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Microscopia a fluorescenza confocale: una tecnica per determinare la localizzazione delle proteine nei fibroblasti di topo

Confocal Fluorescence Microscopy: A Technique to Determine the Localization of Proteins in Mouse Fibroblasts

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Confocal Fluorescence Microscopy: A Technique to Determine the Localization of Proteins in Mouse Fibroblasts

5.7: Immunofluorescence Microscopy: Immunofluorescence Staining of Paraffin-Embedded Tissue Sections

5.9: Immunoprecipitation-Based Techniques: Purification of Endogenous Proteins Using Agarose Beads

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13:13 min

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April 30, 2023

Overview

Fonte: Dominique R. Bollino¹, Eric A. Legenzov², Tonya J. Webb¹
¹ Dipartimento di Microbiologia e Immunologia, University of Maryland School of Medicine e Marlene and Stewart Greenebaum Comprehensive Cancer Center, Baltimora, Maryland 21201
² Center for Biomedical Engineering and Technology, University of Maryland School of Medicine, Baltimora, Maryland 21201

La microscopia a fluorescenza confocale è una tecnica di imaging che consente una maggiore risoluzione ottica rispetto alla microscopia a epifluorescenza convenzionale “a campo largo”. I microscopi confocali sono in grado di ottenere una migliore risoluzione ottica x-y attraverso la “scansione laser”, in genere un insieme di specchi controllati in tensione (galvanometro o specchi “galvo”) che dirigono l’illuminazione laser a ciascun pixel del campione alla volta. Ancora più importante, i microscopi confocali raggiungono una risoluzione z-assiale superiore utilizzando un foro stenopeico per rimuovere la luce fuori fuoco proveniente da posizioni che non si trovano nel piano z in fase di scansione, consentendo così al rilevatore di raccogliere dati da un piano z specificato. A causa dell’elevata risoluzione z ottenibile in microscopia confocale, è possibile raccogliere immagini da una serie di piani z (chiamati anche z-stack) e costruire un’immagine 3D tramite software.

Prima di discutere il meccanismo di un microscopio confocale, è importante considerare come un campione interagisce con la luce. La luce è composta da fotoni, pacchetti di energia elettromagnetica. Un fotone che impaa su un campione biologico può interagire con le molecole che compongono il campione in uno dei quattro modi: 1) il fotone non interagisce e passa attraverso il campione; 2) il fotone viene riflesso/disperso; 3) il fotone viene assorbito da una molecola e l’energia assorbita viene rilasciata come calore attraverso processi noti collettivamente come decadimento non radiativo; e 4) il fotone viene assorbito e l’energia viene quindi rapidamente riemessa come fotone secondario attraverso il processo noto come fluorescenza. Una molecola la cui struttura consente l’emissione di fluorescenza è chiamata fluoroforo. La maggior parte dei campioni biologici contiene fluorofori endogeni trascurabili; pertanto i fluorofori esogeni devono essere utilizzati per evidenziare le caratteristiche di interesse nel campione. Durante la microscopia a fluorescenza, il campione viene illuminato con luce della lunghezza d’onda appropriata per l’assorbimento da parte del fluoroforo. Dopo aver assorbito un fotone, si dice che un fluoroforo sia “eccitato” e il processo di assorbimento è indicato come “eccitazione”. Quando un fluoroforo cede energia sotto forma di fotone, il processo è noto come “emissione” e il fotone emesso è chiamato fluorescenza.

Il fascio di luce utilizzato per eccitare un fluoroforo è focalizzato dalla lente obiettiva di un microscopio e converge in un “punto focale” dove è focalizzato al massimo. Oltre il punto focale la luce diverge di nuovo. I fasci in entrata e in uscita possono essere visualizzati come una coppia di coni che toccano il punto focale (vedere figura 1, pannello di sinistra). Il fenomeno della diffrazione impone un limite alla misura in cui un fascio di luce può essere focalizzato – il raggio in realtà si concentra su un punto di dimensioni finite. Due fattori determinano la dimensione del punto focale: 1) la lunghezza d’onda della luce e 2) la capacità di raccolta della luce della lente dell’obiettivo, che è caratterizzata dalla sua apertura numerica (NA). Lo “spot” focale si estende non solo nel piano x-y, ma anche nella direzione z, ed è in realtà un volume focale. Le dimensioni di questo volume focale definiscono la massima risoluzione ottenibile con l’imaging ottico. Sebbene il numero di fotoni sia maggiore all’interno del volume focale, i percorsi di luce conica sopra e sotto la messa a fuoco contengono anche una minore densità di fotoni. Qualsiasi fluoroforo nel percorso della luce può quindi essere eccitato. Nella microscopia a epifluorescenza convenzionale (a campo largo), l’emissione di fluorofori sopra e sotto il piano focale contribuisce alla fluorescenza fuori fuoco (uno “sfondo nebuloso”), che riduce la risoluzione e il contrasto dell’immagine, come dimostrato nella Figura 1, con il cubo rosso che rappresenta l’emissione di fluoroforo sopra il piano focale (stella rossa) che si traduce in fluorescenza fuori fuoco (in alto a destra). Questo problema è migliorata nella microscopia confocale, a causa dell’utilizzo di un foro stenopeico. (Figura 2, in basso a destra). Come illustrato nella Figura 3, il foro stenopeico consente alle emissioni provenienti dal punto focale di raggiungere il rilevatore (a sinistra), impedendo al contempo alla fluorescenza fuori fuoco (a destra) di raggiungere il rilevatore, migliorando così sia la risoluzione che il contrasto.

