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Fonte: Elizabeth Suter1, Christopher Corbo1, Jonathan Blaize1
1 Dipartimento di Scienze Biologiche, Wagner College, 1 Campus Road, Staten Island NY, 10301
La colonna Winogradsky è un ecosistema in miniatura e chiuso utilizzato per arricchire le comunità microbiche dei sedimenti, in particolare quelle coinvolte nel ciclo dello zolfo. La colonna fu utilizzata per la prima volta da Sergei Winogradsky nel 1880 e da allora è stata applicata nello studio di molti microrganismi diversi coinvolti nella biogeochimica, come fotosintetizzatori, ossidanti dello zolfo, riduttori di solfato, metanogeni, ossidanti del ferro, ciclori di azoto e altro (1,2).
La maggior parte dei microrganismi sulla Terra sono considerati incoltibili, il che significa che non possono essere isolati in una provetta o su una capsula di Petri (3). Ciò è dovuto a molti fattori, tra cui il fatto che i microrganismi dipendono da altri per determinati prodotti metabolici. Le condizioni in una colonna di Winogradsky imitano da vicino l'habitat naturale di un microrganismo, comprese le loro interazioni con altri organismi, e consentono di farli crescere in laboratorio. Pertanto, questa tecnica consente agli scienziati di studiare questi organismi e capire quanto siano importanti per i cicli biogeochimici della Terra senza doverli coltivare in isolamento.
Gli ambienti della Terra sono pieni di microrganismi che prosperano in tutti i tipi di habitat,come suoli, acqua oceanica, nuvole e sedimenti di acque profonde. In tutti gli habitat, i microrganismi dipendono l'uno dall'altro. Man mano che un microrganismo cresce, consuma particolari substrati,inclusi combustibili ricchi di carbonio come zuccheri e sostanze nutritive, vitamine e gas respiratori come l'ossigeno. Quando queste importanti risorse si esauriscono, diversi microrganismi con diverse esigenze metaboliche possono quindi fiorire e prosperare. Ad esempio, nella colonna Winogradsky, i microbi consumano prima il materiale organico aggiunto mentre esauriscono l'ossigeno negli strati inferiori della colonna. Una volta esaurito l'ossigeno, gli organismi anaerobici possono quindi prendere il sopravvento e consumare diversi materiali organici. Questo sviluppo consecutivo di diverse comunità microbiche nel tempo è chiamato successione (4). La successione microbica è importante in una colonna di Winogradsky, dove l'attività microbica cambia la chimica del sedimento, che quindi influenza l'attività di altri microbi e così via. Molti microrganismi nei suoli e nei sedimenti vivono anche lungo gradienti, che sono zone di transizione tra due diversi tipi di habitat in base alle concentrazioni di substrati (5). Nel punto corretto del gradiente, un microbo può ricevere quantità ottimali di diversi substrati. Man mano che una colonna winogradsky si sviluppa, inizia a imitare questi gradienti naturali, in particolare nell'ossigeno e nel solfuro (Fig. 1).
Figura 1: Rappresentazione dei gradienti di ossigeno (O2) e solfuro (H2S) che si sviluppano in una colonna di Winogradsky.
In una colonna Winogradsky, il fango e l'acqua di uno stagno o di una zona umida sono mescolati in una colonna trasparente e lasciati incubare, in genere alla luce. Ulteriori substrati vengono aggiunti alla colonna per fornire alla comunità fonti di carbonio, di solito sotto forma di cellulosa e zolfo. I fotosintetizzatori in genere iniziano a crescere negli strati superiori del sedimento. Questi microrganismi fotosintetici sono in gran parte composti da cianobatteri, che producono ossigeno e appaiono come uno strato verde o rosso-marrone (Fig. 2, Tabella 1). Mentre la fotosintesi produce ossigeno, l'ossigeno non è molto solubile in acqua e diminuisce al di sotto di questo strato (Fig. 1). Questo crea un gradiente di ossigeno, che va da alte concentrazioni di ossigeno negli strati superiori a zero ossigeno negli strati inferiori. Lo strato ossigenato è chiamato strato aerobico e lo strato senza ossigeno è chiamato strato anaerobico.
