Tecniche basate sull'immuno-precipitazione: purificazione di proteine endogene con l'impiego di microsfere di agarosio

1. Immunoprecipitazione con pere di agarose della proteina A/G PLUS

Preparazione del losato cellulare

1. Centrifugare 10⁸ timociti in una microcentrifuga a 13.000 giri/min per 3 minuti e rimuovere il surnatante.
   Nota: Il numero di cellule varierà a seconda dei livelli di espressione della proteina desiderata e del tipo di cellula scelto.
2. Sospendere di ricaspendere le cellule nel tampone di lisi da 500 μL RIPA con PMSF.
3. Interrompere le cellule usando alcuni impulsi rapidi con un vortice e quindi aspirare il lisirato un paio di volte con un ago da 25 G attaccato a una siringa.
   Nota: Evita di creare bolle. Utilizzare un ago più grande come un ago da 21 G per tipi di cellule più grandi.
4. Incubare il lisiato cellulare sul ghiaccio per 10 minuti.
5. Centrifugare il lisidato a 13.000 giri/min per 15 min a 4°C.
6. Trasferire il surnatante in un tubo microcentrifuga fresco ed etichettato.

Pre-compensazione

7. Aggiungere al lisi 20 μL di proteine A/G PLUS perle di agarose e 1 μg di un anticorpo di controllo dell'isotipo (qui viene utilizzato l'anticorpo di controllo dell'isotipo IgG1 del topo).
   Nota: La scelta dell'anticorpo isotipo utilizzato dipenderà dall'anticorpo proteina-specifica utilizzato più avanti nella fase di pull-down.
8. Incubare la miscela di lisi su un rotatore centrifugo in cella frigorifera (4°C) per 30 min.
9. Centrifugare il campione a 3200 giri/min per 30 s a 4°C.
10. Trasferire il surnatante pre-eliminato in un tubo microcentrifuga fresco, etichettato, da 1,5 mL. Scartare il pellet.

Determinazione della concentrazione proteica

11. Determinare la concentrazione proteica del lizzata cellulare eseguendo un test di Bradford.
12. Aliquota 1000 μL Bradford Reagent in 7 tubi microcentrifuga.
13. Aggiungere le seguenti quantità di BSA protein standard (2 mg/mL) in 6 dei tubi (Tabella 1).

Numero del tubo	Volume BSA (μL) (2 mg/mL)	Concentrazione proteica (μg/μL)
1	0	0
2	1	2
3	2	4
4	3	6
5	4	8
6	5	10

Tabella 1: Quantità standard di proteine BSA

14. Nel 7^° tubo, aggiungere 1 μL del lisirato pre-eliminato.
    Nota: Per garantire che la concentrazione del campione rientri nell'intervallo di rilevamento del test, preparare e analizzare anche una diluizione del lsato 1:2 o 1:5.
15. Posizionare 200 μL da ciascuno dei 7 tubi in singoli pozzetti di una piastra a fondo piatto a 96 pozzetti ripetendo ogni campione in triplice copia.
16. Lettura della piastra su un lettore di piastre a 595 nm.
17. Generare la curva standard in excel e calcolare la concentrazione proteica del lisirato pre-eliminato.

Abbattere

18. Etichettare due tubi microcentrifuga freschi da 1,5 ml, uno come "controllo" e l'altro come "test", che in questo esempio è c-myc.
19. Inserire 500 μg di lisato pre-eliminato in ciascuno di questi tubi.
    Nota: La quantità di proteine utilizzate qui dipenderà dalla quantità di proteina desiderata per essere purificata.
20. Portare il volume totale per ogni tubo fino a 500 μL utilizzando il tampone di lisi.
21. Aggiungere 2 μg di anticorpo anti-c-myc alla provetta del gruppo di prova e 2 μg di anticorpo di controllo dell'isotipo IgG1 del topo al gruppo di controllo.
    Nota: la quantità di anticorpi dipenderà dall'efficacia dell'anticorpo e dalla quantità della proteina bersaglio.
22. Incubare i tubi su un rotatore nella cella frigorifera (4°C) per 2 ore.
23. Aggiungere 20 μL di proteine A/G PLUS perle di agarose a ciascun tubo.
    Nota: Si consiglia di utilizzare punte per pipette con l'estremità tagliata per evitare danni alle perle.
24. Incubare su un rotatore in camera fredda (4°C) durante la notte.
    Nota: A seconda della proteina bersaglio e dell'efficacia degli anticorpi, questo passaggio può variare da 1 ora a durante la notte.
25. Centrifugare i tubi a 3200 giri/min per 30 s 4°C per tirare giù le perle.
26. Aspirare il surnatante da ciascun tubo.
    Nota: La proteina bersaglio è ora legata alle perle.
27. Lavare le perle due volte utilizzando il PBS di Dulbecco da 500 μL 1X.
28. Centrifugare i tubi a 3200 giri/min per 30 s 4°C.
    Nota: Per un lavaggio più rigoroso, utilizzare tamponi più rigorosi, come RIPA.
29. Aspirare il tampone da ciascun tubo. Utilizzando punte per il caricamento del gel, rimuovere qualsiasi tampone residuo dalle pere e mantenere le pere sul ghiaccio per eluire la proteina.
    Nota: in questo esempio, la proteina viene eluita nel buffer di esecuzione SDS-PAGE facendo bollire le pere, per l'analisi Western blot. Questo approccio è adatto per verificare i risultati IP o per esaminare le interazioni proteina-proteina. Per altre applicazioni a valle, come la purificazione delle proteine per l'analisi strutturale o enzimatica, vengono utilizzati sistemi più sofisticati, come i tag epitopi (flag-tag o myc-tag) per evitare l'eluizione dell'anticorpo con la proteina di interesse.

