Microscopia a fluorescenza confocale: una tecnica per determinare la localizzazione delle proteine nei fibroblasti di topo
Fonte: Dominique R. Bollino1, Eric A. Legenzov2, Tonya J. Webb1
1 Dipartimento di Microbiologia e Immunologia, University of Maryland School of Medicin…
1. Materiali
Buffer
- Tampone di lavaggio: 1 X soluzione salina sterile tamponata con fosfato (PBS) senza calcio o magnesio
- Tampone di fissazione: 1% di paraformaldeide in PBS
- Tampone di permeabilizzazione: 0,1% Triton X-100 in PBS
- Tampone bloccante: 1% di albumina sierica bovina in PBS
- Mezzo di crescita cellulare: DMEM integrato con siero bovino fetale al 10% (FBS), penicillina / streptomicina e L-glutammina
Attrezzatura
- Cappa a flusso laminare
- Incubatore umidificato (37°C, 5% CO2)
- Microscopio a scansione laser confocale; qui, Nikon Eclipse Ti laser
Materiali e reagenti
- Vetrini per colture cellulari a camera
- Supporti di montaggio anti-dissolvenza con DAPI (per la colorazione dei nuclei)
- Vetro di copertura del microscopio
- Salviette delicate
- Pipettors e punte
Reagenti specifici per il saggio
- Cellule aderenti (cellule primarie o linee cellulari); qui sono stati utilizzati fibroblasti di topo trasfettato con CD1d (LCD1).
- Anticorpi primari per rilevare bersagli cellulari; qui sono stati utilizzati ratto anti-mouse CD107a (LAMP-1) e mouse anti-mouse CD1d.
- Anticorpi secondari coniugati con fluoroforo specifici per gli isotipi degli anticorpi primari; qui sono state utilizzate IgG anti-ratto coniugate ad Alexafluor 488 e IgG anti-mouse coniugate ad Alexafluor 647.
2. Protocollo
Preparazione per la colorazione degli anticorpi
Cellule di semina
- Sospendare le cellule di interesse per i mezzi di crescita.
- Quindi, seminare 500 μL della sospensione cellulare / per pozzo nei pozzeli di una slitta a 4 pozzetta. (Qui, le cellule LCD1 sono state seminate a 2,5x105 celle / camera in 500 μL di mezzi di crescita. La densità di semina può variare tra le linee cellulari).
- Incubare la camera scivolare durante la notte in un incubatore a CO2 al 5% a 37 ° C, per consentire alle cellule di aderire al vetro.
- Il giorno successivo, aspirare il mezzo da ciascun pozzo e quindi lavare le cellule 1X con PBS da 500 μL.
Fissazione
- Per fissare le cellule, aggiungere 500 μL soluzione di paraformaldeide all'1% in ciascun pozzo e incubare per 15 minuti a temperatura ambiente.
- Dopo l'incubazione, raccogliere la paraformaldeide in un contenitore di rifiuti liquidi pericolosi appropriato.
- Quindi, lavare le cellule 3 volte con PBS da 500 μL per rimuovere eventuali residui del fissativo.
Permeabilizzazione
- Permeabilizzare le cellule incubando con tampone/pozzo di permeabilizzazione da 500 μL per 15 minuti a temperatura ambiente.
- Quindi, lavare brevemente le cellule 3 volte con 500 μL di PBS.
Inceppamento
- Incubare le cellule in ciascun pozzo con un tampone bloccante da 500 μL per 1 ora a 4°C, per bloccare il legame anticorpale non specifico.
Incubazione di anticorpi primari
- Aspirare il tampone di blocco dalle camere di scorrimento.
- Quindi, aggiungere 500 μL di soluzione anticorpale primaria diluita alle cellule. (Qui, l'anti-CD107a (LAMP-1) è stato diluito 1:500 e l'anti-CD1d è stato usato non diluito (l'anticorpo monoclonale 1H6 è stato gentilmente fornito dal Dr. Randy Brutkiewicz)).
- Incubare i vetrini durante la notte a 4°C.
Nota: se si esegue il sondaggio per più di un bersaglio, assicurarsi che gli anticorpi primari siano isotipi diversi. Le concentrazioni di anticorpi raccomandate variano tra i produttori e devono essere titolate prima dell'uso.