Nello strato anaerobico, molte diverse comunità microbiche possono proliferare a seconda del tipo e della quantità di substrati disponibili, della fonte dei microbi iniziali e della porosità del sedimento. Nella parte inferiore della colonna, gli organismi che anaerobamente abbattono la materia organica possono prosperare. La fermentazione microbica produce acidi organici dalla scomposizione della cellulosa. Questi acidi organici possono quindi essere utilizzati dai riduttori di solfato, che ossidano quelle sostanze organiche usando il solfato e producono solfuro come sottoprodotto. L'attività dei riduttori di solfato è indicata se il sedimento diventa nero, perché ferro e solfuro reagiscono per formare minerali di solfuro di ferro nero (Fig. 2, Tabella 1). Il solfuro si diffonde anche verso l'alto, creando un altro gradiente in cui le concentrazioni di solfuro sono alte nella parte inferiore della colonna e basse nella parte superiore della colonna (Fig. 1).
Vicino al centro della colonna, gli ossidanti di zolfo sfruttano l'apporto di ossigeno dall'alto e solfuro dal basso. Con la giusta quantità di luce, gli ossidanti fotosintetici dello zolfo possono svilupparsi in questi strati. Questi organismi sono noti come batteri dello zolfo verde e viola e spesso appaiono come filamenti e macchie verdi, viola o rosso porpora (Fig. 2, Tabella 1). I batteri dello zolfo verde hanno una maggiore tolleranza per il solfuro e di solito si sviluppano nello strato direttamente sotto i batteri dello zolfo viola. Sopra i batteri dello zolfo viola, possono anche svilupparsi batteri viola non solforo. Questi organismi fotosintetizzano usando acidi organici come donatori di elettroni invece di solfuro e spesso appaiono come uno strato rosso, viola, arancione o marrone. Gli ossidanti di zolfo non fotosintetici possono svilupparsi sopra i batteri viola non solforati, e questi di solito appaiono come filamenti bianchi (Fig. 2, Tabella 1). Inoltre, le bolle possono anche formarsi nella colonna Winogradsky. Le bolle negli strati aerobici indicano la produzione di ossigeno da parte dei cianobatteri. Le bolle negli strati anaerobici sono probabilmente dovute all'attività dei metanogeni,organismi che anaerobicamente abbattono la materia organica e formano il metano come sottoprodotto.
| Posizione nella colonna | Gruppo funzionale | Esempi di organismi | Indicatore visivo |
| In alto | Fotosintetizzatori | Cianobatteri | Strato verde o bruno-rossastro. A volte bolle di ossigeno. |
| Ossidanti dello zolfo non fotosintetici | Beggiatoa, Thiobacilus | Strato bianco. | |
| Batteri viola nonsolforo | Rhodomicrobium, Rhodospirilum, Rhodopseuodmonas | Strato rosso, viola, arancione o marrone. | |
| Batteri dello zolfo viola | Cromatio | Strato viola o rosso porpora. | |
| Batteri dello zolfo verde | Clorobio | Strato verde. | |
| Batteri che riducono il solfato | Desulfovibrio, Desulfotomaculum, Desulfobacter, Desulfuromonas | Strato nero. | |
| Fondoschiena | Metanogeni | Metanococco, Metanosarcina | A volte bolle di metano. |
Tabella 1: I principali gruppi di batteri che possono apparire in una classica colonna Winogradsky, dall'alto verso il basso. Vengono forniti esempi di organismi di ciascun gruppo e vengono elencati gli indicatori visivi di ciascuno strato di organismi. Basato su Perry et al. (2002) e Rogan et al. (2005).
