Tecniche basate sull'immuno-precipitazione: purificazione di proteine endogene con l'impiego di microsfere di agarosio

L'immunoprecipitazione, o IP, è una tecnica ampiamente utilizzata per isolare una proteina di interesse da una cellula o da un lisato tissutale o da un fluido corporeo per la caratterizzazione delle proteine o per studiare le interazioni proteina-proteina.

Il processo inizia con un anticorpo, che ha un'elevata affinità e specificità per la proteina bersaglio. Questo anticorpo viene miscelato con il campione, consentendo la formazione di complessi anticorpo-bersaglio. Qualsiasi proteina legata alla proteina bersaglio si lega indirettamente all'anticorpo nel processo. Successivamente, la soluzione viene incubata con perle di agarosio, coniugate a una proteina batterica, che ha una forte affinità per la regione costante degli anticorpi. La proteina batterica si lega all'anticorpo e collega i complessi anticorpo-bersaglio alle perline. Quindi, la soluzione viene centrifugata per far precipitare le perle, estraendo così l'intero complesso contenente l'anticorpo legante, la proteina bersaglio e tutte le proteine interagenti. Infine, le proteine legate vengono estratte dalle perle e rilasciate l'una dall'altra e vengono utilizzate per ulteriori analisi con tecniche come il Western blotting.

Diverse varianti di diverse parti di questa tecnica sono comunemente utilizzate, come il pre-clearing, l'uso di tag peptidici o biglie magnetiche o l'analisi di altri partner non leganti le proteine. L'IP può essere preceduta da una fase di pre-clearing, per rimuovere le proteine leganti gli anticorpi non specifiche nel campione e ridurre al minimo lo sfondo. Ciò comporta prima l'incubazione del campione con anticorpi di controllo dell'isotipo, consentendo loro di legarsi a queste proteine, e quindi l'utilizzo di perle di agarosio per precipitare i complessi. Il campione è quindi pronto per procedere all'IP effettivo.

I tag peptidici sono utili se un anticorpo specifico non è disponibile per l'IP. Qui, la proteina bersaglio può essere geneticamente modificata per contenere un tag epitopico peptidico e un anticorpo contro il tag è in grado di estrarre la proteina di interesse. Le perle magnetiche vengono spesso utilizzate al posto dell'agarosio per far precipitare il bersaglio. Dopo essersi legato al complesso anticorpo-bersaglio, la provetta del campione viene posta in un forte campo magnetico, che estrae le perle dalla soluzione. Ciò elimina la necessità di centrifugazione e migliora la velocità e la praticità.

L'immunoprecipitazione viene utilizzata anche per lo studio delle proteine leganti il DNA o l'RNA ed è nota rispettivamente come immunoprecipitazione della cromatina e immunoprecipitazione dell'RNA. Queste variazioni sono utili per la risoluzione dei problemi e l'adattamento del metodo a diverse applicazioni sperimentali. In questo video, osserverai come pre-eliminare un lisato cellulare ed eseguire l'immunoprecipitazione per estrarre una proteina di interesse, seguita dall'analisi Western blot per convalidare l'esperimento.

Per iniziare, posizionare le cellule pre-raccolte in una microcentrifuga e centrifugare a 13 mila giri al minuto per tre minuti. Dopo la centrifuga, rimuovere il surnatante e quindi risospendere le cellule in 500 microlitri di tampone di lisi RIPA con PMSF. Ora, disgregare le cellule con alcuni impulsi rapidi con un vortice e poi aspirare il lisato un paio di volte con un ago calibro 25 attaccato a una siringa, facendo attenzione a non creare bolle. Mettere le celle sul ghiaccio per 15 minuti. Dopo aver incubato i campioni con ghiaccio, centrifugare il lisato per 15 minuti a quattro gradi Celsius.