Figura 1. Risoluzione ottica dell’epifluorescenza rispetto alla microscopia confocale. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Il fascio di luce utilizzato per eccitare un fluoroforo è focalizzato dalla lente obiettiva di un microscopio e converge a un volume focale e poi diverge (a sinistra). La stella rossa rappresenta il piano focale di un campione che viene ripreso mentre il quadrato rosso rappresenta l’emissione di fluorofori sopra il piano focale. Quando si cattura un’immagine di questo campione utilizzando un microscopio epifluorescente, l’emissione dal quadrato rosso sfocato sarà visibile e contribuirà a uno “sfondo nebuloso” (in alto a destra). I microscopi confocali hanno un foro stenopeico che impedisce il rilevamento della luce emessa al di fuori del piano focale, eliminando lo “sfondo nebuloso” (in basso a destra).

Figura 2. Effetto stenopeico in microscopia confocale. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Sebbene la massima intensità della luce di eccitazione sia nel punto focale della lente (sinistra, ovale rosso), altre parti del campione non nel punto focale (destra, stella rossa) riceveranno luce e fluorescenza. Per evitare che la luce emessa da queste regioni fuori fuoco raggiunga il rilevatore, uno schermo con un foro stenopeico è presente davanti al rilevatore. Solo la luce a fuoco (a sinistra) emessa dal piano focale è in grado di viaggiare attraverso il foro stenopeico e raggiungere il rilevatore. La luce fuori fuoco (a destra) è bloccata con il foro stenopeico e non riesce a raggiungere il rilevatore.

Figura 3. Componenti principali di un microscopio a scansione laser confocale. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Per semplicità, la descrizione meccanicistica di un microscopio confocale sarà limitata a quella del Nikon Eclipse Ti A1R. Sebbene ci possano essere piccole differenze tecniche tra i diversi microscopi confocali, l’A1R funge bene da buon modello per descrivere la funzione del microscopio confocale. Il fascio di luce di eccitazione, prodotto da una serie di laser a diodi, viene riflesso dallo specchio dicroico primario nell’obiettivo, che focalizza la luce sul campione che viene ripreso. Lo specchio dicroico primario riflette selettivamente la luce di eccitazione mentre consente alla luce ad altre lunghezze d’onda di passare. La luce incontra quindi gli specchi di scansione che spazzano il fascio di luce attraverso il campione in modo x-y, illuminando un singolo(x,y)pixel alla volta. La fluorescenza emessa dai fluorofori al pixel illuminato viene raccolta dalla lente dell’obiettivo e passa attraverso lo specchio dicroico primario per raggiungere una serie di tubi fotomoltiplicatori (PMT). Gli specchi dicroici secondari dirigono la luce di emissione verso il PMT appropriato. La luce di eccitazione diffusa dal campione nell’obiettivo viene riflessa dallo specchio dicroico primario verso il campione, impedendo così di entrare nel percorso luminoso di rilevamento e raggiungere i PMT (vedere Figura 3). Ciò consente di quantificare la fluorescenza relativamente debole senza contaminazione da parte della luce diffusa dal fascio di luce di eccitazione, che è tipicamente ordini di grandezza più intenso della fluorescenza. Poiché il foro stenopeico blocca la luce dall’esterno del volume focale, la luce che arriva al rilevatore proviene da un piano zstretto e selezionato. Pertanto, le immagini possono essere raccolte da una serie di piani zadiacenti; questa serie di immagini è spesso indicata come “z-stack”. Utilizzando il software appropriato, è possibile elaborare uno z-stack per generare un’immagine 3D del campione. Un particolare vantaggio della microscopia confocale è la capacità di distinguere la localizzazione subcellulare della colorazione. Ad esempio, la differenziazione tra la colorazione di membrana dalla colorazione intracellulare, che è molto impegnativa con la microscopia a epifluorescenza convenzionale (1, 2, 3).

La preparazione del campione è un aspetto importante dell’imaging confocale. Un punto di forza delle tecniche di microscopia ottica è la flessibilità di immaginare cellule vive o fisse. Quando si tenta di produrre immagini 3D, a causa del numero di immagini che devono essere acquisite per uno z-stack, della difficoltà di mantenere la salute delle cellule e del movimento delle cellule vive e dei loro organelli, l’uso di cellule fisse è tipico. La procedura per fissare e colorare le cellule per la fluorescenza confocale è simile a quella convenzionalmente utilizzata nell’immunofluorescenza. Dopo la coltura in vetrini da camera o su coverslip, le cellule vengono fissate utilizzando la paraformaldeide per preservare la morfologia cellulare. Il legame anticorpale non specifico viene bloccato utilizzando albumina sierica bovina, latte o siero normale. Al fine di mantenere la specificità degli anticorpi secondari, la soluzione utilizzata non deve provenire dalla stessa specie in cui sono stati generati gli anticorpi primari. Le cellule vengono incubate con anticorpi primari che legano l’antigene di interesse. Quando si etichettano diversi bersagli cellulari, gli anticorpi primari devono essere derivati ciascuno da una specie diversa. Gli anticorpi che etichettano un antigene sono quindi legati da anticorpi secondari coniugati con fluoroforo. Gli anticorpi secondari coniugati con fluoroforo devono essere selezionati in modo che siano compatibili con le lunghezze d’onda dell’eccitazione laser disponibili nel microscopio confocale. Quando si visualizzano più antigeni, gli spettri di eccitazione/emissione dei fluorofori dovrebbero differire abbastanza da far sì che i loro segnali possano essere discriminati mediante analisi microscopiche. Il campione macchiato viene quindi montato su una diapositiva per l’imaging. Un mezzo di montaggio viene utilizzato per prevenire il fotosciviazione e la disidratazione del campione. Se lo si desidera, è possibile utilizzare un mezzo di montaggio contenente una controstena nucleare (ad esempio DAPI o Hoechst) (4).

