EliSPOT Assay: Rilevamento di splenociti secernenti IFN-γ

Il test Enzyme-linked Immunospot, o ELISPOT, è un metodo per analizzare la risposta immunitaria a un agente patogeno o a un danno cellulare. Permette di quantificazione dell’attivazione di diverse cellule immunitarie rilevando proteine specifiche che secernono. Ad esempio, ELISPOT è comunemente usato per misurare le risposte delle cellule T in caso di esposizione a un antigene estraneo rilevando citochine secrete.

Per un test ELISPOT basato su citochine, il processo inizia con il rivestimento di una micropiastra ELISPOT con un anticorpo di cattura, che è specifico per la citochina bersaglio. Dopo il rivestimento anticorpale, le cellule T vengono aggiunte ai pozzi e stimolate da un agente esterno, come ad esempio l’anticorpo anti-CD3. Le cellule quindi secernono la citochina bersaglio, che viene immediatamente immobilizzata dall’anticorpo di cattura. Poiché la proteina viene catturata istantaneamente dopo la secrezione da cellule vive, senza diluizione o degradazione, questo test ha un’elevata precisione. Dopo che la citochina bersaglio è stata immobilizzata, viene aggiunto un anticorpo di rilevamento, che si lega anche alla citochina catturata.

La tecnica ELISPOT può anche essere utilizzata per quantificare le cellule B della memoria dopo un’infezione o una vaccinazione analizzando la loro produzione di anticorpi specifici. In un ELISPOT a base di anticorpi, viene utilizzato un antigene specifico al posto di un anticorpo per la fase di cattura, in cui l’antigene sarà legato alla piastra, o nella fase di rilevamento, in cui l’antigene rileva l’anticorpo bersaglio post-cattura. In tutte le varianti del processo, per le cellule T o B, l’anticorpo o l’antigene di rilevamento è biotinilato, il che gli consente di legarsi a un enzima di rilevamento coniugato con streptavidina, come la perossidasi di rafano. Quindi, con l’aggiunta del substrato della perossidasi, AEC, viene prodotto un precipitato scuro e insolubile. Questo precipitato segna la posizione della proteina catturata e ogni cellula secretoria si traduce in un punto visibile, che può essere quantificato utilizzando un lettore ELISPOT o un microscopio. La dimensione delle macchie è una stima relativa della quantità di proteine secrete da ciascuna cellula. Questo test può rilevare le risposte immunitarie da singole cellule, anche in sottopopolazioni relativamente piccole di cellule secretorie, rendendolo utile per studiare le risposte immunitarie a livello cellulare.

In questo video, imparerai come eseguire un test ELISPOT e quindi quantificare le macchie che rappresentano le cellule secretorie.

Durante l’esperimento, garantire condizioni sterili lavorando in un cappuccio a flusso laminare e indossando guanti.

Tutti i calcoli in questo protocollo si basano sul volume necessario per una piastra da 96 pozzi.

In primo luogo, diluire l’anticorpo di cattura anti-citochine. Per fare questo, trasferire 10 millilitri di tampone in un tubo conico sterile da 15 millilitri. Quindi, utilizzare una pipetta per aggiungere 10 microlitri di un milligrammo per millilitro di anticorpo monoclonale al tampone per creare una soluzione con una concentrazione finale di un microgrammo per millilitro. Quindi, versare la soluzione anticorpale di cattura in un serbatoio sterile e, utilizzando una pipetta multicanale, distribuire 100 microlitri in ciascun pozzetti di una piastra ELISPOT da 96 pozzetti.

Coprire la piastra con un coperchio della piastra, sigillarla per evitare l’evaporazione e incubare durante la notte a quattro gradi Celsius. Il giorno dopo, scopri la piastra ELISPOT nella cappa a flusso laminare. Invertire rapidamente la piastra su salviette sterili per rimuovere la soluzione anticorpale di cattura da ciascun pozzo. Quindi, utilizzare una pipetta multicanale per aggiungere 200 microlitri di terreno di coltura cellulare a ciascun pozzo. Questo passaggio bloccherà il legame non specifico durante il test. Sostituire il coperchio della piastra e incubare in un incubatore a 37 gradi Celsius per due ore.

Mentre la piastra è in incubazione, preparare una soluzione mitogena 2X aggiungendo un microlitro di PMA e 20 microlitri di ionomicina a 10 millilitri di terreno di coltura cellulare per ottenere una concentrazione finale di 15 nanogrammi per millilitro PMA e una ionomicina micromolare.

Anche le sospensioni cellulari di splenociti di topo devono essere preparate in questo momento in un cappuccio sterile. Utilizzando un microscopio e un emocitometro, misurare la concentrazione di cellule e regolare il volume totale fino a raggiungere una concentrazione di riserva di due milioni di cellule per millilitro.

Al termine dell’incubazione, invertire rapidamente la piastra su salviette sterili per rimuovere il terreno di coltura cellulare da ciascun pozzo. Quindi, aggiungere 200 microlitri della soluzione di sospensione cellulare preparata ai pozzi nella fila superiore della piastra ELISPOT. Impostare l’esperimento in triplice copia, in modo che ogni tipo di cella testato venga placcato in un insieme di tre colonne raggruppate. Al di sotto di questo, aggiungere 100 microlitri di terreno di coltura cellulare semplice alle successive cinque file della piastra, sotto le file contenenti soluzione stock cellulare.

