Fonte: Tonya J. Webb1
1 Dipartimento di Microbiologia e Immunologia, University of Maryland School of Medicine e Marlene and Stewart Greenebaum Comprehensive Cancer Center, Baltimora, Maryland 21201
ELISPOT è un test standardizzato e riproducibile utilizzato per rilevare le risposte immunitarie cellulari. Il test utilizza un metodo basato su un saggio immunoassorbente enzimatico (ELISA) per rilevare le risposte immunitarie a singola cellula che possono essere visualizzate da macchie, da cui il nome ELISPOT. ELISPOT è stato descritto per la prima volta nel 1983, da Czerkinsky, come un metodo per enumerare il numero di ibridomi a cellule B che producono immunoglobuline antigene-specifiche (1). Lo stesso gruppo ha ulteriormente sviluppato il test per misurare la frequenza dei linfociti T che producono citochine. Ora ELISPOT è diventato un gold standard per misurare l’immunità delle cellule T antigene-specifiche negli studi clinici e nei candidati vaccini. Ad esempio, dopo la vaccinazione o durante un’infezione, le plasmacellule e le cellule B della memoria secernono anticorpi che forniscono protezione. Tipicamente, queste risposte delle cellule B sono valutate misurando i titoli sierici di anticorpi antigene-specifici. Tuttavia, questo tipo di analisi, tipicamente misurata da ELISA, potrebbe non includere le cellule B di memoria, che possono essere presenti anche in assenza di livelli sierici di anticorpi rilevabili. Inoltre, è stato ben stabilito che le cellule B della memoria circolanti sono importanti per la risposta anticorpale rapida e protettiva osservata dopo la ricon esposizione dei patogeni, quindi è fondamentale essere in grado di rilevare queste cellule. Pertanto, per valutare chiaramente le risposte delle cellule B della memoria antigene-specifica, devono essere utilizzati sia ELISA che ELISPOT (2).
Il test ELISPOT utilizza una piastra contenente pozzetti rivestiti di membrana rivestiti di anticorpi al fine di catturare le proteine secrete di interesse. Quindi, la piastra viene caricata con cellule e stimoli per indurre la produzione di proteine. Le proteine secrete vengono catturate dagli anticorpi rivestiti sulla superficie. Dopo un adeguato tempo di incubazione, le cellule vengono rimosse e la molecola secreta viene rilevata utilizzando un anticorpo biotinilato specifico per un epitopo diverso, rispetto all’anticorpo di cattura. Successivamente, viene aggiunta la streptavicina perossidasi, seguita dall’aggiunta di un substrato che consente il rilevamento delle macchie (Figura 1). Il punto di forza di questo test è che consente di quantificare il numero di cellule che producono la proteina di interesse. È importante sottolineare che si può valutare se ci sono cambiamenti nel numero totale di cellule che producono una proteina specifica o se le singole cellule all’interno di una popolazione producono più proteine. Inoltre, può fornire informazioni sulla cinetica e può essere utilizzato per valutare l’attivazione immunitaria complessiva (stimolazione mitogena) rispetto alle risposte antigene-specifiche (simulazione dell’antigene). Il test ELISPOT consentirà di rilevare una cellula attivata tra 300.000 cellule a seguito di attivazione mitogenica o antigene-specifica.
Figura 1: Panoramica del protocollo ELISPOT.
I principali vantaggi di questo test sono il suo- a. Semplicità: il protocollo è relativamente semplice e diretto. Non richiede competenze tecniche, b. Sensibilità- permette il rilevamento di cellule immunitarie a livello di singola cellula e richiede pochissime cellule rispetto ad altri metodi come la citometria a flusso, c. Funzionalità: fornisce dati quantitativi relativi alla funzione immunitaria.
Questo esercizio di laboratorio dimostra il protocollo ELISPOT per il rilevamento di splenociti secernenti IFN-γ, ma come accennato in precedenza questo test può anche essere utilizzato per valutare la secrezione di anticorpi da parte delle cellule B (3).