Nel seguente protocollo, i fibroblasti di topo trasfettato per esprimere CD1d (LCD1) sono stati colorati con anticorpi che riconoscono CD1d e CD107a (LAMP-1). CD1d è un importante recettore simile al complesso di istocompatibilità 1 (MHC 1) presente sulla superficie delle cellule presentanti l’antigene che presenta antigeni lipidici. LAMP-1 (lysosomal associated membrane protein-1) è una proteina transmembrana presente principalmente nelle membrane liposomiali. Per una corretta presentazione dell’antigene, CD1d viene trafficato attraverso il compartimento liposomiale a basso pH, quindi LAMP-1 viene utilizzato come marcatore del compartimento liposomiale per questo protocollo. Sondando le cellule LCD1 con anti-CD1d e anti-LAMP-1 che sono state prodotte in diverse specie, gli anticorpi secondari con fluorofori unici possono essere utilizzati per determinare la localizzazione di ciascuna proteina nella cellula e se CD1d è presente nei compartimenti liposomiali positivi LAMP-1.

Procedure

1. Materiali

Buffer

Tampone di lavaggio: 1 X soluzione salina sterile tamponata con fosfato (PBS) senza calcio o magnesio
Tampone di fissazione: 1% di paraformaldeide in PBS
Tampone di permeabilizzazione: 0,1% Triton X-100 in PBS
Tampone bloccante: 1% di albumina sierica bovina in PBS
Mezzo di crescita cellulare: DMEM integrato con siero bovino fetale al 10% (FBS), penicillina / streptomicina e L-glutammina

Attrezzatura

Cappa a flusso laminare
Incubatore umidificato (37°C, 5% CO₂₎
Microscopio a scansione laser confocale; qui, Nikon Eclipse Ti laser

Materiali e reagenti

Vetrini per colture cellulari a camera
Supporti di montaggio anti-dissolvenza con DAPI (per la colorazione dei nuclei)
Vetro di copertura del microscopio
Salviette delicate
Pipettors e punte

Reagenti specifici per il saggio

Cellule aderenti (cellule primarie o linee cellulari); qui sono stati utilizzati fibroblasti di topo trasfettato con CD1d (LCD1).
Anticorpi primari per rilevare bersagli cellulari; qui sono stati utilizzati ratto anti-mouse CD107a (LAMP-1) e mouse anti-mouse CD1d.
Anticorpi secondari coniugati con fluoroforo specifici per gli isotipi degli anticorpi primari; qui sono state utilizzate IgG anti-ratto coniugate ad Alexafluor 488 e IgG anti-mouse coniugate ad Alexafluor 647.

2. Protocollo

Preparazione per la colorazione degli anticorpi

Cellule di semina

Sospendare le cellule di interesse per i mezzi di crescita.
Quindi, seminare 500 μL della sospensione cellulare / per pozzo nei pozzeli di una slitta a 4 pozzetta. (Qui, le cellule LCD1 sono state seminate a 2,5×10⁵ celle / camera in 500 μL di mezzi di crescita. La densità di semina può variare tra le linee cellulari).
Incubare la camera scivolare durante la notte in un incubatore a CO₂ al 5% a 37 ° C, per consentire alle cellule di aderire al vetro.
Il giorno successivo, aspirare il mezzo da ciascun pozzo e quindi lavare le cellule 1X con PBS da 500 μL.

Fissazione

Per fissare le cellule, aggiungere 500 μL soluzione di paraformaldeide all’1% in ciascun pozzo e incubare per 15 minuti a temperatura ambiente.
Dopo l’incubazione, raccogliere la paraformaldeide in un contenitore di rifiuti liquidi pericolosi appropriato.
Quindi, lavare le cellule 3 volte con PBS da 500 μL per rimuovere eventuali residui del fissativo.

Permeabilizzazione

Permeabilizzare le cellule incubando con tampone/pozzo di permeabilizzazione da 500 μL per 15 minuti a temperatura ambiente.
Quindi, lavare brevemente le cellule 3 volte con 500 μL di PBS.

Inceppamento

Incubare le cellule in ciascun pozzo con un tampone bloccante da 500 μL per 1 ora a 4°C, per bloccare il legame anticorpale non specifico.

Incubazione di anticorpi primari

Aspirare il tampone di blocco dalle camere di scorrimento.
Quindi, aggiungere 500 μL di soluzione anticorpale primaria diluita alle cellule. (Qui, l’anti-CD107a (LAMP-1) è stato diluito 1:500 e l’anti-CD1d è stato usato non diluito (l’anticorpo monoclonale 1H6 è stato gentilmente fornito dal Dr. Randy Brutkiewicz)).
Incubare i vetrini durante la notte a 4°C.

Nota: se si esegue il sondaggio per più di un bersaglio, assicurarsi che gli anticorpi primari siano isotipi diversi. Le concentrazioni di anticorpi raccomandate variano tra i produttori e devono essere titolate prima dell’uso.

Incubazione di anticorpi secondari

Aspirare la soluzione anticorpale primaria dai pozzi.
Lavare le camere del pozzo 4 volte con 500 μL PBS.
Quindi, aggiungere 500 μL della soluzione anticorpale secondaria diluita a ciascun pozzo. (Qui, entrambi gli anticorpi secondari – anti-mouse IgG Alexafluor 647 e anti-ratto IgG Alexafluor 488 sono stati diluiti 1:2000 nel buffer di blocco).
Incubare a temperatura ambiente per 1 ora al buio.
Dopo l’incubazione, aspirare la soluzione anticorpale secondaria.
Lavare le camere 4 volte con PBS da 500 μL per rimuovere eventuali anticorpi secondari non legati.

Nota: le concentrazioni di anticorpi raccomandate variano tra i produttori e devono essere titolate prima dell’uso. Se si sonda più di un bersaglio, gli anticorpi secondari devono essere coniugati a diversi fluorofori con spettri di eccitazione/emissione unici. Tieni anche presente l’eccitazione / emissione della controstipitazione nucleare (cioè DAPI) durante la selezione dei fluorofori. La selezione del fluoroforo può essere influenzata dalla configurazione laser del microscopio confocale utilizzato. La configurazione laser della macchina determinerà quali fluorofori sono adatti per l’esperimento.