Etichettare una nuova provetta per microcentrifuga da 1,5 millilitri. Dopo la centrifuga, trasferire il surnatante nel tubo appena etichettato e scartare il pellet. Successivamente, eliminare preventivamente il lisato dai contaminanti che si legano in modo non specifico alle perle di agarosio o all'anticorpo primario aggiungendo 20 microlitri di perle di agarosio Protein A/G PLUS e un microgrammo di un anticorpo di controllo isotipo al lisato, che in questo esempio è un controllo isotipico IgG1 di topo. Incubare la provetta su un rotatore in una cella frigorifera per 30 minuti. Dopo aver ruotato il lisato nella cella frigorifera per 30 minuti, centrifugare il campione a 3200 giri/min per 30 secondi a quattro gradi Celsius. Rimuovere la provetta dalla centrifuga e trasferire il surnatante pre-autorizzato in una provetta per microcentrifuga da 1,5 millilitri appena etichettata. Scartare il pellet.

Ora, determina la concentrazione proteica del lisato cellulare eseguendo un saggio di Bradford. Etichetta sette 1. Provette per microcentrifuga da 5 millilitri da una a sei e campionare e aliquotare 1000 microlitri del reagente Bradford in ciascuna provetta. Sei dei tubi saranno utilizzati per creare una curva standard aggiungendo varie quantità di quantità note di BSA a ciascun tubo. Gli importi da aggiungere sono elencati in questa tabella. Nella settima provetta del campione, aggiungere un microlitro di lisato pre-chiarificato. Posizionare 200 microlitri da ciascuna delle sette provette nei singoli pozzetti di una piastra a fondo piatto da 96 pozzetti, ripetendo ogni campione in triplicato in modo che ci siano tre colonne di sette campioni. Leggere la lastra su un lettore di piastre, utilizzando una lunghezza d'onda di 595 nanometri. Dopo aver creato una curva standard in Excel, calcolare la concentrazione proteica del lisato pre-eliminato.

Quindi, etichettare due provette per microcentrifuga da 1,5 millilitri, una come controllo e l'altra come test, che in questo esempio sarà l'anticorpo c-myc. Mettere 500 microgrammi di lisato pre-chiarificato in ciascuna di queste provette e poi portare il volume totale per ciascuna provetta fino a 500 microlitri utilizzando il tampone di lisi. Quindi, aggiungere due microgrammi dell'anticorpo anti-c-myc alla provetta del gruppo di test. Per il controllo, aggiungere due microgrammi dell'anticorpo di controllo dell'isotipo IgG1 di topo. Una volta aggiunti gli anticorpi alle provette, posizionare i campioni su un rotatore in una cella frigorifera e incubare per due ore. Ora aggiungi le perle di agarosio. Per fare ciò, si consiglia di tagliare l'estremità di un puntale per pipetta e poi, utilizzando questo puntale modificato, aggiungere 200 microlitri di perle di agarosio Protein A/G PLUS a ciascuna provetta. Incubare le provette su un rotatore nella cella frigorifera per una notte.

Dopo l'incubazione, rimuovere le provette dal rotatore e centrifugare i lisati nella microcentrifuga per abbassare le perle. Al termine della centrifuga, rimuovere le provette dalla centrifuga e aspirare il surnatante da ciascuna provetta. Successivamente, lavare le perline utilizzando 500 microlitri di 1X Dulbecco's PBS. Mettere le provette in una microcentrifuga e centrifugare per 30 secondi a quattro gradi Celsius. Successivamente, rimuovere il surnatante. Ripetere le fasi di lavaggio e centrifugazione ancora una volta per un totale di due volte. Rimuovere le provette dalla microcentrifuga e aspirare il tampone da ciascuna provetta. Utilizzando le punte di caricamento del gel, rimuovere l'eventuale tampone rimasto dalle perline, mantenendo le perle sul ghiaccio per eluire la proteina legata.

In questo esempio, la proteina viene eluita nel tampone di esecuzione SDS-PAGE mediante ebollizione per l'analisi Western blot. Per fare ciò, risospendere le perle in 20 microlitri di colorante di caricamento SDS-PAGE contenente beta-mercaptoetanolo, o BME. Far bollire i campioni a 95 gradi Celsius per cinque minuti per dissociare gli immunocomplessi dalle perline. Quindi, centrifugare le perle alla massima velocità per 10 secondi a temperatura ambiente. Togliere le provette dalla microcentrifuga e tenerle in una griglia a temperatura ambiente. Utilizzando i puntali di caricamento del gel, pipettare con cura i campioni dalle perle e caricarli in pozzetti di gel SDS-PAGE con gradiente dal 4 al 15%. Oltre ai campioni, caricare una corsia con una scala proteica e una corsia con il lisato pre-eliminato per fungere da controllo di caricamento. Una volta caricato il gel, farlo funzionare a 100 volt.