1. Configurazione
Tamponi e reagenti
Attrezzatura
Materiali
Reagenti specifici per il saggio
2. Procedura
Rivestimento
Inceppamento
Placcatura e attivazione delle cellule
Scoperta
Anticorpo primario
Anticorpo secondario
Substrato
3. Acquisizione e analisi dei dati
Note:
Il test Enzyme-linked Immunospot, o ELISPOT, è un metodo per analizzare la risposta immunitaria a un agente patogeno o a un danno cellulare. Permette di quantificazione dell’attivazione di diverse cellule immunitarie rilevando proteine specifiche che secernono. Ad esempio, ELISPOT è comunemente usato per misurare le risposte delle cellule T in caso di esposizione a un antigene estraneo rilevando citochine secrete.
Per un test ELISPOT basato su citochine, il processo inizia con il rivestimento di una micropiastra ELISPOT con un anticorpo di cattura, che è specifico per la citochina bersaglio. Dopo il rivestimento anticorpale, le cellule T vengono aggiunte ai pozzi e stimolate da un agente esterno, come ad esempio l’anticorpo anti-CD3. Le cellule quindi secernono la citochina bersaglio, che viene immediatamente immobilizzata dall’anticorpo di cattura. Poiché la proteina viene catturata istantaneamente dopo la secrezione da cellule vive, senza diluizione o degradazione, questo test ha un’elevata precisione. Dopo che la citochina bersaglio è stata immobilizzata, viene aggiunto un anticorpo di rilevamento, che si lega anche alla citochina catturata.
La tecnica ELISPOT può anche essere utilizzata per quantificare le cellule B della memoria dopo un’infezione o una vaccinazione analizzando la loro produzione di anticorpi specifici. In un ELISPOT a base di anticorpi, viene utilizzato un antigene specifico al posto di un anticorpo per la fase di cattura, in cui l’antigene sarà legato alla piastra, o nella fase di rilevamento, in cui l’antigene rileva l’anticorpo bersaglio post-cattura. In tutte le varianti del processo, per le cellule T o B, l’anticorpo o l’antigene di rilevamento è biotinilato, il che gli consente di legarsi a un enzima di rilevamento coniugato con streptavidina, come la perossidasi di rafano. Quindi, con l’aggiunta del substrato della perossidasi, AEC, viene prodotto un precipitato scuro e insolubile. Questo precipitato segna la posizione della proteina catturata e ogni cellula secretoria si traduce in un punto visibile, che può essere quantificato utilizzando un lettore ELISPOT o un microscopio. La dimensione delle macchie è una stima relativa della quantità di proteine secrete da ciascuna cellula. Questo test può rilevare le risposte immunitarie da singole cellule, anche in sottopopolazioni relativamente piccole di cellule secretorie, rendendolo utile per studiare le risposte immunitarie a livello cellulare.
In questo video, imparerai come eseguire un test ELISPOT e quindi quantificare le macchie che rappresentano le cellule secretorie.
Durante l’esperimento, garantire condizioni sterili lavorando in un cappuccio a flusso laminare e indossando guanti.
Tutti i calcoli in questo protocollo si basano sul volume necessario per una piastra da 96 pozzi.
In primo luogo, diluire l’anticorpo di cattura anti-citochine. Per fare questo, trasferire 10 millilitri di tampone in un tubo conico sterile da 15 millilitri. Quindi, utilizzare una pipetta per aggiungere 10 microlitri di un milligrammo per millilitro di anticorpo monoclonale al tampone per creare una soluzione con una concentrazione finale di un microgrammo per millilitro. Quindi, versare la soluzione anticorpale di cattura in un serbatoio sterile e, utilizzando una pipetta multicanale, distribuire 100 microlitri in ciascun pozzetti di una piastra ELISPOT da 96 pozzetti.
Coprire la piastra con un coperchio della piastra, sigillarla per evitare l’evaporazione e incubare durante la notte a quattro gradi Celsius. Il giorno dopo, scopri la piastra ELISPOT nella cappa a flusso laminare. Invertire rapidamente la piastra su salviette sterili per rimuovere la soluzione anticorpale di cattura da ciascun pozzo. Quindi, utilizzare una pipetta multicanale per aggiungere 200 microlitri di terreno di coltura cellulare a ciascun pozzo. Questo passaggio bloccherà il legame non specifico durante il test. Sostituire il coperchio della piastra e incubare in un incubatore a 37 gradi Celsius per due ore.