3. Coperture di montaggio

Innanzitutto, rimuovere con attenzione le camere dalla diapositiva.
Quindi, tenere la diapositiva ad angolo su una delicata pulizia e rimuovere il fluido dai bordi senza toccare le celle.
Aggiungere 1 goccia di mezzo di montaggio antifiade, contenente la macchia nucleare DAPI, su ogni sezione di celle.
Quindi, posizionare un coverslip di 20 mm x 60 mm sulla diapositiva tenendolo sui bordi con la punta delle dita. (Evitare la formazione di bolle sulle cellule, in quanto interferiscono con l’imaging).
Pulire qualsiasi mezzo di montaggio aggiuntivo sui lati con una delicata pulizia e conservare le diapositive al buio a temperatura ambiente fino a una settimana.

4. Imaging confocale

Campioni di immagini su un microscopio a scansione laser confocale. Per i dati mostrati nella Figura 2, la Nikon Eclipse Ti A1R è stata utilizzata con il software NIS Elements Advanced Research. La sezione seguente descrive in dettaglio la procedura per l’acquisizione di immagini utilizzando il software di cui sopra.

Per iniziare a immaginare le cellule, apri il ‘software NIS Elements Advanced Research‘ facendo clic sull’ ‘ icona del softwareNIS‘.
Successivamente, nella finestra di controllo fare clic sulla scheda‘TiPad’e scegliere l’obiettivo desiderato per l’imaging. (Qui è stato utilizzato il primo obiettivo 40x).
Caricare la diapositiva con le celle sullo stage e centrarla sotto l’obiettivo.
Ora, nella scheda‘A1plus Compact GUI’,impostare i laser appropriati per i fluorofori utilizzati. Fare clic sul simbolo dell’ingranaggio per aprire il menu delle impostazioni di tintura e spettrale e selezionare i canali necessari e impostare il laser per ciascun canale.
Quindi, selezionare le emissioni appropriate nel menu a discesa sotto il primo specchio dicroico.
Successivamente, nella finestra‘A1plus Compact GUI’,fare clic su‘Ch. Series’per impostare la serie di canali di linea, che imposta se i laser utilizzati spareranno sul campione contemporaneamente o in sequenza. (Qui sono state scelte le passate sequenziali, a partire dal canale 1, seguito dal canale 2, quindi dal canale 4).
Successivamente, avvia la scansione facendo clic sull’icona “Punta freccia” in alto. A questo punto mentre l’immagine è in diretta, sotto la finestra‘A1plus Compact GUI’,clicca sulla scala scorrevole e modifica la dimensione del foro stenopeico per assicurarti di limitare la luce fuori fuoco. (Qui è stata utilizzata l’impostazione più bassa disponibile (0,5).
Successivamente, regolare le impostazioni di ‘alta tensione‘ e ‘offset‘ sotto ogni laser a livelli appropriati, utilizzando le scale scorrevoli per consentire il rilevamento della colorazione specifica limitando al contempo qualsiasi potenziale colorazione di fondo. Se è disponibile un campione con colorazione positiva, iniziare con l’imaging di questo campione per ciascun canale per assicurarsi che le impostazioni laser producano rapporti segnale/rumore ottimali.
Attenzione: un’elevata intensità laser per periodi prolungati può causare fotosciviazione.
Dopo aver impostato i valori HV e offset ottimali per ciascun laser, fare clic sullascheda ‘ND Acquisition’e quindi selezionare l’icona‘Z’per impostare i parametri per la serie z. Successivamente, mentre acquisisci un’immagine dal vivo del campione, imposta prima il fondo trovando la parte inferiore dell’immagine e facendo clic sul pulsante ‘in basso ‘in basso’,quindi trova la posizione superiore del campione e fai clic sul pulsante‘in alto’. Impostare la dimensione del passo digitando specificamente la dimensione del passo preferita in μm per ogni passaggio o specificando quanti passaggi totali sono necessari.
Una volta impostati i parametri della serie z, selezionare la dimensione desiderata/risoluzione pixel dell’immagine. Per fare ciò, fai clic sulla finestra‘A1plus Compact GUI’e sotto l’icona‘size’seleziona la risoluzione desiderata. Per ridurre il rumore dell’immagine, è possibile selezionare il menu a discesa accanto al simbolo ‘ø‘ per fare la media del numero selezionato di immagini.
Ora, fai clic sulla scheda“Esegui ora”nelmenu “Acquisizione ND”per avviare l’imaging del campione.
Al termine dell’imaging, salvare l’immagine facendo clic su‘File’,quindi su‘Salva con nome’,che esporterà il file immagine con estensione‘.nd2’. Infine, ripetere il processo per ciascuno degli altri campioni.

La microscopia a fluorescenza confocale è una tecnica di imaging specializzata per la localizzazione di una proteina o di un antigene di interesse in un campione di cellula o tessuto etichettando l’antigene con un colorante fluorescente coniugato con anticorpi e rilevando il segnale fluorescente. Offre una risoluzione spaziale più elevata rispetto alla microscopia a fluorescenza a campo largo, con l’aiuto di due fori stenopeici posti ai piani focali della lente dell’obiettivo, dandogli il nome di confocale. Consente agli utenti di visualizzare la colorazione a livello subcellulare, come la differenziazione tra la colorazione superficiale della membrana e la colorazione intracellulare.

Un microscopio confocale segue un principio di base simile a un classico microscopio a fluorescenza. Il fascio proveniente da una sorgente luminosa, di solito un laser per confocale, viene riflesso da uno specchio dicroico e focalizzato da una lente obiettiva sul campione. Questa luce eccita i fluorofori per emettere una lunghezza d’onda diversa, che viaggia indietro attraverso l’obiettivo e lo specchio dicroico fino a una fotocamera o un oculare.