Incubazione di anticorpi secondari
- Aspirare la soluzione anticorpale primaria dai pozzi.
- Lavare le camere del pozzo 4 volte con 500 μL PBS.
- Quindi, aggiungere 500 μL della soluzione anticorpale secondaria diluita a ciascun pozzo. (Qui, entrambi gli anticorpi secondari - anti-mouse IgG Alexafluor 647 e anti-ratto IgG Alexafluor 488 sono stati diluiti 1:2000 nel buffer di blocco).
- Incubare a temperatura ambiente per 1 ora al buio.
- Dopo l'incubazione, aspirare la soluzione anticorpale secondaria.
- Lavare le camere 4 volte con PBS da 500 μL per rimuovere eventuali anticorpi secondari non legati.
Nota: le concentrazioni di anticorpi raccomandate variano tra i produttori e devono essere titolate prima dell'uso. Se si sonda più di un bersaglio, gli anticorpi secondari devono essere coniugati a diversi fluorofori con spettri di eccitazione/emissione unici. Tieni anche presente l'eccitazione / emissione della controstipitazione nucleare (cioè DAPI) durante la selezione dei fluorofori. La selezione del fluoroforo può essere influenzata dalla configurazione laser del microscopio confocale utilizzato. La configurazione laser della macchina determinerà quali fluorofori sono adatti per l'esperimento.
3. Coperture di montaggio
- Innanzitutto, rimuovere con attenzione le camere dalla diapositiva.
- Quindi, tenere la diapositiva ad angolo su una delicata pulizia e rimuovere il fluido dai bordi senza toccare le celle.
- Aggiungere 1 goccia di mezzo di montaggio antifiade, contenente la macchia nucleare DAPI, su ogni sezione di celle.
- Quindi, posizionare un coverslip di 20 mm x 60 mm sulla diapositiva tenendolo sui bordi con la punta delle dita. (Evitare la formazione di bolle sulle cellule, in quanto interferiscono con l'imaging).
- Pulire qualsiasi mezzo di montaggio aggiuntivo sui lati con una delicata pulizia e conservare le diapositive al buio a temperatura ambiente fino a una settimana.
4. Imaging confocale
Campioni di immagini su un microscopio a scansione laser confocale. Per i dati mostrati nella Figura 2, la Nikon Eclipse Ti A1R è stata utilizzata con il software NIS Elements Advanced Research. La sezione seguente descrive in dettaglio la procedura per l'acquisizione di immagini utilizzando il software di cui sopra.
- Per iniziare a immaginare le cellule, apri il 'software NIS Elements Advanced Research' facendo clic sull' ' icona del softwareNIS'.
- Successivamente, nella finestra di controllo fare clic sulla scheda'TiPad'e scegliere l'obiettivo desiderato per l'imaging. (Qui è stato utilizzato il primo obiettivo 40x).
- Caricare la diapositiva con le celle sullo stage e centrarla sotto l'obiettivo.
- Ora, nella scheda'A1plus Compact GUI',impostare i laser appropriati per i fluorofori utilizzati. Fare clic sul simbolo dell'ingranaggio per aprire il menu delle impostazioni di tintura e spettrale e selezionare i canali necessari e impostare il laser per ciascun canale.
- Quindi, selezionare le emissioni appropriate nel menu a discesa sotto il primo specchio dicroico.
- Successivamente, nella finestra'A1plus Compact GUI',fare clic su'Ch. Series'per impostare la serie di canali di linea, che imposta se i laser utilizzati spareranno sul campione contemporaneamente o in sequenza. (Qui sono state scelte le passate sequenziali, a partire dal canale 1, seguito dal canale 2, quindi dal canale 4).
- Successivamente, avvia la scansione facendo clic sull'icona "Punta freccia" in alto. A questo punto mentre l'immagine è in diretta, sotto la finestra'A1plus Compact GUI',clicca sulla scala scorrevole e modifica la dimensione del foro stenopeico per assicurarti di limitare la luce fuori fuoco. (Qui è stata utilizzata l'impostazione più bassa disponibile (0,5).
