare il coperchio sulla piastra e incubare a temperatura ambiente per due ore.

Dopo l'incubazione, non più di 15 minuti prima dell'uso, attivare la soluzione di substrato AEC preconfezionata. Scartare il contenuto dei pozzetti e lavare la piastra cinque volte con un tampone di lavaggio, come prima. Quindi, aggiungere immediatamente 100 microlitri di soluzione di substrato AEC preparata in ciascun pozzetto. Lasciare la piastra a temperatura ambiente per sviluppare per circa 10-20 minuti, monitorando lo sviluppo delle macchie. Queste macchie appariranno come piccoli cerchi scuri sulla superficie dei pozzetti. Quindi, interrompi la reazione sciacquando la piastra con acqua e passandola sopra il lavandino. Tamponare il piatto su carta assorbente e lasciare asciugare all'aria per una notte o fino a completa asciugatura. La rimozione del vassoio di plastica sotto la piastra faciliterà l'asciugatura. Dopo l'essiccazione, le macchie sono pronte per essere contate con un lettore automatico di piastre.

In questo caso viene utilizzato il lettore CTL ImmunoSpot, ma questo protocollo può essere adattato a qualsiasi lettore. Quindi, apri il programma CTL e fai clic su Conteggio scansioni. Premere l'espulsione per far sì che il vassoio si estenda dalla macchina. Quindi, rimuovere l'adattatore di plastica e allineare la fila A sulla piastra ELISPOT e sull'adattatore. Scegliere un nome e una posizione per il file da salvare e caricare la lastra e l'adattatore sul vassoio. Fare clic su Carica sul software e chiudere lo sportello sul lato della macchina. Quindi, premere Avvia dopo il conteggio. Assicurati che il file sia salvato, quindi apri il software di controllo qualità QC per analizzare i dati e contare il numero di punti. Esporta questi dati come file Excel. Una volta completata l'analisi, fate clic su Espelli (Eject) per recuperare la piastra.

In questo esperimento, le cellule di topi wild type e portatori di tumore sono state piastrate e analizzate per l'IFN gamma. Si noti che il numero di macchie diminuisce con la diminuzione della concentrazione cellulare. Tipicamente, i dati ELISPOT sono presentati come il numero di conta spot per numero di cellule piastre. In questo esempio, il numero di punti è stato visualizzato in un grafico a barre, con ogni rispettiva concentrazione cellulare elencata sull'asse x. Si noti che il numero di macchie indica il numero di cellule attivate per numero totale di cellule in una data popolazione.