La maggiore risoluzione di un microscopio confocale è dovuta principalmente alla presenza di due fori stenopeici, che sono fori molto piccoli per il passaggio della luce sui percorsi di eccitazione ed emissione luminosa. I fori stenopeia sono posizionati strategicamente sul piano focale della lente dell’obiettivo. Ora, passiamo a uno schema di vista laterale della disposizione del microscopio per rivedere il percorso della luce. Dopo aver attraversato il foro stenopeico di eccitazione, il fascio di luce di eccitazione ha l’effetto di provenire da un punto focale, che consente alla lente dell’obiettivo di focalizzare la luce anche in un punto sul campione. Il fascio di emissione da questo punto focale converge verso il foro stenopeico di emissione, che gli consente di passare. Ora, durante l’eccitazione, anche i fluorofori all’interno del percorso della luce, sopra e sotto il punto focale, sono leggermente eccitati. Mentre la luce di emissione proveniente dal punto focale passa attraverso il foro stenopeico, le emissioni dai punti fuori fuoco convergono prima o dopo il foro stenopeico di emissione, e sono quindi bloccate, con conseguente riduzione della fluorescenza di fondo.

Il ciclo di eccitazione-emissione-rilevamento deve essere ripetuto per ogni punto di imaging nella regione di interesse, il che può essere fatto in diversi modi. Ad esempio, la scansione laser confocale utilizza specchi di scansione galvanometrici, che deviano la luce di eccitazione a diverse angolazioni. Quindi, spazzando il fascio di luce attraverso il campione nel piano XY. Spinning disc confocal utilizza un disco con una serie di fori stenopeici, che ruota per spostare la disposizione dei fori stenopeici. Ciò consente agli utenti di illuminare ogni volta più piccoli punti di imaging nel campione, coprendo gradualmente l’intera area mentre il disco ruota. Come risultato dei fori stenopeichi, l’immagine XY al rivelatore rappresenta uno stretto piano Z. Pertanto, le immagini possono essere raccolte da una serie di piani Z consecutivi, spesso indicati come stack Z. Da queste immagini, un software appropriato può generare una rappresentazione 3D del modello di segnale di fluorescenza nel campione.

In questo protocollo, osserverai l’immunostimazione dei fibroblasti di topo, seguita dall’imaging su un microscopio confocale per visualizzare in modo differenziale una proteina di superficie cellulare e una proteina liposomiale.

Per cominciare, usando tecniche sterili, risuscindi le cellule di interesse in 500 microlitri di mezzi di crescita per pozzo, e poi seminale nei pozzeli di un vetrino a camera a quattro pozze. Qui, stiamo usando fibroblasti di topo che sono stati trasfettate per esprimere la molecola che presenta l’antigene, CD1d. Per consentire alle cellule di aderire al vetro, posizionare lo scivolo della camera in un incubatore di anidride carbonica al 5% a 37 gradi Celsius e incubare durante la notte. Al mattino, aspirare il mezzo da ciascun pozzetti e quindi lavare le cellule una volta con 500 microlitri di PBS per alcuni secondi.

Per fissare le cellule, aggiungere 500 microlitri di soluzione di paraformaldeide all’1% in ciascun pozzo e incubare per 15 minuti a temperatura ambiente. Dopo l’incubazione, raccogliere la paraformaldeide in un contenitore di rifiuti liquidi pericolosi appropriato, quindi rimuovere eventuali resti del fissativo lavando le cellule tre volte con PBS per alcuni secondi.

Per consentire la penetrazione degli anticorpi nelle cellule, aggiungere 500 microlitri di tampone di permeabilizzazione a ciascun pozzo e incubare sul banco per 15 minuti a temperatura ambiente. Dopo la permeabilizzazione, lavare brevemente le cellule tre volte con 500 microlitri di PBS. Quindi, aggiungere 500 microlitri di tampone di blocco a ciascun pozzo e incubare per un’ora a quattro gradi Celsius per prevenire il legame anticorpale non specifico.

Preparare gli anticorpi primari, anti-CD1d e anti-LAMP-1, a concentrazioni di lavoro appropriate. Quindi, aspirare il tampone dai pozzetti e coprire le cellule in ciascun pozzetti con 500 microlitri di soluzione anticorpale primaria diluita e quindi incubare il vetrino su una superficie piana durante la notte a quattro gradi Celsius. La mattina dopo, diluire gli anticorpi secondari, in questo caso un anticorpo anti-topo e anti-ratto con tag fluorescenti distinti, in tampone di blocco a concentrazioni di lavoro appropriate. Quindi, aspirare la soluzione anticorpale primaria dai pozzi e quindi lavare le cellule quattro volte con 500 microlitri di PBS. Quindi, aggiungere 500 microlitri della soluzione anticorpale secondaria diluita a ciascun pozzo e incubare a temperatura ambiente per un’ora al buio. Dopo l’incubazione, aspirare la soluzione anticorpale secondaria e lavare i pozzi quattro volte con 500 microlitri di PBS per rimuovere qualsiasi anticorpo secondario non legato.

Per montare i campioni dopo il lavaggio finale, staccare con cura e rimuovere le camere dal vetrino. Per rimuovere il PBS residuo, tenere la diapositiva ad angolo su una delicata pulizia e rimuovere il fluido dai bordi senza toccare le celle. Una volta rimosso il PBS in eccesso, aggiungere una goccia di mezzo di montaggio antifasa, contenente la macchia nucleare DAPI, su ogni sezione di celle. Quindi, prendi un coverslip di 20 per 60 millimetri e usando solo la punta delle dita inizia ad abbassare lentamente il coverslip su entrambi i bordi, facendo attenzione a evitare la formazione di bolle sulle cellule. Pulire qualsiasi mezzo di montaggio aggiuntivo sulle diapositive con una delicata pulizia e conservare le diapositive al buio a temperatura ambiente per un massimo di una settimana.

