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Creazione di una colonna di Winogradsky: un metodo per arricchire le specie microbiche presenti in un campione di sedimento

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Creating a Winogradsky Column: A Method to Enrich the Microbial Species in a Sediment Sample
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6.2: Serial Dilutions and Plating: Microbial Enumeration

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08:08 min
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April 30, 2023

Panoramica

Fonte: Elizabeth Suter1, Christopher Corbo1, Jonathan Blaize1
1 Dipartimento di Scienze Biologiche, Wagner College, 1 Campus Road, Staten Island NY, 10301

La colonna Winogradsky è un ecosistema in miniatura e chiuso utilizzato per arricchire le comunità microbiche dei sedimenti, in particolare quelle coinvolte nel ciclo dello zolfo. La colonna fu utilizzata per la prima volta da Sergei Winogradsky nel 1880 e da allora è stata applicata nello studio di molti microrganismi diversi coinvolti nella biogeochimica, come fotosintetizzatori, ossidanti dello zolfo, riduttori di solfato, metanogeni, ossidanti del ferro, ciclori di azoto e altro (1,2).

La maggior parte dei microrganismi sulla Terra sono considerati incoltibili, il che significa che non possono essere isolati in una provetta o su una capsula di Petri (3). Ciò è dovuto a molti fattori, tra cui il fatto che i microrganismi dipendono da altri per determinati prodotti metabolici. Le condizioni in una colonna di Winogradsky imitano da vicino l’habitat naturale di un microrganismo, comprese le loro interazioni con altri organismi, e consentono di farli crescere in laboratorio. Pertanto, questa tecnica consente agli scienziati di studiare questi organismi e capire quanto siano importanti per i cicli biogeochimici della Terra senza doverli coltivare in isolamento.

Gli ambienti della Terra sono pieni di microrganismi che prosperano in tutti i tipi di habitat,come suoli, acqua oceanica, nuvole e sedimenti di acque profonde. In tutti gli habitat, i microrganismi dipendono l’uno dall’altro. Man mano che un microrganismo cresce, consuma particolari substrati,inclusi combustibili ricchi di carbonio come zuccheri e sostanze nutritive, vitamine e gas respiratori come l’ossigeno. Quando queste importanti risorse si esauriscono, diversi microrganismi con diverse esigenze metaboliche possono quindi fiorire e prosperare. Ad esempio, nella colonna Winogradsky, i microbi consumano prima il materiale organico aggiunto mentre esauriscono l’ossigeno negli strati inferiori della colonna. Una volta esaurito l’ossigeno, gli organismi anaerobici possono quindi prendere il sopravvento e consumare diversi materiali organici. Questo sviluppo consecutivo di diverse comunità microbiche nel tempo è chiamato successione (4). La successione microbica è importante in una colonna di Winogradsky, dove l’attività microbica cambia la chimica del sedimento, che quindi influenza l’attività di altri microbi e così via. Molti microrganismi nei suoli e nei sedimenti vivono anche lungo gradienti, che sono zone di transizione tra due diversi tipi di habitat in base alle concentrazioni di substrati (5). Nel punto corretto del gradiente, un microbo può ricevere quantità ottimali di diversi substrati. Man mano che una colonna winogradsky si sviluppa, inizia a imitare questi gradienti naturali, in particolare nell’ossigeno e nel solfuro (Fig. 1).

Figure 1
Figura 1: Rappresentazione dei gradienti di ossigeno (O2) e solfuro (H2S) che si sviluppano in una colonna di Winogradsky.

In una colonna Winogradsky, il fango e l’acqua di uno stagno o di una zona umida sono mescolati in una colonna trasparente e lasciati incubare, in genere alla luce. Ulteriori substrati vengono aggiunti alla colonna per fornire alla comunità fonti di carbonio, di solito sotto forma di cellulosa e zolfo. I fotosintetizzatori in genere iniziano a crescere negli strati superiori del sedimento. Questi microrganismi fotosintetici sono in gran parte composti da cianobatteri, che producono ossigeno e appaiono come uno strato verde o rosso-marrone (Fig. 2, Tabella 1). Mentre la fotosintesi produce ossigeno, l’ossigeno non è molto solubile in acqua e diminuisce al di sotto di questo strato (Fig. 1). Questo crea un gradiente di ossigeno, che va da alte concentrazioni di ossigeno negli strati superiori a zero ossigeno negli strati inferiori. Lo strato ossigenato è chiamato strato aerobico e lo strato senza ossigeno è chiamato strato anaerobico.