Quindi, eseguire una diluizione seriale pipettando 100 microlitri della sospensione cellulare dalla fila superiore nella fila direttamente sotto, pipettando delicatamente la soluzione su e giù per distribuire uniformemente le celle. Ripetere questo processo per le righe rimanenti, spostando 100 microlitri dalla riga precedente alla riga sottostante ad ogni passaggio, continuando fino a quando la quinta riga non è stata diluita in serie. Lasciare la sesta riga con il solo terreno di coltura cellulare, per fungere da controllo. Per stimolare le cellule nei pozzi sperimentali della piastra, aggiungere 100 microlitri della soluzione mitogena preparata alle sospensioni cellulari in ciascun pozzo di file da una a cinque. Assicurati di lasciare la sesta fila, che servirà come controllo, non stimolata. Sostituire il coperchio e incubare la piastra a 37 gradi Celsius e 5% di CO2 per 24-48 ore.

Preparare l’anticorpo anti-citochina biotinilato diluito. In primo luogo, preparare 50 millilitri di diluente di saggio aggiungendo 5 millilitri di siero bovino fetale al 10% a 45 millilitri di PBS. Quindi, diluire l’anticorpo rilevante a una concentrazione di 2 microgrammi per millilitro nel diluente di saggio. Inoltre, preparare da 20 a 25 millilitri di tampone di lavaggio in questo momento, mescolando lo 0,05% di Tween-20 e PBS.

Al termine dell’incubazione, scollebare la piastra e invertirla rapidamente per rimuovere tutto il liquido dai pozzi. Lavare la piastra aggiungendo circa 200 microlitri di tampone di lavaggio a ciascun pozzo. Espellere questo liquido invertendo rapidamente e facendo scorrere la piastra su un lavandino. Ripeti questo processo altre quattro volte per un totale di cinque lavaggi. Quindi, aggiungere 100 microlitri della soluzione anticorpale di rilevamento diluita a ciascun pozzo, sostituire il coperchio e incubare a temperatura ambiente per due ore. Dopo l’incubazione, espellere la soluzione anticorpale di rilevamento dai pozzi della piastra invertendo e facendo scorrere la piastra sul lavandino.

Come prima, lavare la piastra cinque volte con tampone di lavaggio, espellendo il liquido tra ogni lavaggio. Dopo il lavaggio finale, preparare la soluzione di streptavitina-rafano perossidasi diluendola secondo le istruzioni del produttore. Successivamente, con i pozzi della piastra vuoti, aggiungere 100 microlitri di soluzione diluita di streptavitina-rafano perossidasi a ciascun pozzo. Rimettere il coperchio sul piatto e incubare a temperatura ambiente per due ore.

Dopo l’incubazione, non più di 15 minuti prima dell’uso, attivare la soluzione di substrato AEC prefabbrica. Scartare il contenuto dei pozzi e lavare la piastra cinque volte con tampone di lavaggio, come prima. Quindi, aggiungere immediatamente 100 microlitri di soluzione di substrato AEC preparata in ciascun pozzet. Lasciare la piastra a temperatura ambiente per svilupparsi per circa 10-20 minuti, monitorando lo sviluppo spot. Queste macchie appariranno come piccoli cerchi oscurati sulla superficie dei pozzi. Quindi, interrompere la reazione risciacquando la piastra con acqua e facendola scorrere sul lavandino. Asciugare la piastra su carta assorbente e lasciare asciugare all’aria durante la notte o fino a completa asciugatura. La rimozione del vassoio di plastica sotto la piastra faciliterà l’asciugatura. Dopo l’essiccazione, i punti sono pronti per essere contati con un lettore automatico di lastre.

Qui viene utilizzato il lettore CTL ImmunoSpot, ma questo protocollo può essere adattato per qualsiasi lettore. Quindi, apri il programma CTL e fai clic su Scan Count. Spingere l’espulsione per far estendere il vassoio dalla macchina. Quindi, rimuovere l’adattatore di plastica e allineare la riga A sulla piastra ELISPOT e sull’adattatore. Scegliere un nome e una posizione per il file da salvare e caricare la piastra e l’adattatore sul vassoio. Fare clic su Carica sul software e chiudere lo sportello sul lato della macchina. Quindi, premere Avvia dopo il conteggio. Assicurarsi che il file venga salvato e quindi aprire il software QC di controllo qualità per analizzare i dati e contare il numero di punti. Esportare questi dati come file Excel. Una volta completata l’analisi, fate clic su Espelli (Eject) per recuperare la piastra.

In questo esperimento, le cellule di topi selvatici e portatori di tumore sono state placcate e analizzate per la gamma IFN. Si noti che il numero di macchie diminuisce con la diminuzione della concentrazione cellulare. In genere, i dati ELISPOT vengono presentati come il numero di conteggi spot per numero di celle placcate. In questo esempio, il numero di punti è stato visualizzato in un grafico a barre, con ogni rispettiva concentrazione cellulare elencata sull’asse x. Si noti che il numero di punti indica il numero di cellule attivate per numero totale di cellule in una determinata popolazione.