Per iniziare a eseguire l’imaging delle celle, fare prima clic sull’icona del software NIS sul desktop. Una volta nella finestra di controllo, fai clic sulla scheda TiPad in alto e scegli l’obiettivo desiderato per l’imaging. Quindi, caricare la diapositiva con le celle sullo stage e centrarla sotto l’obiettivo. Successivamente, nella scheda A1plus Compact GUI accanto alla scheda TiPad, impostare i laser appropriati per i fluorofori utilizzati. Fare clic sul simbolo dell’ingranaggio per aprire il menu delle impostazioni di tintura e spettrale. Una volta aperto il menu delle impostazioni di tintura e spettrale, selezionare i canali necessari e impostare il laser per ciascun canale. Quindi, selezionare le emissioni appropriate nel menu a discesa sotto il primo specchio dicroico. Successivamente, nella finestra A1plus Compact GUI, fare clic su Ch.Series per impostare la serie di canali di linea, che imposta se i laser utilizzati si accenderanno sul campione contemporaneamente o in sequenza.

Successivamente, avvia la scansione facendo clic sull’icona della punta della freccia in alto. A questo punto, mentre l’immagine è in diretta, nella finestra A1plus Compact GUI, fare clic sulla scala scorrevole e modificare la dimensione del foro stenopeico per garantire la limitazione della luce sfocata. Quindi, regolare le impostazioni di alta tensione e offset sotto ciascun laser a livelli appropriati utilizzando le scale scorrevoli per consentire il rilevamento della colorazione specifica limitando al contempo qualsiasi potenziale colorazione di fondo. Se è disponibile un campione di colorazione positivo, iniziare con l’imaging di questo campione per ciascun canale per assicurarsi che le impostazioni laser producano rapporti segnale-rumore ottimali. Dopo aver impostato i valori HV e offset ottimali per ciascun laser, fare clic sulla scheda Acquisizione ND, quindi selezionare l’icona Z per impostare i parametri per la serie z.

Successivamente, mentre acquisisci un’immagine dal vivo del campione, imposta prima il fondo trovando la parte inferiore dell’immagine e facendo clic sul pulsante in basso. Quindi, trova la posizione superiore del campione e fai clic sul pulsante in alto. Impostare la dimensione del passo digitando specificamente la dimensione del passo preferita in micron per ogni passaggio o specificando quanti passaggi totali sono necessari. Per selezionare la dimensione / risoluzione pixel desiderata dell’immagine, fare clic sulla finestra AIplus Compact GUI e, sotto l’icona delle dimensioni, selezionare la risoluzione desiderata.

Per ridurre il rumore dell’immagine, è possibile selezionare il menu a discesa accanto al simbolo theta per fare la media del numero selezionato di immagini. Successivamente, fare clic sulla scheda Esegui ora nel menu Acquisizione ND per avviare l’imaging del campione. Al termine dell’imaging, salvare l’immagine facendo clic su file, quindi salva con nome, che esporterà il file di immagine con l’estensione dot-nd2. Infine, ripetere il processo per ciascuno degli altri campioni.

In questo esperimento, i fibroblasti di topo che esprimono il gene della glicoproteina di superficie CD1d sono stati fissati, immunosti e ripresi su un microscopio confocale. Questa immagine mostra una singola sezione di uno stack Z con ingrandimento 40X, dove CD1d è macchiato di rosso. Il campione è stato costato con LAMP-1, un marcatore liposomiale, in verde. La macchia nucleare DAPI è stata utilizzata per mostrare i nuclei delle cellule.

In un’immagine composita in cui i tre diversi canali sono uniti, l’aspetto del giallo deriva dalla sovrapposizione dei canali rosso e verde e indica un’area in cui CD1d e LAMP-1 sono co-localizzati nei lisosomi. Le aree in cui è presente un solo colore indicano la presenza di CD1d o LAMP-1 senza co-localizzazione. Questa immagine mostra un rendering 3D delle celle costruite da immagini catturate nello z-stack e questo metodo ha permesso la costruzione di una vista laterale di questo gruppo di celle. Questa immagine seguente mostra una fetta dello z-stack con ingrandimento 100X, dimostrando i modelli di espressione di queste due proteine in modo più dettagliato. La casella delineata rosa sul lato destro dell’immagine visualizza la sezione trasversale della coordinata x designata dalla linea rosa nell’immagine, che rappresenta la vista laterale sulla linea rosa. Allo stesso modo, la casella delineata blu nella parte inferiore dell’immagine mostra la sezione trasversale della coordinata y designata dalla linea blu nell’immagine, che rappresenta la vista frontale sulla linea blu. Il rendering 3D dell’immagine z-stack consente agli utenti di visualizzare l’immagine in 3D, visualizzando tutti i piani x, y e z. Questo può essere usato per studiare la co-localizzazione delle diverse macchie in diverse regioni all’interno della cellula.

Results

In questo esperimento, i fibroblasti di topo che esprimono il gene della glicoproteina di superficie CD1d sono stati fissati, immunosti e ripresi su un microscopio confocale. Un’immagine rappresentativa ottenuta utilizzando il protocollo di cui sopra è mostrata nella Figura 4. Nel pannello superiore di A, vengono presentate immagini a canale singolo che mostrano il modello di colorazione di ogni singolo target. Queste immagini comprendono una singola sezione (slice) dello z-stack acquisito. Il pannello di destra mostra la colorazione DAPI dei nuclei delle cellule. I pannelli centrali mostrano CD1d colorato in rosso e LAMP-1, un marcatore liposomiale, macchiato di verde. Il pannello di sinistra è un’immagine composita in cui i tre diversi canali sono uniti. L’aspetto del giallo deriva dalla sovrapposizione dei canali rosso e verde e indica un’area in cui CD1d e LAMP-1 sono co-localizzati. I risultati della colorazione confermano che CD1d è localizzato nei compartimenti endosomiali LAMP-1+. Ci sono anche aree in cui è presente un solo colore, che indica la presenza di CD1d o LAMP-1 senza co-localizzazione. Il pannello inferiore di A mostra un rendering 3D delle celle costruite da immagini catturate nello z-stack.