Nello strato anaerobico, molte diverse comunità microbiche possono proliferare a seconda del tipo e della quantità di substrati disponibili, della fonte dei microbi iniziali e della porosità del sedimento. Nella parte inferiore della colonna, gli organismi che anaerobamente abbattono la materia organica possono prosperare. La fermentazione microbica produce acidi organici dalla scomposizione della cellulosa. Questi acidi organici possono quindi essere utilizzati dai riduttori di solfato, che ossidano quelle sostanze organiche usando il solfato e producono solfuro come sottoprodotto. L’attività dei riduttori di solfato è indicata se il sedimento diventa nero, perché ferro e solfuro reagiscono per formare minerali di solfuro di ferro nero (Fig. 2, Tabella 1). Il solfuro si diffonde anche verso l’alto, creando un altro gradiente in cui le concentrazioni di solfuro sono alte nella parte inferiore della colonna e basse nella parte superiore della colonna (Fig. 1).

Vicino al centro della colonna, gli ossidanti di zolfo sfruttano l’apporto di ossigeno dall’alto e solfuro dal basso. Con la giusta quantità di luce, gli ossidanti fotosintetici dello zolfo possono svilupparsi in questi strati. Questi organismi sono noti come batteri dello zolfo verde e viola e spesso appaiono come filamenti e macchie verdi, viola o rosso porpora (Fig. 2, Tabella 1). I batteri dello zolfo verde hanno una maggiore tolleranza per il solfuro e di solito si sviluppano nello strato direttamente sotto i batteri dello zolfo viola. Sopra i batteri dello zolfo viola, possono anche svilupparsi batteri viola non solforo. Questi organismi fotosintetizzano usando acidi organici come donatori di elettroni invece di solfuro e spesso appaiono come uno strato rosso, viola, arancione o marrone. Gli ossidanti di zolfo non fotosintetici possono svilupparsi sopra i batteri viola non solforati, e questi di solito appaiono come filamenti bianchi (Fig. 2, Tabella 1). Inoltre, le bolle possono anche formarsi nella colonna Winogradsky. Le bolle negli strati aerobici indicano la produzione di ossigeno da parte dei cianobatteri. Le bolle negli strati anaerobici sono probabilmente dovute all’attività dei metanogeni,organismi che anaerobicamente abbattono la materia organica e formano il metano come sottoprodotto.

Posizione nella colonna Gruppo funzionale Esempi di organismi Indicatore visivo
In alto Fotosintetizzatori Cianobatteri Strato verde o bruno-rossastro. A volte bolle di ossigeno.
Ossidanti dello zolfo non fotosintetici Beggiatoa, Thiobacilus Strato bianco.
Batteri viola nonsolforo Rhodomicrobium, Rhodospirilum, Rhodopseuodmonas Strato rosso, viola, arancione o marrone.
Batteri dello zolfo viola Cromatio Strato viola o rosso porpora.
Batteri dello zolfo verde Clorobio Strato verde.
Batteri che riducono il solfato Desulfovibrio, Desulfotomaculum, Desulfobacter, Desulfuromonas Strato nero.
Fondoschiena Metanogeni Metanococco, Metanosarcina A volte bolle di metano.

Tabella 1: I principali gruppi di batteri che possono apparire in una classica colonna Winogradsky, dall’alto verso il basso. Vengono forniti esempi di organismi di ciascun gruppo e vengono elencati gli indicatori visivi di ciascuno strato di organismi. Basato su Perry et al. (2002) e Rogan et al. (2005).

Procedura

1. Configurazione

  1. Per impostare una colonna Winogradsky, avrai bisogno di alcune forniture di base:
    • Una pala, un secchio e una bottiglia per raccogliere i campioni sul campo
    • Un recipiente verticale e trasparente, come un cilindro graduato o una bottiglia d’acqua di plastica di circa 1L
    • Involucro di plastica e elastici
    • grandi ciotole di miscelazione e cucchiaio grande per mescolare
    • Una fonte di zolfo (tuorlo d’uovo o solfato di calcio)
    • Una fonte di carbonio organico (cellulosa, sotto forma di giornale triturato)
    • Una fonte di luce (finestra soleggiata o lampada da tavolo)
    • Suolo o fango raccolti da una palude, zona umida, stagno o ruscello
    • Acqua dello stesso habitat
    • FACOLTATIVO Per alcuni degli esperimenti facoltativi descritti in questo protocollo sarà necessario quanto segue:
      • Sale da tavola
      • Cellophane di colore diverso
      • Una fonte di ferro (come un chiodo o lana d’acciaio)
      • Un frigorifero con una fonte di luce
      • Un radiatore vicino a una fonte di luce
  2. Se si utilizza una bottiglia d’acqua di plastica, tagliare l’area del collo in modo che la colonna sia di forma cilindrica. Rimuovere eventuali involucri in modo che la luce possa penetrare attraverso la plastica.
  3. Le uova crude possono contenere Salmonella e devono essere maneggiate con cura. Dovrebbero essere seguite tecniche adeguate per il lavaggio delle mani. In alternativa, è possibile utilizzare l’uovo sodo. Inoltre, non c’è modo di sapere con certezza se fango o sedimenti sono contaminati da acque reflue o altre sostanze nocive. I guanti devono essere usati quando si mescola il fango e si imposta la colonna.