- Successivamente, regolare le impostazioni di 'alta tensione' e 'offset' sotto ogni laser a livelli appropriati, utilizzando le scale scorrevoli per consentire il rilevamento della colorazione specifica limitando al contempo qualsiasi potenziale colorazione di fondo. Se è disponibile un campione con colorazione positiva, iniziare con l'imaging di questo campione per ciascun canale per assicurarsi che le impostazioni laser producano rapporti segnale/rumore ottimali.
Attenzione: un'elevata intensità laser per periodi prolungati può causare fotosciviazione. - Dopo aver impostato i valori HV e offset ottimali per ciascun laser, fare clic sullascheda 'ND Acquisition'e quindi selezionare l'icona'Z'per impostare i parametri per la serie z. Successivamente, mentre acquisisci un'immagine dal vivo del campione, imposta prima il fondo trovando la parte inferiore dell'immagine e facendo clic sul pulsante 'in basso 'in basso',quindi trova la posizione superiore del campione e fai clic sul pulsante'in alto'. Impostare la dimensione del passo digitando specificamente la dimensione del passo preferita in μm per ogni passaggio o specificando quanti passaggi totali sono necessari.
- Una volta impostati i parametri della serie z, selezionare la dimensione desiderata/risoluzione pixel dell'immagine. Per fare ciò, fai clic sulla finestra'A1plus Compact GUI'e sotto l'icona'size'seleziona la risoluzione desiderata. Per ridurre il rumore dell'immagine, è possibile selezionare il menu a discesa accanto al simbolo 'ø' per fare la media del numero selezionato di immagini.
- Ora, fai clic sulla scheda"Esegui ora"nelmenu "Acquisizione ND"per avviare l'imaging del campione.
- Al termine dell'imaging, salvare l'immagine facendo clic su'File',quindi su'Salva con nome',che esporterà il file immagine con estensione'.nd2'. Infine, ripetere il processo per ciascuno degli altri campioni.
La microscopia a fluorescenza confocale è una tecnica di imaging specializzata per la localizzazione di una proteina o di un antigene di interesse in un campione di cellula o tessuto mediante l'etichettatura dell'antigene con un colorante fluorescente coniugato con anticorpi e il rilevamento del segnale fluorescente. Offre una risoluzione spaziale più elevata rispetto alla microscopia a fluorescenza ad ampio campo, con l'aiuto di due fori stenopeici posti sui piani focali della lente dell'obiettivo, che gli conferiscono il nome confocale. Consente agli utenti di visualizzare la colorazione a livello subcellulare, come la differenziazione tra la colorazione della membrana superficiale e la colorazione intracellulare.
Un microscopio confocale segue un principio di base simile a quello di un classico microscopio a fluorescenza. Il fascio proveniente da una sorgente luminosa, solitamente un laser per confocale, viene riflesso da uno specchio dicroico e focalizzato da una lente dell'obiettivo sul campione. Questa luce eccita i fluorofori per emettere una lunghezza d'onda diversa, che viaggia indietro attraverso la lente dell'obiettivo e lo specchio dicroico fino a una fotocamera o a un oculare.
La maggiore risoluzione di un microscopio confocale è dovuta principalmente alla presenza di due fori stenopeici, che sono fori molto piccoli attraverso i quali la luce può passare sui percorsi della luce di eccitazione ed emissione. I fori stenopeici sono posizionati strategicamente sul piano focale della lente dell'obiettivo. Ora, passiamo a uno schema della vista laterale della disposizione del microscopio per rivedere il percorso della luce. Dopo essere passato attraverso il foro stenopeico di eccitazione, il raggio di luce di eccitazione ha l'effetto di provenire da un punto focale, il che consente alla lente dell'obiettivo di focalizzare la luce anche su un punto del campione. Il fascio di emissione da questo punto focale converge in corrispondenza del foro stenopeico di emissione, che ne consente il passaggio. Ora, durante l'eccitazione, anche i fluorofori all'interno del percorso della luce, sopra e sotto il punto focale, sono leggermente eccitati. Mentre la luce di emissione proveniente dal punto focale passa attraverso il foro stenopeico, le emissioni provenienti dai punti fuori fuoco convergono prima o dopo il foro stenopeico di emissione e vengono quindi bloccate, con conseguente riduzione della fluorescenza di fondo.