Il pannello B mostra una fetta dello z-stack con ingrandimento 100x dimostrando i modelli di espressione di queste due proteine in modo più dettagliato. La casella delineata rosa sul lato destro dell’immagine visualizza la sezione trasversale della coordinata x designata dalla linea rosa nell’immagine, che rappresenta la vista laterale sulla linea rosa. Allo stesso modo, la casella delineata blu nella parte inferiore dell’immagine mostra la sezione trasversale della coordinata y designata dalla linea blu nell’immagine, che rappresenta la vista frontale sulla linea blu. Il rendering 3D dell’immagine z-stack consente agli utenti di visualizzare l’immagine in 3D, visualizzando tutti i piani x, y e z.

Figura 4: Colorazione di CD1d e LAMP1. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

A, pannello superiore: Le cellule LCD1 sono state fissate, permeabilizzate e colorate con anticorpi contro CD1d (rosso) e LAMP-1 (verde, un marcatore del compartimento liposomiale). DAPI (blu, è stato utilizzato per visualizzare il nucleo). L’unione (pannello di sinistra) mostra che CD1d è localizzato nel compartimento endosomiale/liposomiale tardivo positivo lampo-1 (giallo).
A, pannello inferiore: rendering 3D delle stesse celle nel pannello superiore. Le immagini sono state acquisite utilizzando un obiettivo ad immersione in olio 40x sulla Nikon Eclipse Ti, utilizzando il software NIS Elements Advanced Research.
B: immagine 100x di celle LCD1d colorate come in A, con informazioni sullo stack per una particolare coordinata y (indicata dalla linea blu) nella parte inferiore dell’immagine (casella blu). Le informazioni sullo stack per una particolare coordinata x (indicata dalla linea rosa) sono mostrate sul lato destro dell’immagine (casella rosa).

Applications and Summary

La colorazione fluorescente confocale è una procedura relativamente semplice che si traduce in immagini di altissima qualità di campioni preparati in modo simile alla microscopia a fluorescenza convenzionale. In breve, i campioni vengono fissati, permeabilizzati, quindi bloccati. Gli anticorpi primari contro una proteina o proteine di interesse sono autorizzati a legarsi, quindi gli anticorpi secondari coniugati con fluoroforo vengono utilizzati per visualizzare la colorazione. La microscopia a fluorescenza confocale ha applicazioni in molte aree di ricerca. Ad esempio, colorando i marcatori di organelli subcellulari insieme a una proteina di interesse, la microscopia confocale può essere utilizzata per determinare le posizioni subcellulari di diverse proteine. Rispetto alla microscopia a fluorescenza convenzionale, l’imaging confocale può distinguere più efficacemente tra la superficie cellulare e la posizione intracellulare di una proteina. Inoltre, l’imaging confocale può anche essere utilizzato per determinare se due proteine co-localizzano all’interno della cellula. Sebbene non sia delineato in questo protocollo, la microscopia a fluorescenza confocale può anche essere eseguita su cellule vive per rilevare cambiamenti dinamici.

Video 1: Video realizzato nel software NIS Elements Advanced Research, evidenziando la capacità di muoversi attraverso il rendering 3D delle immagini. Fare clic qui per visualizzare questo video (fare clic con il pulsante destro del mouse per scaricare).

References

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Hoff. F. How to prepare your specimen for immunofluorescence microscopy. Philipps University Marburg, Institute of Cytobiology and Cytopathology, Germany. (2015) Available at- http://www.leica-microsystems.com.

Transcript

Confocal fluorescence microscopy is a specialized imaging technique for localization of a protein or antigen of interest in a cell or tissue sample by labeling the antigen with an antibody-conjugated fluorescent dye and detecting the fluorescent signal. It offers higher spatial resolution than wide-field fluorescence microscopy, with the help of two pinholes placed at the focal planes of the objective lens, giving it the name confocal. It enables users to visualize the staining at a subcellular level, such as the differentiation between surface membrane staining from intracellular staining.

A confocal microscope follows a similar basic principle as a classic fluorescence microscope. The beam from a light source, usually a laser for confocal, is reflected by a dichroic mirror and focused by an objective lens on the sample. This light excites the fluorophores to emit a different wavelength, which travels back through the objective lens and dichroic mirror to a camera or eyepiece.

The enhanced resolution of a confocal microscope is mainly due to the presence of two pinholes, which are very small holes for light to pass through on the excitation and emission light paths. The pinholes are strategically placed at the focal plane of the objective lens. Now, let’s switch to a side view schematic of the microscope arrangement to review the light path. After passing through the excitation pinhole, the excitation light beam has the effect of originating from a focal point, which enables the objective lens to then focus the light to a point on the sample as well. The emission beam from this focal point converges at the emission pinhole, which allows it to pass through. Now during excitation, fluorophores within the light path, above and below the focal point, are also slightly excited. While the emission light originating from the focal point passes through the pinhole, the emissions from the out-of-focus points converge before or after the emission pinhole, and are hence blocked, resulting in reduced background fluorescence.

The excitation-emission-detection cycle needs to be repeated for each imaging point in the region of interest, which can be done in a few different ways. For example, laser scanning confocal uses galvanometer scanning mirrors, which deflect the excitation light at different angles. Hence, sweeping the light beam across the specimen in the XY plane. Spinning disc confocal uses a disc with an array of pinholes, which rotates to shift the arrangement of the pinholes. This enables users to illuminate multiple small imaging points in the sample each time, gradually covering the whole area as the disc rotates. As a result of the pinholes, the XY image at the detector represents a narrow Z plane. Therefore, images can be collected from a series of consecutive Z planes, often referred to as a Z stack. From these images, an appropriate software can generate a 3D depiction of the fluorescence signal pattern in the sample.