Mentre la piastra è in incubazione, preparare una soluzione mitogena 2X aggiungendo un microlitro di PMA e 20 microlitri di ionomicina a 10 millilitri di terreno di coltura cellulare per ottenere una concentrazione finale di 15 nanogrammi per millilitro PMA e una ionomicina micromolare.
Anche le sospensioni cellulari di splenociti di topo devono essere preparate in questo momento in un cappuccio sterile. Utilizzando un microscopio e un emocitometro, misurare la concentrazione di cellule e regolare il volume totale fino a raggiungere una concentrazione di riserva di due milioni di cellule per millilitro.
Al termine dell’incubazione, invertire rapidamente la piastra su salviette sterili per rimuovere il terreno di coltura cellulare da ciascun pozzo. Quindi, aggiungere 200 microlitri della soluzione di sospensione cellulare preparata ai pozzi nella fila superiore della piastra ELISPOT. Impostare l’esperimento in triplice copia, in modo che ogni tipo di cella testato venga placcato in un insieme di tre colonne raggruppate. Al di sotto di questo, aggiungere 100 microlitri di terreno di coltura cellulare semplice alle successive cinque file della piastra, sotto le file contenenti soluzione stock cellulare.
Quindi, eseguire una diluizione seriale pipettando 100 microlitri della sospensione cellulare dalla fila superiore nella fila direttamente sotto, pipettando delicatamente la soluzione su e giù per distribuire uniformemente le celle. Ripetere questo processo per le righe rimanenti, spostando 100 microlitri dalla riga precedente alla riga sottostante ad ogni passaggio, continuando fino a quando la quinta riga non è stata diluita in serie. Lasciare la sesta riga con il solo terreno di coltura cellulare, per fungere da controllo. Per stimolare le cellule nei pozzi sperimentali della piastra, aggiungere 100 microlitri della soluzione mitogena preparata alle sospensioni cellulari in ciascun pozzo di file da una a cinque. Assicurati di lasciare la sesta fila, che servirà come controllo, non stimolata. Sostituire il coperchio e incubare la piastra a 37 gradi Celsius e 5% di CO2 per 24-48 ore.
Preparare l’anticorpo anti-citochina biotinilato diluito. In primo luogo, preparare 50 millilitri di diluente di saggio aggiungendo 5 millilitri di siero bovino fetale al 10% a 45 millilitri di PBS. Quindi, diluire l’anticorpo rilevante a una concentrazione di 2 microgrammi per millilitro nel diluente di saggio. Inoltre, preparare da 20 a 25 millilitri di tampone di lavaggio in questo momento, mescolando lo 0,05% di Tween-20 e PBS.
Al termine dell’incubazione, scollebare la piastra e invertirla rapidamente per rimuovere tutto il liquido dai pozzi. Lavare la piastra aggiungendo circa 200 microlitri di tampone di lavaggio a ciascun pozzo. Espellere questo liquido invertendo rapidamente e facendo scorrere la piastra su un lavandino. Ripeti questo processo altre quattro volte per un totale di cinque lavaggi. Quindi, aggiungere 100 microlitri della soluzione anticorpale di rilevamento diluita a ciascun pozzo, sostituire il coperchio e incubare a temperatura ambiente per due ore. Dopo l’incubazione, espellere la soluzione anticorpale di rilevamento dai pozzi della piastra invertendo e facendo scorrere la piastra sul lavandino.
Come prima, lavare la piastra cinque volte con tampone di lavaggio, espellendo il liquido tra ogni lavaggio. Dopo il lavaggio finale, preparare la soluzione di streptavitina-rafano perossidasi diluendola secondo le istruzioni del produttore. Successivamente, con i pozzi della piastra vuoti, aggiungere 100 microlitri di soluzione diluita di streptavitina-rafano perossidasi a ciascun pozzo. Rimettere il coperchio sul piatto e incubare a temperatura ambiente per due ore.