2. Assemblaggio di una colonna Winogradsky

  1. Usando la pala, scavare e raccogliere il fango nel secchio. I sedimenti dovrebbero essere vicino al bordo dell’acqua e completamente saturi di acqua. Avrai bisogno di abbastanza fango per riempire ogni colonna Winogradsky. Raccogliere un po ‘d’acqua dalla stessa fonte nella bottiglia del campione (sono necessari circa 3000 ml per colonna).
  2. In laboratorio, trasferisci abbastanza fango nella prima ciotola di miscelazione per riempire ~ 75% della colonna di volume da 1 litro. Quindi, setacciare per rimuovere grandi rocce, ramoscelli o foglie mentre si utilizza il cucchiaio per rompere i ciuffi.
  3. Aggiungi un po ‘dell’acqua che hai raccolto nella ciotola di miscelazione mentre mescoli. Aggiungere fino a quando la consistenza della miscela acqua-fango è come un frappè. Continua ad assicurarti che non ci siano grumi.
  4. Trasferire circa 1/3 del frappè di fango d’acqua nella seconda ciotola. Aggiungere il tuorlo d’uovo e una manciata di giornale tritato e mescolare.
  5. Aggiungere la miscela di fango, tuorlo d’uovo e giornale alla colonna fino a quando la colonna è piena di circa 1/4.
  6. Aggiungere la normale miscela acqua-fango nella colonna fino a quando la colonna è piena di circa 3/4.
  7. Aggiungi l’acqua aggiuntiva alla colonna, lasciando solo un piccolo spazio (~ 1/2 pollice) di aria in cima.
  8. Coprire la colonna con un involucro di plastica e fissare con un elastico.
  9. Incubare la colonna nella luce a temperatura ambiente.
  10. Per le prossime 4-8 settimane, monitorare i cambiamenti nella colonna Winogradsky per lo sviluppo di diversi strati colorati e la formazione di bolle, come descritto nella Tabella 1. Inoltre, è necessario registrare il tempo necessario per lo sviluppo di diversi livelli.

3. Modifiche opzionali alla colonna Winogradsky classica

  1. Aggiungere 25-50 g di sale per 1L di colonna Winogradsky al fango raccolto prima di aggiungere acqua e mescolare (passaggio 2.3). L’aggiunta di sale seleziona per i batteri alofili (amanti del sale).
  2. Substrati alternativi, come il ferro, sotto forma di chiodo o lana d’acciaio, possono essere aggiunti alla colonna insieme al tuorlo d’uovo e al giornale triturato (passaggio 2.4). Questo arricchirà i batteri ossidanti il ferro, come la Gallionella,e apparirà come uno strato color ruggine.
  3. Invece della temperatura ambiente (passaggio 2.9), la colonna può essere incubata vicino a un radiatore per selezionare i batteri termofili (amanti del calore) o in un frigorifero con una fonte di luce da selezionare per i batteri psicrofili (amanti del freddo).
  4. La quantità di luce che una colonna riceve durante l’incubazione (passaggio 2.9) può anche essere variata posizionando diverse colonne in condizioni di luce alta, scarsa illuminazione o oscurità.
  5. La lunghezza d’onda della luce in arrivo può essere limitata coprendo la colonna con cellophanes diversamente ombreggiati mentre incuba (passaggio 2.9) per determinare quali colori selezionano per diversi gruppi batterici.

4. Analisi dei dati

  1. Dopo 1-3 settimane, dovrebbe essere visibile una colorazione verde sulla parte superiore dello strato di fango della classica colonna Winogradsky (Fig. 2A). Questi sono i primi segni di crescita dello strato cianobatterico.
  2. Nel tempo, continuare a monitorare l’aspetto e l’evoluzione dei diversi strati, ognuno indicativo dei diversi tipi batterici. SUGGERIMENTO: Fare riferimento ai concetti e alla tabella 1 per capire quali batteri contribuiscono ai diversi strati.

Figure 2A
Figura 2A: Una foto di una classica colonna Winogradsky che ha incubato a temperatura ambiente per 21 giorni. Si noti il sedimento verde, indicativo di cianobatteri, nella parte superiore della colonna.