Dopo che il fronte del colorante ha raggiunto il fondo del gel, il che dovrebbe richiedere circa un'ora, fermare il gel e creare un sandwich Western blot, assicurandosi che la membrana PVDF si trovi tra il gel e il catodo. Posizionare il sandwich Western blot nell'apparecchio di trasferimento e trasferire le proteine sul gel sulla membrana per un'ora a 100 volt. Al termine del trasferimento, posizionare la membrana in cinque millilitri di blocco per evitare che gli anticorpi si leghino in modo non specifico alla membrana. Oscillare a bassa temperatura per un'ora a temperatura ambiente. Quando il timer suona, rimuovere il buffer di blocco. Aggiungere cinque millilitri di tampone bloccante con l'anticorpo di rilevamento alla membrana. Qui viene utilizzato un anticorpo anti-c-myc, che è diverso da quello utilizzato per il pull down.

Incubare il blot durante la notte, a quattro gradi Celsius su un bilanciere a bassa temperatura. Dopo l'incubazione, rimuovere l'anticorpo e il tampone bloccante. Lavare la macchia, utilizzando cinque millilitri di TBST per cinque minuti a temperatura ambiente, su un bilanciere a bassa temperatura. Questa fase di lavaggio deve essere ripetuta da due a cinque volte per un totale di tre-sei lavaggi, utilizzando TBST fresco per ogni lavaggio. Aggiungere cinque millilitri di uno a 1000 anticorpi secondari e tampone bloccante al blot. In questo caso, l'anticorpo secondario è la catena leggera anti-coniglio marcata con HRP. Incubare il blot su un bilanciere a bassa temperatura per uno a temperatura ambiente. Quindi, rimuovere il tampone e lavare la macchia con cinque millilitri di TBST. Incubare questo lavaggio su un bilanciere a bassa temperatura per cinque minuti a temperatura ambiente. Ripetere questo lavaggio per un totale di sei-12 lavaggi, ciascuno con cinque millilitri freschi di TBST. Rimuovere il lavaggio finale versando prima il liquido dalla macchia. Quindi, usando una pinzetta, tampona il bordo della macchia su una salvietta da laboratorio per rimuovere il liquido in eccesso e poi metti la macchia in un nuovo contenitore. Quindi, coprire il blot con il reagente di rilevamento chemiluminescente 1X e incubare per un minuto.

Lavorando rapidamente, tamponare il bordo del blot su un panno da laboratorio per rimuovere il reagente di rilevamento in eccesso, quindi posizionare il blot sulla superficie di imaging del vassoio dell'imager. Immagine utilizzando il programma Chemiluminescente per acquisire più punti temporali da 10 a 30 secondi. Dopo aver creato l'immagine del blot, scegliere un'immagine con una visibilità ottimale della banda e quindi esportare l'immagine. Prima di spostare la macchia, utilizzare l'imager per scattare una foto della macchia e acquisire la posizione della scala. Quindi, esporta anche quell'immagine. Infine, utilizzando un software di preparazione delle diapositive, come PowerPoint, allineare le bande e le immagini ladder per formare un'unica immagine.

Questa immagine mostra il risultato del Western blot per l'immunoprecipitazione della proteina c-myc da cellule di timociti. Da sinistra a destra, le corsie rappresentano il controllo isotipo, l'IP c-myc e l'input del lisato pre-cancellato. La corsia all'estrema destra è un'immagine fusa della scala dei pesi molecolari. La banda forte, a circa 25 kilodalton, proviene dalla catena leggera e quella a 50 kilodalton proviene dalla catena pesante dell'anticorpo legante e non è specifica per l'IP o per i campioni. C-myc corre intorno ai 67 kilodalton su Western blots ed è solitamente visibile appena sotto la banda ladder di 75 kilodalton. In questo blot, la banda c-myc è visibile nella seconda corsia ma assente nella prima corsia, indicando che l'anticorpo IP ha abbattuto con successo c-myc. Non c'è una banda visibile nella corsia del lisato pre-cancellata, suggerendo che questa proteina ha bassi livelli di espressione endogena.