Dopo l’incubazione, non più di 15 minuti prima dell’uso, attivare la soluzione di substrato AEC prefabbrica. Scartare il contenuto dei pozzi e lavare la piastra cinque volte con tampone di lavaggio, come prima. Quindi, aggiungere immediatamente 100 microlitri di soluzione di substrato AEC preparata in ciascun pozzet. Lasciare la piastra a temperatura ambiente per svilupparsi per circa 10-20 minuti, monitorando lo sviluppo spot. Queste macchie appariranno come piccoli cerchi oscurati sulla superficie dei pozzi. Quindi, interrompere la reazione risciacquando la piastra con acqua e facendola scorrere sul lavandino. Asciugare la piastra su carta assorbente e lasciare asciugare all’aria durante la notte o fino a completa asciugatura. La rimozione del vassoio di plastica sotto la piastra faciliterà l’asciugatura. Dopo l’essiccazione, i punti sono pronti per essere contati con un lettore automatico di lastre.
Qui viene utilizzato il lettore CTL ImmunoSpot, ma questo protocollo può essere adattato per qualsiasi lettore. Quindi, apri il programma CTL e fai clic su Scan Count. Spingere l’espulsione per far estendere il vassoio dalla macchina. Quindi, rimuovere l’adattatore di plastica e allineare la riga A sulla piastra ELISPOT e sull’adattatore. Scegliere un nome e una posizione per il file da salvare e caricare la piastra e l’adattatore sul vassoio. Fare clic su Carica sul software e chiudere lo sportello sul lato della macchina. Quindi, premere Avvia dopo il conteggio. Assicurarsi che il file venga salvato e quindi aprire il software QC di controllo qualità per analizzare i dati e contare il numero di punti. Esportare questi dati come file Excel. Una volta completata l’analisi, fate clic su Espelli (Eject) per recuperare la piastra.
In questo esperimento, le cellule di topi selvatici e portatori di tumore sono state placcate e analizzate per la gamma IFN. Si noti che il numero di macchie diminuisce con la diminuzione della concentrazione cellulare. In genere, i dati ELISPOT vengono presentati come il numero di conteggi spot per numero di celle placcate. In questo esempio, il numero di punti è stato visualizzato in un grafico a barre, con ogni rispettiva concentrazione cellulare elencata sull’asse x. Si noti che il numero di punti indica il numero di cellule attivate per numero totale di cellule in una determinata popolazione.
In questo test ELISPOT, i leucociti splenici di topi wildtype e portatori di tumore sono stati analizzati per la γ IFN. La Figura 2 A mostra l’immagine visiva del risultato del test. I numeri nel colore verde indicano il numero di macchie per pozzo (TNTC indica “troppo numerosi per contare”). Si noti che il numero di macchie diminuisce con la diminuzione della concentrazione cellulare.
Figura 2A: Diminuzione delle risposte immunitarie nei topi portatori di tumore. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
In genere, i dati ELISPOT vengono presentati come il numero di conteggi spot per numero di celle placcate. Nella Figura 2 B il numero di punti è visualizzato in un grafico a barre, con ogni rispettiva concentrazione cellulare elencata sull’asse X. Ai fini della grafica, 150 è stato utilizzato per indicare il numero massimo di punti. Il numero di leucociti splenici murini che producono γ IFN negli animali portatori di tumore è inferiore a quelli selvatici.
Figura 2B: Diminuzione delle risposte immunitarie nei topi portatori di tumore. Gli splenociti sono stati prelevati da topi di controllo C57BL/6 (wildtype) e portatori di tumore e stimolati con PMA/ionomicina per 48 ore. I saggi ELISPOT sono stati utilizzati per quantificare il numero di leucociti splenici produttori di IFN-γ. (A) Rappresentazione visiva e (B) grafica dei dati. TNTC indica troppo numerosi per contare. Ai fini della grafica, 150 è stato utilizzato per indicare il numero massimo di punti. I numeri verdi indicano il numero di punti contati per pozzo. I numeri rossi indicano i pozzi di riferimento utilizzati per determinare quali punti erano celle e quali punti erano detriti, artefatti o effetti di bordo e devono essere esclusi dall’analisi.