In this protocol, you will observe immunostaining of mouse fibroblasts, followed by imaging on a confocal microscope to differentially visualize a cell surface protein and a lysosomal protein.

To begin, using sterile techniques, resuspend the cells of interest in 500 microliters of growth media per well, and then seed them into the wells of a four-well chamber slide. Here, we are using mouse fibroblasts that were transfected to express the antigen-presenting molecule, CD1d. To allow cells to adhere to the glass, place the chamber slide in a 5% carbon dioxide incubator at 37 degrees Celsius, and incubate overnight. In the morning, aspirate the media from each well, and then wash the cells once with 500 microliters of PBS for a few seconds.

To fix the cells, add 500 microliters of 1% paraformaldehyde solution into each well, and incubate for 15 minutes at room temperature. After the incubation, collect the paraformaldehyde into an appropriate hazardous liquid waste container, and then remove any remnants of the fixative by washing the cells three times with PBS for a few seconds.

To allow antibody penetration into the cells, add 500 microliters of permeabilization buffer to each well, and incubate on the bench for 15 minutes at room temperature. After permeabilization, wash the cells briefly three times with 500 microliters of PBS. Next, add 500 microliters of blocking buffer to each well, and incubate for one hour at four degrees Celsius to prevent nonspecific antibody binding.

Prepare the primary antibodies, anti-CD1d and anti-LAMP-1, at appropriate working concentrations. Then, aspirate the buffer from the wells and cover the cells in each well with 500 microliters of diluted primary antibody solution and then incubate the slide on a flat surface overnight at four degrees Celsius. The next morning, dilute the secondary antibodies, in this case an anti-mouse and anti-rat antibody with distinct fluorescent tags, in blocking buffer to appropriate working concentrations. Next, aspirate the primary antibody solution from the wells and then wash the cells four times with 500 microliters of PBS. Then, add 500 microliters of the diluted secondary antibody solution to each well, and incubate at room temperature for one hour in the dark. After the incubation, aspirate the secondary antibody solution and wash the wells four times with 500 microliters of PBS to remove any unbound secondary antibody.

To mount the samples after the final wash, carefully detach and remove the chambers from the slide. To remove the residual PBS, hold the slide at an angle over a delicate task wipe, and remove the fluid from the edges without touching the cells. Once the excess PBS is removed, add one drop of antifade mounting medium, containing the nuclear stain DAPI, onto each section of cells. Next, take a 20-by-60-millimeter coverslip, and using just fingertips start lowering the coverslip slowly on either edge, taking care to avoid bubble formation over the cells. Wipe off any extra mounting medium on the slides with a delicate task wipe and store the slides in the dark at room temperature for up to a week.

To begin imaging the cells, first click on the NIS software icon on the desktop. Once in the control window, click on the TiPad tab at the top, and choose the desired objective for imaging. Then, load the slide with cells onto the stage, and center it beneath the lens. Next, on the A1plus Compact GUI tab next to the TiPad tab, set up the lasers appropriate for the fluorophores used. Click on the gear symbol to open the dye and spectral settings menu. Once the dye and spectral settings menu is open, select the channels needed and set the laser for each channel. Then, select the appropriate emissions in the drop down menu under the first dichroic mirror. Next, under A1plus Compact GUI window, click on Ch.Series to set up the line channel series, which sets up whether the lasers used will fire on the sample simultaneously or sequentially.

After that, start scanning by clicking the arrow-tip icon on the top. At this point, while the imaging is live, under A1plus Compact GUI window, click on the sliding scale, and modify the pinhole size to assure limiting out-of-focus light. Next, adjust the high voltage and offset settings under each laser to appropriate levels by using the sliding scales to enable detection of the specific staining while limiting any potential background staining. If a positive staining sample is available, start by imaging this sample for each channel to make sure the laser settings yield optimal signal-to-noise ratios. After setting the optimal HV and offset values for each laser, click on the ND Acquisition tab, and then select the Z icon to set up the parameters for the z series.

Next, while acquiring a live image of the sample, first set the bottom by finding the bottom of the image and clicking the bottom button. Then, find the top position of the sample and click the top button. Set the step size either by specifically typing the preferred step size in microns for each step or by specifying how many total steps are needed. To select the desired size/ pixel resolution of the image, click the Aiplus Compact GUI window, and under the size icon, select the desired resolution.

To decrease the noise of the image, you can select the drop-down menu next to the theta symbol to average the selected number of images. After this, click the Run Now tab on the ND Acquisition menu in order to start imaging the sample. After imaging is complete, save the image by clicking file, then save as, which will export the image file with the extension dot-nd2. Finally, repeat the process for each of the other samples.

In this experiment, mouse fibroblasts expressing the surface glycoprotein gene CD1d were fixed, immunostained, and imaged on a confocal microscope. This image shows a single section of a Z stack at 40X magnification, where CD1d is stained in red. The sample was costained with LAMP-1, a lysosomal marker, in green. Nuclear stain DAPI was used to show the nuclei of the cells.

In a composite image where the three different channels are merged, the appearance of yellow results from overlap of the red and green channels, and indicates an area where CD1d and LAMP-1 are co-localized in the lysosomes. Areas where only one color is present indicate the presence of CD1d or LAMP-1 without co-localization. This image shows a 3D rendering of the cells constructed from images captured in the z-stack and this method enabled the construction of a side view of this group of cells. This following image shows a slice out of the z-stack at 100X magnification, demonstrating the expression patterns of these two proteins in greater detail. The pink outlined box on the right side of the image displays the cross-section of the x-coordinate designated by the pink line in the image, which represents the side view at the pink line. Similarly, the blue outlined box on the bottom of the image shows the cross-section of the y-coordinate designated by the blue line in the image, which represents the front view at the blue line. The 3D rendering of the z-stack image enables users to view the image in 3D, visualizing all of the x, y, and z planes. This can be used to study co-localization of the different stains at different regions within the cell.

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