Il ciclo di eccitazione-emissione-rilevamento deve essere ripetuto per ogni punto di imaging nella regione di interesse, il che può essere fatto in diversi modi. Ad esempio, la scansione laser confocale utilizza specchi di scansione galvanometrici, che deviano la luce di eccitazione a diverse angolazioni. Quindi, spazzando il raggio di luce attraverso il campione nel piano XY. Il confocale a disco rotante utilizza un disco con una serie di fori stenopeici, che ruota per spostare la disposizione dei fori di spillo. Ciò consente agli utenti di illuminare ogni volta più piccoli punti di imaging nel campione, coprendo gradualmente l'intera area man mano che il disco ruota. Come risultato dei fori stenopeici, l'immagine XY sul rivelatore rappresenta un piano Z stretto. Pertanto, le immagini possono essere raccolte da una serie di piani Z consecutivi, spesso indicati come stack Z. Da queste immagini, un software appropriato può generare una rappresentazione 3D del modello del segnale di fluorescenza nel campione.
In questo protocollo, si osserverà l'immunocolorazione dei fibroblasti di topo, seguita dall'imaging su un microscopio confocale per visualizzare in modo differenziale una proteina della superficie cellulare e una proteina lisosomiale.
Per iniziare, utilizzando tecniche sterili, risospendere le cellule di interesse in 500 microlitri di terreno di crescita per pozzetto, quindi seminarle nei pozzetti di un vetrino a camera a quattro pozzetti. Qui, stiamo usando fibroblasti di topo che sono stati trasfettati per esprimere la molecola presentante l'antigene, CD1d. Per consentire alle cellule di aderire al vetro, posizionare il vetrino della camera in un incubatore al 5% di anidride carbonica a 37 gradi Celsius e incubare durante la notte. Al mattino, aspirare il terreno da ogni pozzetto, quindi lavare le cellule una volta con 500 microlitri di PBS per alcuni secondi.
Per fissare le cellule, aggiungere 500 microlitri di soluzione di paraformaldeide all'1% in ciascun pozzetto e incubare per 15 minuti a temperatura ambiente. Dopo l'incubazione, raccogliere la paraformaldeide in un apposito contenitore per rifiuti liquidi pericolosi, quindi rimuovere eventuali residui del fissativo lavando le cellule tre volte con PBS per alcuni secondi.
Per consentire la penetrazione degli anticorpi nelle cellule, aggiungere 500 microlitri di tampone di permeabilizzazione a ciascun pozzetto e incubare sul banco per 15 minuti a temperatura ambiente. Dopo la permeabilizzazione, lavare brevemente le cellule tre volte con 500 microlitri di PBS. Quindi, aggiungere 500 microlitri di tampone bloccante a ciascun pozzetto e incubare per un'ora a quattro gradi Celsius per evitare il legame di anticorpi non specifici.
Preparare gli anticorpi primari, anti-CD1d e anti-LAMP-1, a concentrazioni di lavoro appropriate. Quindi, aspirare il tampone dai pozzetti e coprire le cellule in ciascun pozzetto con 500 microlitri di soluzione di anticorpi primari diluiti, quindi incubare il vetrino su una superficie piana durante la notte a quattro gradi Celsius. La mattina successiva, diluire gli anticorpi secondari, in questo caso un anticorpo anti-topo e anti-ratto con etichette fluorescenti distinte, in tampone bloccante a concentrazioni di lavoro appropriate. Successivamente, aspirare la soluzione di anticorpi primari dai pozzetti e quindi lavare le cellule quattro volte con 500 microlitri di PBS. Quindi, aggiungere 500 microlitri della soluzione di anticorpi secondari diluiti a ciascun pozzetto e incubare a temperatura ambiente per un'ora al buio. Dopo l'incubazione, aspirare la soluzione di anticorpi secondari e lavare i pozzetti quattro volte con 500 microlitri di PBS per rimuovere qualsiasi anticorpo secondario non legato.