2. Verifica IP tramite Western Blot Analysis

SDS-PAGE Elettroforesi:

1. Sospendere nuovamente le perle in colorante di caricamento SDS-PAGE da 20 μL contenente β-mercapto-ethonolo.
2. Far bollire i campioni a 95 °C per 5 minuti.
3. Centrifugare le perle a 13.000 giri/min per 10 s a temperatura ambiente.
4. Utilizzando punte di caricamento del gel, pipettare con cura i campioni ottenuti dalle perle e caricarli in pozzi di gel SDS-PAGE con gradiente del 4-15%.
5. Oltre ai campioni, caricare una corsia con una scala proteica e una corsia con il lisirato pre-eliminato per fungere da controllo del carico.
6. Eseguire a 100 V fino a quando la parte anteriore del colorante raggiunge il fondo del gel (~ 1h).

Analisi Western Blot:

7. Fai il sandwich Western blot, assicurandoti che la membrana PVDF sia tra gel e catodo rosso.
8. Trasferimento per 1 ora a 100 V.
9. Posizionare la membrana in un tampone di blocco da 5 ml a temperatura ambiente per 1 ora su un bilanciere a bassa impostazione, per bloccare i siti di legame proteico non specifici.
   Nota: potrebbe essere necessario aumentare i volumi del tampone bloccante, dell'anticorpo primario, dell'anticorpo secondario e dei lavaggi per macchie di dimensioni maggiori.
10. Incubare la macchia con 5 mL di anticorpo anti-c-myc nel tampone bloccante durante la notte a 4 ° C sul bilanciere a un'impostazione bassa.
    Nota: l'anticorpo utilizzato qui dovrebbe essere diverso da quello utilizzato nella fase di pull-down.
11. Lavare la macchia 3-6 volte utilizzando 5 ml di TBST con ogni lavaggio di 5 minuti a temperatura ambiente su un bilanciere a bassa impostazione.
12. Incubare la macchia con anticorpo secondario a catena leggera anti-coniglio con etichetta HRP in tampone di blocco, per 1 ora a temperatura ambiente su bilanciere a bassa impostazione.
    Nota: la scelta dell'anticorpo secondario dipenderà dall'anticorpo primario utilizzato per il Western blot. Inoltre, nel protocollo viene utilizzato un secondario specifico per catena leggera perché la proteina bersaglio è vicina in peso molecolare alla catena pesante dell'anticorpo. Se la proteina bersaglio è vicina a 50kDa, utilizzare un secondario specifico per la catena leggera. Se la proteina bersaglio è vicina a 25kDa, utilizzare e catena pesante specifica secondaria.
13. Lavare la macchia 3-6 volte utilizzando 5 ml di TBST con ogni lavaggio di 5 minuti a temperatura ambiente su un bilanciere a bassa impostazione.
14. Rimuovere il liquido dalla macchia e tamponare il bordo della macchia sulle salviette da laboratorio per rimuovere il liquido in eccesso.
15. Coprire la macchia con 1x reagente di rivelazione chemiluminescente' e incubare per 1 min.
    Nota: I seguenti passaggi devono essere eseguiti in rapida successione poiché il reagente di rilevamento è sensibile alla luce e al tempo.
16. Tamponare il bordo della macchia sulle salviette da laboratorio per rimuovere il reagente di rilevamento in eccesso.
17. Posizionare la macchia sulla superficie di imaging del vassoio Imager.
    Nota: le macchie chemiluminescenti possono anche essere visualizzate utilizzando la pellicola.
18. Immagine utilizzando il 'Chemiluminescent Program' per catturare più punti temporali da 10 s a 5 min.
    Nota: il momento ottimale può cambiare in base alla quantità di proteine e alla qualità degli anticorpi.
19. Scegli un'immagine con visibilità ottimale della banda e quindi esporta quell'immagine.
20. Prima di spostare la macchia, scatta una foto della macchia usando l'imager, per catturare la posizione della scala. Quindi, esporta anche quell'immagine.
21. Utilizzando un software di preparazione delle diapositive (ad esempio PowerPoint), allineare le bande e le immagini ladder per formare una singola immagine.