  1. Se sono state preparate anche modifiche alla classica colonna Winogradsky, confrontare i risultati di ciascuna colonna.
    1. Osservate i livelli in ciascuna delle colonne Winogradsky modificate. Prendi nota di quanto segue:
      • Le colonne presentano lo stesso numero di livelli?
      • Gli strati sono dello stesso colore e spessore?
      • Gli strati si verificano alle stesse profondità?
      • Quanto tempo ci è voluto per sviluppare ogni colonna?
      • Una colonna si è sviluppata più lentamente delle altre?
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5. Results

  1. In this experiment, water and sediment were collected from a freshwater habitat. Two Winogradsky columns were constructed and allowed to develop: a classical Winogradsky column incubated in the light at room temperature (Fig. 2A) and a Winogradsky column incubated in the dark at room temperature (Fig. 2B).

Figure 2B
Figure 2B: A photo of classical Winogradsky column (left), incubated at room temperature in light for 68 days and a Winogradsky column incubated at room temperature in the dark for 68 days (right).

  1. After allowing the columns to develop for 7-9 weeks, the layers in the classical column can be compared to the column incubated in the dark (Fig. 2B). In the classical Winogradsky column, a green cyanobacterial layer can be observed near the top of the tube. Near the center of the tube, a red-purple layer can be observed, indicative of purple nonsulfur bacteria. Under this layer, a purple-red layer is observed, indicative of purple sulfur bacteria. Directly under this layer, black sediment can be observed in the anaerobic region of the column, indicative of sulfate reducing bacteria.
  2. The column grown in the dark (Fig. 2B) developed differently than the classical Winogradsky column. Like the classical column, the dark column yielded black sediment near the bottom of the column, indicative of sulfate reducing bacteria. The dark column did not yield the green cyanobacterial layer, nor the red, purple, or green layers indicative of purple nonsulfur, purple sulfur, and green sulfur bacteria, respectively. These groups are dependent on light for growth, and therefore unable to grow in the dark.
  3. The precise results of each Winogradsky column will vary widely with their incubation conditions and their source habitats.
    1. Microbial communities originating from freshwater habitats will not be accustomed to high salt concentrations and the addition of salt may slow down or inhibit growth. Conversely, there may be sufficient halophilic bacteria in brackish and saltwater habitats so that the addition of salts makes no difference or even enhances the growth of particular layers when compared to a column without added salts.
    2. Sandy sediments are more porous than muddy sediments. If enough sulfide is produced in such porous sediments, sulfides can diffuse all the way to the top of the column and inhibit growth of aerobic organisms. In this case, the column may only contain layers indicative of anaerobes and may not contain any aerobes, such as the cyanobacteria.
    3. Freshwater generally contains less sulfate than saltwater. Sulfate is important for the growth of sulfate-reducing bacteria. Sulfate reducers create sulfide as a byproduct and are indicated by the development of a black layer in the bottom of the column. If sulfate is not supplemented to freshwater communities, sulfate reducers may not produce enough sulfide. The creation of the sulfide byproduct is important for the growth of green and purple sulfur bacteria and the nonphotosynthetic sulfur oxidizers. In these cases, sulfur oxidizers can still grow using the egg yolk as a source of sulfur, even if the sulfate reducers (black layer) never develop.
    4. Different wavelengths of light should select for organisms with different absorption pigments. A column kept in the dark will only allow for nonphotosynthetic organisms to grow, including sulfate reducers, iron oxidizers, and methanogens. Photosynthesizers have pigments that absorb light at different wavelengths within the visible range (~400-700nm). By covering a column with, for example, blue cellophane, blue light (~450-490nm) is blocked from entering the column. All of the photosynthesizers in the column have pigments which require the blue wavelengths (6) and their growth should be inhibited. On the other hand, red cellophane will block light of ~635-700nm. These wavelengths are important for the pigments used by cyanobacteria (6), while purple sulfur, green sulfur, and purple nonsulfur bacteria may still be able to grow.
    5. Different microbial communities may have vastly different adaptive abilities to cope with changes in temperatures. High temperatures can enhance rates of microbial activity when sufficient thermophiles are present. On the other hand, in the absence of thermophiles, high temperatures may decrease overall microbial activity. Similarly, low temperatures may decrease overall microbial activity unless the microbial community contains sufficient psychrophiles.
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La maggior parte dei microrganismi della Terra non può essere coltivata in laboratorio, spesso perché si basano su altri microbi all’interno delle loro comunità native. Una colonna Winogradsky, che prende il nome dal suo inventore Sergei Winogradsky, è un ecosistema in miniatura e chiuso che arricchisce le comunità microbiche all’interno di un campione di sedimenti, consentendo agli scienziati di studiare molti dei microbi che svolgono un ruolo vitale nei processi biogeochimici della Terra, senza bisogno di isolarli e coltivarli individualmente.