Per montare i campioni dopo il lavaggio finale, staccare con cautela e rimuovere le camere dal vetrino. Per rimuovere il PBS residuo, tenere il vetrino inclinato sopra una salvietta delicata e rimuovere il fluido dai bordi senza toccare le celle. Una volta rimosso il PBS in eccesso, aggiungere una goccia di terreno di montaggio antifade, contenente il colorante nucleare DAPI, su ciascuna sezione di cellule. Quindi, prendi un vetrino coprioggetti di 20 x 60 millimetri e, usando solo la punta delle dita, inizia ad abbassare lentamente il vetrino coprioggetti su entrambi i bordi, facendo attenzione a evitare la formazione di bolle sulle cellule. Rimuovi qualsiasi supporto di montaggio extra sulle diapositive con una salvietta delicata e conserva le diapositive al buio a temperatura ambiente per un massimo di una settimana.
Per iniziare l'imaging delle cellule, fare clic sull'icona del software NIS sul desktop. Una volta nella finestra di controllo, fai clic sulla scheda TiPad in alto e scegli l'obiettivo desiderato per l'imaging. Quindi, caricare la diapositiva con le celle sul tavolino e centrarla sotto l'obiettivo. Successivamente, nella scheda GUI di A1plus Compact accanto alla scheda TiPad, impostare i laser appropriati per i fluorofori utilizzati. Fare clic sul simbolo dell'ingranaggio per aprire il menu delle impostazioni di tintura e spettrale. Una volta aperto il menu delle impostazioni del colorante e dello spettro, selezionare i canali necessari e impostare il laser per ciascun canale. Quindi, selezionare le emissioni appropriate nel menu a discesa sotto il primo specchio dicroico. Successivamente, nella finestra GUI di A1plus Compact, fare clic su Ch.Series per impostare la serie di canali di linea, che imposta se i laser utilizzati spareranno sul campione contemporaneamente o in sequenza.
Successivamente, avvia la scansione facendo clic sull'icona della punta della freccia in alto. A questo punto, mentre l'imaging è in tempo reale, nella finestra GUI di A1plus Compact, fare clic sulla scala di scorrimento e modificare le dimensioni del foro stenopeico per limitare la luce sfocata. Quindi, regolare le impostazioni di alta tensione e offset sotto ciascun laser ai livelli appropriati utilizzando le scale scorrevoli per consentire il rilevamento della colorazione specifica limitando al contempo qualsiasi potenziale colorazione di fondo. Se è disponibile un campione di colorazione positivo, iniziare con l'imaging di questo campione per ciascun canale per assicurarsi che le impostazioni del laser producano rapporti segnale/rumore ottimali. Dopo aver impostato i valori ottimali di HV e offset per ciascun laser, fare clic sulla scheda Acquisizione ND, quindi selezionare l'icona Z per impostare i parametri per la serie z.
Successivamente, durante l'acquisizione di un'immagine dal vivo del campione, impostare prima la parte inferiore trovando la parte inferiore dell'immagine e facendo clic sul pulsante inferiore. Quindi, trova la posizione superiore del campione e fai clic sul pulsante in alto. Imposta la dimensione del passo digitando in modo specifico la dimensione del passo preferita in micron per ogni passo o specificando il numero totale di passi necessari. Per selezionare la dimensione/risoluzione in pixel desiderata dell'immagine, fare clic sulla finestra GUI di Aiplus Compact e, sotto l'icona delle dimensioni, selezionare la risoluzione desiderata.
Per ridurre il rumore dell'immagine, è possibile selezionare il menu a discesa accanto al simbolo theta per calcolare la media del numero di immagini selezionato. Successivamente, fare clic sulla scheda Esegui ora nel menu Acquisizione ND per avviare l'imaging del campione. Al termine dell'imaging, salvare l'immagine facendo clic su file, quindi su Salva con nome, che esporterà il file immagine con l'estensione dot-nd2. Infine, ripeti il processo per ciascuno degli altri campioni.
In questo esperimento, i fibroblasti di topo che esprimono il gene della glicoproteina di superficie CD1d sono stati fissati, immunocolorati e sottoposti a imaging su un microscopio confocale. Questa immagine mostra una singola sezione di una pila Z con un ingrandimento di 40X, dove CD1d è colorato in rosso. Il campione è stato rivestito con LAMP-1, un marcatore lisosomiale, in verde. La colorazione nucleare DAPI è stata utilizzata per mostrare i nuclei delle cellule.