Il test ELISPOT consente di valutare l’attivazione delle cellule immunitarie determinando il numero di cellule che secernono un analita specifico. La dimensione e l’intensità delle macchie forniscono informazioni sulla quantità di analita prodotta da ciascuna cellula. Il protocollo sopra descritto ha dettagliato il rilevamento di una singola citochina. Tuttavia, i recenti sviluppi hanno migliorato l’utilità di questo test. Attualmente, è possibile utilizzare coloranti fluorescenti per rilevare più analiti all’interno di un pozzo. Ciò consente l’individuazione di diverse sottopopolazioni di cellule che secernono uno o entrambi gli analiti.
The Enzyme-linked Immunospot, or ELISPOT, assay is a method to analyze the immune response to a pathogen or cell damage. It allows for quantification of the activation of different immune cells by detecting specific proteins they secrete. For example, ELISPOT is commonly used for measuring T-cell responses upon exposure to a foreign antigen by detecting secreted cytokines.
For a cytokine-based ELISPOT assay, the process begins with the coating of an ELISPOT microplate with a capture antibody, which is specific to the target cytokine. After the antibody coating, T-cells are added to the wells and stimulated by an external agent, like anti-CD3 antibody, for example. The cells then secrete the target cytokine, which immediately gets immobilized by the capture antibody. Since the protein is captured instantly post-secretion from live cells, without dilution or degradation, this assay has a high accuracy. After the target cytokine is immobilized, a detection antibody is added, which also binds to the captured cytokine.
The ELISPOT technique can also be used to quantify memory B-cells after an infection or vaccination by analyzing their production of specific antibodies. In an antibody-based ELISPOT, a specific antigen is used instead of an antibody for either the capture step, where the antigen will be bound to the plate, or at the detection step, where the antigen detects the target antibody post-capture. In all variations of the process, for T-cells or B-cells, the detection antibody or antigen is biotinylated, which allows it to bind to a streptavidin-conjugated detection enzyme, such as horseradish peroxidase. Then, upon addition of the peroxidase’s substrate, AEC, a dark, insoluble precipitate is produced. This precipitate marks the location of the captured protein, and each secretory cell results in a visible spot, which can be quantified using an ELISPOT reader or a microscope. The size of the spots is a relative estimate of the amount of protein secreted from each cell. This assay can detect immune responses from single cells, even in relatively small subpopulations of secretory cells, making it useful for studying immune responses at the cellular level.
In this video, you will learn how to perform an ELISPOT assay and then quantify the spots representing the secretory cells.
Throughout the experiment, ensure sterile conditions by working in a laminar flow hood and wearing gloves.
All calculations in this protocol are based on the volume needed for one 96-well plate.
First, dilute the anti-cytokine capture antibody. To do this, transfer 10 milliliters of buffer into a sterile 15 milliliter conical tube. Then, use a pipette to add 10 microliters of one milligram per milliliter of monoclonal antibody to the buffer to create a solution with a final concentration of one microgram per milliliter. Next, pour the capture antibody solution into a sterile reservoir and, using a multichannel pipette, distribute 100 microliters into each well of a 96-well ELISPOT plate.
Cover the plate with a plate cover, seal it to prevent evaporation, and incubate overnight at four degrees Celsius. The next day, uncover the ELISPOT plate in the laminar flow hood. Quickly invert the plate onto sterile wipes to remove the capture antibody solution from each well. Next, use a multichannel pipette to add 200 microliters of cell culture medium to each well. This step will block non-specific binding during the assay. Replace the plate cover and incubate in a 37 degrees Celsius incubator for two hours.
While the plate is incubating, prepare a 2X mitogen solution by adding one microliter of PMA and 20 microliters of ionomycin to 10 milliliters of cell culture medium to achieve a final concentration of 15 nanograms per milliliter PMA and one micromolar ionomycin.