In genere, il fango e l’acqua di un ecosistema, come uno stagno o una palude, sono mescolati. Come esperimento facoltativo, il sale può essere aggiunto a questa miscela per arricchire varie specie alofile. Successivamente, una piccola parte della miscela viene integrata con carbonio, di solito sotto forma di cellulosa da giornale, e zolfo, di solito da un tuorlo d’uovo. Per un altro esperimento opzionale, un chiodo può essere aggiunto a questa miscela per arricchire alcune specie di Gallionella. Questa nuova miscela viene quindi aggiunta a una colonna trasparente, in modo che la colonna sia piena di un quarto. Infine, il resto della miscela di fango e più acqua viene aggiunto alla colonna fino a quando non è per la maggior parte del percorso pieno.

La successione, che si riferisce allo sviluppo consecutivo di diverse comunità microbiche nel tempo, può essere osservata in tempo reale con una colonna di Winogradsky. Man mano che i microbi crescono all’interno della colonna, consumano substrati specifici e cambiano la chimica del loro ambiente. Quando i loro substrati sono esauriti, i microbi originali muoiono e i microbi con diverse esigenze metaboliche possono prosperare nell’ambiente alterato. Nel corso del tempo, iniziano a formarsi strati visibilmente distinti, ognuno contenente parti di una comunità batterica con diverse esigenze microambiente.

Ad esempio, i microbi fotosintetici, in gran parte composti da cianobatteri, formano strati verdi o rosso-marroni vicino alla parte superiore della colonna. Poiché la fotosintesi produce ossigeno, spesso visto come bolle nella parte superiore della colonna, si forma un gradiente con le più alte concentrazioni di ossigeno vicino alla parte superiore e la più bassa verso la parte inferiore. A seconda dei substrati disponibili, diverse comunità microbiche possono crescere nello strato inferiore anaerobico. Le bolle in questo strato possono indicare la presenza di metanogeni, che creano gas metano attraverso la fermentazione. Qui, la fermentazione microbica della cellulosa si traduce in acidi organici. I riduttori di solfato ossidano quegli acidi per produrre solfuro e la loro attività è indicata dal sedimento nero. Il solfuro si diffonde verso l’alto nella colonna, creando un altro gradiente in cui le concentrazioni di solfuro sono più alte verso la parte inferiore della colonna e più basse vicino alla parte superiore. Verso il centro della colonna, gli ossidanti dello zolfo utilizzano l’ossigeno dall’alto e il solfuro dal basso. Con una luce adeguata, si sviluppano ossidanti di zolfo fotosintetici, come i batteri dello zolfo verde e viola. I batteri dello zolfo verde tollerano concentrazioni di solfuro più elevate. Pertanto, crescono direttamente sotto i batteri dello zolfo viola. Direttamente sopra questo strato, i batteri viola non sulfurei formano uno strato rosso-arancio. Gli ossidanti di zolfo non fotosintetici sono indicati dalla presenza di filamenti bianchi.

Condizioni come la luce e la temperatura possono anche essere variate per arricchire altre comunità. In questo video, imparerai come costruire una colonna Winogradsky e variare le condizioni di crescita e i substrati per arricchire specifiche comunità microbiche.

In primo luogo, individuare un ecosistema acquatico appropriato, come uno stagno o una palude. I campioni di sedimenti dovrebbero provenire dall’area vicino al bordo dell’acqua ed essere completamente saturi di acqua. Quindi, utilizzare una pala e un secchio per raccogliere da uno a due litri di fango saturo. Quindi, ottenere circa tre litri di acqua dolce dalla stessa fonte e tornare in laboratorio con i campioni sul campo.

In laboratorio, indossare i dispositivi di protezione individuale appropriati, tra cui un cappotto da laboratorio e guanti. Ora, trasferisci circa 750 millilitri di fango in una ciotola di miscelazione. Quindi, setacciare il fango per rimuovere grandi rocce, ramoscelli o foglie e utilizzare un cucchiaio per rompere eventuali ciuffi. Quindi, aggiungere un po ‘di acqua fresca nella ciotola di miscelazione e mescolare con un cucchiaio grande. Aggiungere acqua fino a quando la consistenza della miscela acqua-fango è simile a un frappè. Continua ad assicurarti che non ci siano grumi.

Come esperimento opzionale, selezionare i batteri alofili aggiungendo da 25 a 50 milligrammi di sale alla miscela di fango.