In un'immagine composita in cui i tre diversi canali sono uniti, l'aspetto del giallo deriva dalla sovrapposizione dei canali rosso e verde e indica un'area in cui CD1d e LAMP-1 sono co-localizzati nei lisosomi. Le aree in cui è presente un solo colore indicano la presenza di CD1d o LAMP-1 senza co-localizzazione. Questa immagine mostra un rendering 3D delle celle costruite a partire dalle immagini catturate nello z-stack e questo metodo ha permesso la costruzione di una vista laterale di questo gruppo di celle. L'immagine seguente mostra una fetta dello z-stack con un ingrandimento di 100X, dimostrando i modelli di espressione di queste due proteine in modo più dettagliato. La casella con contorno rosa sul lato destro dell'immagine mostra la sezione trasversale della coordinata x designata dalla linea rosa nell'immagine, che rappresenta la vista laterale in corrispondenza della linea rosa. Analogamente, il riquadro con contorno blu nella parte inferiore dell'immagine mostra la sezione trasversale della coordinata y designata dalla linea blu nell'immagine, che rappresenta la vista frontale in corrispondenza della linea blu. Il rendering 3D dell'immagine z-stack consente agli utenti di visualizzare l'immagine in 3D, visualizzando tutti i piani x, y e z. Questo può essere utilizzato per studiare la co-localizzazione delle diverse colorazioni in diverse regioni all'interno della cellula.
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Q1: How does confocal microscopy achieve better resolution than wide-field fluorescence microscopy?
Confocal microscopy uses two strategically placed pinholes at the focal planes of the objective lens to block out-of-focus light. While wide-field microscopy detects fluorescence from above and below the focal plane, creating hazy background, confocal pinholes allow only light from the focal point to reach the detector. This eliminates background fluorescence and dramatically improves both spatial resolution and image contrast.
Q2: What role do pinholes play in confocal microscope imaging?
Pinholes are small holes positioned on both the excitation and emission light paths at the focal plane of the objective lens. The excitation pinhole makes the light beam appear to originate from a focal point, enabling precise focusing. The emission pinhole blocks divergent light from out-of-focus regions, allowing only in-focus fluorescence to pass through to the detector, resulting in reduced background and improved image clarity.
Q3: How can confocal microscopy distinguish between surface and intracellular protein localization?
Confocal microscopy achieves subcellular resolution by collecting images from narrow Z planes using pinholes that eliminate out-of-focus light. This enables visualization at the subcellular level, allowing researchers to differentiate between surface membrane staining and intracellular staining. The technique can reveal whether proteins are located on the cell surface or within specific organelles like lysosomes.
Q4: What is a Z-stack and how is it used in confocal microscopy?
A Z-stack is a series of consecutive images collected from adjacent focal planes throughout the depth of a sample. Because confocal pinholes restrict detection to narrow Z planes, images can be acquired sequentially from top to bottom of the specimen. Specialized software then processes these Z-stack images to generate a three-dimensional depiction of the fluorescence signal pattern, enabling visualization of protein localization in all spatial dimensions.
Q5: Why is sample fixation preferred over live cell imaging for confocal microscopy?
Fixed cells are preferred for confocal Z-stack imaging because acquiring multiple images from numerous Z planes is time-consuming and challenging with live cells. Live cells are difficult to maintain healthy during extended imaging, and their organelles constantly move, compromising image quality and 3D reconstruction accuracy. Fixed cells preserve cellular morphology and remain stationary, allowing reliable collection of high-quality image series.
Q6: How do secondary antibodies with distinct fluorescent tags enable multi-protein visualization?
When imaging multiple cellular targets, primary antibodies from different species are used to label each antigen. Fluorophore-conjugated secondary antibodies, each with unique excitation and emission spectra, then bind to their respective primary antibodies. This allows the confocal microscope to distinguish signals from different proteins using separate laser channels, enabling simultaneous visualization and co-localization analysis of multiple antigens within the same cell.
Q7: What does co-localization indicate when visualizing multiple stained proteins in confocal images?
Co-localization occurs when two or more proteins occupy the same cellular region, appearing as color overlap in merged confocal images. For example, when red and green fluorescent signals overlap, they produce yellow, indicating that both proteins are present in the same subcellular compartment. This technique reveals functional relationships between proteins, such as whether CD1d traffics through lysosomal compartments marked by LAMP-1.