Cellular suspensions of mouse splenocytes should also be prepared at this time in a sterile hood. Using a microscope and hemocytometer, measure the concentration of cells and adjust the total volume until a stock concentration of two million cells per milliliter is reached.
After incubation is complete, quickly invert the plate onto sterile wipes to remove the cell culture medium from each well. Next, add 200 microliters of the prepared cellular suspension stock solution to the wells in the top row of the ELISPOT plate. Set up the experiment in triplicate, so that each cell type tested will be plated in a set of three grouped columns. Below this, add 100 microliters of plain cell culture medium to the next five rows of the plate, below the rows containing cellular stock solution.
Next, perform a serial dilution by pipetting 100 microliters of the cell suspension from the top row into the row directly below, gently pipetting the solution up and down to evenly distribute the cells. Repeat this process for the remaining rows, moving 100 microliters from the previous row to the row below at each step, continuing until the fifth row has been serially diluted. Leave the sixth row with cell culture medium only, to serve as a control. To stimulate the cells in the experimental wells of the plate, add 100 microliters of the prepared mitogen solution to the cellular suspensions in each well of rows one through five. Be sure to leave the sixth row, which will serve as the control, unstimulated. Replace the lid and incubate the plate at 37 degrees Celsius and 5% CO2 for 24 to 48 hours.
Prepare the diluted biotinylated anti-cytokine detecting antibody. First, prepare 50 milliliters of assay diluent by adding 5 milliliters of 10% fetal bovine serum to 45 milliliters of PBS. Next, dilute the detecting antibody to a concentration of 2 micrograms per milliliter in assay diluent. Also, prepare 20 to 25 milliliters of wash buffer at this time, by mixing .05% Tween-20 and PBS.
After the incubation is complete, uncap the plate and quickly invert it to remove all liquid from the wells. Wash the plate by adding about 200 microliters of wash buffer to each well. Expel this liquid by quickly inverting and flicking the plate over a sink. Repeat this process four more times for a total of five washes. Next, add 100 microliters of the diluted detection antibody solution to each well, replace the lid, and incubate at room temperature for two hours. After incubation, expel the detection antibody solution from the wells of the plate by inverting and flicking the plate over the sink.
As before, wash the plate five times with wash buffer, expelling the liquid between each wash. After the final wash, prepare the streptavidin- horseradish peroxidase solution by diluting it according to the manufacturer’s instructions. Next, with the wells of the plate empty, add 100 microliters of diluted streptavidin- horseradish peroxidase solution to each well. Place the lid back onto the plate and incubate at room temperature for two hours.
After the incubation, no more than 15 minutes before use, activate pre-made AEC substrate solution. Discard the contents of the wells and wash the plate five times with wash buffer, as before. Then, immediately add 100 microliters of prepared AEC substrate solution into each well. Leave the plate at room temperature to develop for approximately 10 to 20 minutes, while monitoring spot development. These spots will appear as small, darkened circles on the surface of the wells. Then, stop the reaction by rinsing the plate with water and flicking it over the sink. Blot the plate on paper towels and allow to air dry overnight or until completely dry. Removing the plastic tray under the plate will facilitate drying. After drying, the spots are ready to be counted with an automated plate reader.
Here, the CTL ImmunoSpot reader is used, but this protocol can be adapted for any reader. Then, open the CTL program and click on Scan Count. Push eject for the tray to extend from the machine. Then, remove the plastic adapter and align row A on the ELISPOT plate and adapter. Choose a file name and location for the file to be saved and load the plate and adapter onto the tray. Click Load on the software and close the door on the side of the machine. Then, press Start After Counting. Ensure that the file is saved and then open the Quality Control QC software to analyze the data and count the number of spots. Export this data as an Excel file. Once analysis is complete, click Eject to retrieve the plate.
In this experiment, cells from wild type and tumor-bearing mice were plated and analyzed for IFN gamma. Notice that the number of spots decreases with decreasing cell concentration. Typically, ELISPOT data are presented as the number of spot counts per number of cells plated. In this example, the number of spots were displayed in a bar graph, with each respective cellular concentration listed on the x-axis. Notice that the number of spots indicates the number of activated cells per total number of cells in a given population.
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