Quindi, trasferire circa 1/3 della miscela acqua-fango in una seconda ciotola di miscelazione. Aggiungere un tuorlo d’uovo e una manciata di giornale triturato alla ciotola. Quindi, aggiungere questa miscela alla colonna, fino a quando non è circa 1/4 pieno. Quindi, aggiungere la miscela acqua-fango senza l’uovo e il giornale alla colonna, fino a quando non è circa 3/4 piena. Quindi, aggiungi più acqua alla colonna, lasciando uno spazio di 1/2 pollice in cima. Coprire la colonna con un involucro di plastica e fissarla con un elastico.

Incubare la colonna nella luce vicino a una finestra a temperatura ambiente per le prossime quattro-otto settimane. Durante il periodo di incubazione, monitorare i cambiamenti nella colonna Winogradsky almeno una volta alla settimana per lo sviluppo di diversi strati colorati e la formazione di bolle. Inoltre, registra il tempo necessario per lo sviluppo di diversi livelli.

Un’altra modifica che può essere fatta è incubare la colonna vicino a un radiatore per selezionare i batteri termofili, o in un frigorifero per selezionare i batteri psicrofili. Variare le condizioni di luce posizionando diverse colonne in condizioni di luce alta, scarsa illuminazione o oscurità per incubare. In alternativa, limitare la lunghezza d’onda della luce in entrata coprendo la colonna con diverse tonalità di cellophane per determinare quali colori selezionare per diversi gruppi batterici. Per un altro esperimento opzionale, per arricchire i batteri ossidanti il ferro, aggiungere un chiodo alla miscela fango-acqua prima dell’aggiunta di giornale e un tuorlo d’uovo.

Dopo una o due settimane, la crescita dello strato cianobatterico è indicata da un film verde o rosso-marrone sopra lo strato di fango della classica colonna Winogradsky. Nel corso del tempo viene monitorata l’aspetto e l’evoluzione dei diversi strati, ognuno indicativo dei diversi tipi di batteri presenti. Quando si confronta una colonna cresciuta al buio con una colonna Winogradsky tradizionale, vediamo che il trattamento scuro produce lo strato nero nella parte inferiore della colonna, indicativo di batteri che riducono il solfato.

La colonna scura può anche produrre altri strati, a seconda di altre condizioni di incubazione. Inoltre, la colonna scura non produce lo strato cianobatterico verde, né gli strati rossi, viola o verdi indicativi rispettivamente di batteri viola non solforo, zolfo viola e zolfo verde. Questi gruppi dipendono dalla luce per la crescita.

Risultati

In questo esperimento, acqua e sedimenti sono stati raccolti da un habitat di acqua dolce. Due colonne Winogradsky sono state costruite e lasciate sviluppare: una classica colonna Winogradsky incubata nella luce a temperatura ambiente (Fig. 2A) e una colonna Winogradsky incubata al buio a temperatura ambiente (Fig. 2B).

Figure 2B
Figura 2B: Una foto della classica colonna Winogradsky (a sinistra), incubata a temperatura ambiente alla luce per 68 giorni e una colonna Winogradsky incubata a temperatura ambiente al buio per 68 giorni (a destra).

Dopo aver permesso alle colonne di svilupparsi per 7-9 settimane, gli strati nella colonna classica possono essere confrontati con la colonna incubata al buio (Fig. 2B). Nella classica colonna Winogradsky, uno strato cianobatterico verde può essere osservato vicino alla parte superiore del tubo. Vicino al centro del tubo, si può osservare uno strato rosso-viola, indicativo di batteri viola nonulfur. Sotto questo strato, si osserva uno strato rosso porpora, indicativo di batteri di zolfo viola. Direttamente sotto questo strato, il sedimento nero può essere osservato nella regione anaerobica della colonna, indicativo di batteri che riducono il solfato.

La colonna cresciuta al buio (Fig. 2B) si sviluppò in modo diverso rispetto alla classica colonna Winogradsky. Come la colonna classica, la colonna scura produceva sedimenti neri vicino al fondo della colonna, indicativi di batteri che riducono il solfato. La colonna scura non ha prodotto lo strato cianobatterico verde, né gli strati rossi, viola o verdi indicativi di batteri viola non solforo, zolfo viola e zolfo verde, rispettivamente. Questi gruppi dipendono dalla luce per la crescita e quindi non sono in grado di crescere al buio.

I risultati precisi di ogni colonna di Winogradsky varieranno ampiamente con le loro condizioni di incubazione e i loro habitat di origine.

Le comunità microbiche provenienti da habitat d’acqua dolce non saranno abituate ad alte concentrazioni di sale e l’aggiunta di sale può rallentare o inibire la crescita. Al contrario, ci possono essere sufficienti batteri alofili negli habitat salmastri e di acqua salata in modo che l’aggiunta di sali non faccia alcuna differenza o addirittura migliori la crescita di particolari strati rispetto a una colonna senza sali aggiunti.

I sedimenti sabbiosi sono più porosi dei sedimenti fangosi. Se in tali sedimenti porosi viene prodotto abbastanza solfuro, i solfuri possono diffondersi fino alla cima della colonna e inibire la crescita degli organismi aerobici. In questo caso, la colonna può contenere solo strati indicativi di anaerobi e non può contenere aerobi, come i cianobatteri.

L’acqua dolce contiene generalmente meno solfato dell’acqua salata. Il solfato è importante per la crescita dei batteri che riducono il solfato. I riduttori di solfato creano solfuro come sottoprodotto e sono indicati dallo sviluppo di uno strato nero nella parte inferiore della colonna. Se il solfato non viene integrato alle comunità di acqua dolce, i riduttori di solfato potrebbero non produrre abbastanza solfuro. La creazione del sottoprodotto del solfuro è importante per la crescita dei batteri dello zolfo verde e viola e degli ossidanti dello zolfo non fotosintetici. In questi casi, gli ossidanti dello zolfo possono ancora crescere usando il tuorlo d’uovo come fonte di zolfo, anche se i riduttori di solfato (strato nero) non si sviluppano mai.

Diverse lunghezze d’onda della luce dovrebbero selezionare per organismi con diversi pigmenti di assorbimento. Una colonna tenuta al buio consentirà solo agli organismi non fotosintetici di crescere, compresi i riduttori di solfato, gli ossidanti del ferro e i metanogeni. I fotosintetizzatori hanno pigmenti che assorbono la luce a diverse lunghezze d’onda all’interno dell’intervallo visibile (~ 400-700nm). Coprendo una colonna con, ad esempio, cellophane blu, la luce blu (~ 450-490nm) viene bloccata dall’entrare nella colonna. Tutti i fotosintetizzatori nella colonna hanno pigmenti che richiedono le lunghezze d’onda blu (6) e la loro crescita dovrebbe essere inibita. D’altra parte, il cellophane rosso bloccherà la luce di ~ 635-700nm. Queste lunghezze d’onda sono importanti per i pigmenti utilizzati dai cianobatteri (6), mentre lo zolfo viola, lo zolfo verde e i batteri viola non solforati possono ancora essere in grado di crescere.

Diverse comunità microbiche possono avere capacità adattive molto diverse per far fronte ai cambiamenti di temperatura. Le alte temperature possono aumentare i tassi di attività microbica quando sono presenti sufficienti termofili. D’altra parte, in assenza di termofili, le alte temperature possono ridurre l’attività microbica complessiva. Allo stesso modo, le basse temperature possono ridurre l’attività microbica complessiva a meno che la comunità microbica non contenga abbastanza psicrofili.

Applications and Summary

La colonna Winogradsky è un esempio di ecosistema microbico interdipendente. Dopo aver mescolato fango, acqua e substrati aggiuntivi di carbonio e zolfo in una colonna verticale, l’ecosistema stratificato dovrebbe stabilizzarsi in zone separate e stabili per diverse settimane. Queste zone sono occupate da diversi microrganismi che prosperano in un punto particolare lungo il gradiente tra il sedimento ricco di solfuro nella parte inferiore e il sedimento ricco di ossigeno nella parte superiore. Manipolando le condizioni e i substrati all’interno della colonna Winogradsky, si può osservare la presenza e l’attività di diversi microrganismi come alofili, termofili, psicrofili, ossidanti dello zolfo, riduttori di zolfo, ossidanti del ferro e fotosintetizzatori.

Riferimenti

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  3. Lloyd KG, Steen AD, Ladau J, Yin J, and Crosby L. (2018). Phylogenetically novel uncultured microbial cells dominate Earth microbiomes. mSystems 3(5): e00055-18. doi:10.1128/mSystems.00055-18
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  6. Stomp M, Huisman J, Stal LJ, and Matthijs HCP. (2007) Colorful niches of phototrophic microorganisms shaped by vibrations of the water molecule. ISME Journal. 1(4): 271-282. doi:10.1038/ismej.2007.59
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Trascrizione

Most of the Earth’s microorganisms cannot be cultured in a lab, often because they rely on other microbes within their native communities. A Winogradsky column, named for its inventor Sergei Winogradsky, is a miniature, enclosed ecosystem which enriches the microbial communities within a sediment sample, enabling scientists to study many of the microbes that play a vital role in Earth’s biogeochemical processes, without needing to isolate and culture them individually.

Typically, mud and water from an ecosystem, such as a pond or a marsh, are mixed. As an optional experiment, salt can be added to this mixture to enrich various halophile species. Next, a small portion of the mixture is supplemented with carbon, usually in the form of cellulose from newspaper, and sulfur, usually from an egg yolk. For another optional experiment, a nail can be added to this mixture to enrich certain Gallionella species. This new mixture is then added to a transparent column, so that the column is one quarter full. Finally, the rest of the mud mixture and more water is added to the column until it is most of the way full.

Succession, which refers to the consecutive development of different microbial communities over time, can be observed in real time with a Winogradsky column. As microbes grow within the column, they consume specific substrates and change the chemistry of their environment. When their substrates are depleted, the original microbes die off and microbes with different metabolic needs can flourish in the altered environment. Over time, visibly distinct layers begin to form, each containing parts of a bacterial community with different microenvironmental needs.

For example, photosynthetic microbes, largely composed of cyanobacteria, form green or red-brown layers near the top of the column. Since photosynthesis produces oxygen, often seen as bubbles in the top portion of the column, a gradient is formed with the highest oxygen concentrations near the top, and the lowest towards the bottom. Depending upon the available substrates, different microbial communities can grow in the anaerobic bottom layer. Bubbles in this layer can indicate the presence of methanogens, which create methane gas via fermentation. Here, the microbial fermentation of cellulose results in organic acids. Sulfate reducers oxidize those acids to produce sulfide, and their activity is indicated by black sediment. Sulfide diffuses upward in the column, creating yet another gradient where sulfide concentrations are highest towards the bottom of the column, and lowest near the top. Towards the middle of the column, sulfur oxidizers utilize the oxygen from above and sulfide from below. With adequate light, photosynthetic sulfur oxidizers, such as green and purple sulfur bacteria, develop. Green sulfur bacteria tolerate higher sulfide concentrations. Thus, they grow directly below the purple sulfur bacteria. Directly above this layer, purple non-sulfur bacteria form a red-orange layer. Nonphotosynthetic sulfur oxidizers are indicated by the presence of white filaments.

Conditions such as light and temperature can also be varied to enrich other communities. In this video, you will learn how to construct a Winogradsky column, and vary the growing conditions and substrates to enrich specific microbial communities.

First, locate an appropriate aquatic ecosystem, such as a pond or marsh. The sediment samples should come from the area near the water’s edge, and be completely saturated with water. Then, use a shovel and a bucket to collect one to two liters of the saturated mud. Next, obtain approximately three liters of fresh water from the same source and return to the lab with the field samples.

In the lab, put on the appropriate personal protective equipment, including a lab coat and gloves. Now, transfer approximately 750 milliliters of mud to a mixing bowl. Then, sift through the mud to remove large rocks, twigs, or leaves and use a spoon to break apart any clumps. Next, add some of the fresh water to the mixing bowl, and stir with a large spoon. Add water until the consistency of the water-mud mixture is similar to a milkshake. Continue to make sure there are no clumps.

As an optional experiment, select for halophilic bacteria by adding 25 to 50 milligrams of salt to the mud mixture.

Then, transfer approximately 1/3 of the water-mud mixture to a second mixing bowl. Add one egg yolk and a handful of shredded newspaper to the bowl. Next, add this mixture to the column, until it is about 1/4 full. Next, add the water-mud mixture without the egg and newspaper to the column, until it is approximately 3/4 full. Then, add more water to the column, leaving a 1/2 inch space on top. Cover the column with plastic wrap and secure it with a rubber band.

Incubate the column in the light near a window at room temperature for the next four to eight weeks. Throughout the incubation period, monitor changes in the Winogradsky column at least once a week for the development of different colored layers and the formation of bubbles. Additionally, record the time it takes for different layers to develop.

Another modification that can be done is incubating the column near a radiator to select for thermophilic bacteria, or in a refrigerator to select for psychrophilic bacteria. Vary the light conditions by placing different columns in high light, low light, or darkness to incubate. Alternatively, limit the wavelength of incoming light by covering the column with different shades of cellophane to determine which colors select for different bacterial groups. For another optional experiment, to enrich iron-oxidizing bacteria, add a nail to the mud-water mixture prior to the addition of newspaper and an egg yolk.

After one to two weeks, growth of the cyanobacterial layer is indicated by a green or red-brown film on top of the mud layer of the classical Winogradsky column. Over time, the appearance and evolution of the different layers is monitored, each indicative of the different types of bacteria present. When comparing a column grown in the dark to a traditional Winogradsky column, we see the dark treatment yields the black layer at the bottom of the column, indicative of sulfate-reducing bacteria.

The dark column may also yield other layers, depending on other incubation conditions. Additionally, the dark column doesn’t yield the green cyanobacterial layer, nor the red, purple, or green layers indicative of purple non-sulfur, purple sulfur, and green sulfur bacteria respectively. These groups are dependent on light for growth.

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