1. Configurazione
2. Assemblaggio di una colonna Winogradsky
3. Modifiche opzionali alla colonna Winogradsky classica
4. Analisi dei dati
Figura 2A: Una foto di una classica colonna Winogradsky che ha incubato a temperatura ambiente per 21 giorni. Si noti il sedimento verde, indicativo di cianobatteri, nella parte superiore della colonna.
La maggior parte dei microrganismi della Terra non può essere coltivata in laboratorio, spesso perché si basano su altri microbi all'interno delle loro comunità native. Una colonna Winogradsky, che prende il nome dal suo inventore Sergei Winogradsky, è un ecosistema in miniatura e chiuso che arricchisce le comunità microbiche all'interno di un campione di sedimenti, consentendo agli scienziati di studiare molti dei microbi che svolgono un ruolo vitale nei processi biogeochimici della Terra, senza bisogno di isolarli e coltivarli individualmente.
In genere, il fango e l'acqua di un ecosistema, come uno stagno o una palude, sono mescolati. Come esperimento facoltativo, il sale può essere aggiunto a questa miscela per arricchire varie specie alofile. Successivamente, una piccola parte della miscela viene integrata con carbonio, di solito sotto forma di cellulosa da giornale, e zolfo, di solito da un tuorlo d'uovo. Per un altro esperimento opzionale, un chiodo può essere aggiunto a questa miscela per arricchire alcune specie di Gallionella. Questa nuova miscela viene quindi aggiunta a una colonna trasparente, in modo che la colonna sia piena di un quarto. Infine, il resto della miscela di fango e più acqua viene aggiunto alla colonna fino a quando non è per la maggior parte del percorso pieno.
La successione, che si riferisce allo sviluppo consecutivo di diverse comunità microbiche nel tempo, può essere osservata in tempo reale con una colonna di Winogradsky. Man mano che i microbi crescono all'interno della colonna, consumano substrati specifici e cambiano la chimica del loro ambiente. Quando i loro substrati sono esauriti, i microbi originali muoiono e i microbi con diverse esigenze metaboliche possono prosperare nell'ambiente alterato. Nel corso del tempo, iniziano a formarsi strati visibilmente distinti, ognuno contenente parti di una comunità batterica con diverse esigenze microambiente.
Ad esempio, i microbi fotosintetici, in gran parte composti da cianobatteri, formano strati verdi o rosso-marroni vicino alla parte superiore della colonna. Poiché la fotosintesi produce ossigeno, spesso visto come bolle nella parte superiore della colonna, si forma un gradiente con le più alte concentrazioni di ossigeno vicino alla parte superiore e la più bassa verso la parte inferiore. A seconda dei substrati disponibili, diverse comunità microbiche possono crescere nello strato inferiore anaerobico. Le bolle in questo strato possono indicare la presenza di metanogeni, che creano gas metano attraverso la fermentazione. Qui, la fermentazione microbica della cellulosa si traduce in acidi organici. I riduttori di solfato ossidano quegli acidi per produrre solfuro e la loro attività è indicata dal sedimento nero. Il solfuro si diffonde verso l'alto nella colonna, creando un altro gradiente in cui le concentrazioni di solfuro sono più alte verso la parte inferiore della colonna e più basse vicino alla parte superiore. Verso il centro della colonna, gli ossidanti dello zolfo utilizzano l'ossigeno dall'alto e il solfuro dal basso. Con una luce adeguata, si sviluppano ossidanti di zolfo fotosintetici, come i batteri dello zolfo verde e viola. I batteri dello zolfo verde tollerano concentrazioni di solfuro più elevate. Pertanto, crescono direttamente sotto i batteri dello zolfo viola. Direttamente sopra questo strato, i batteri viola non sulfurei formano uno strato rosso-arancio. Gli ossidanti di zolfo non fotosintetici sono indicati dalla presenza di filamenti bianchi.
Condizioni come la luce e la temperatura possono anche essere variate per arricchire altre comunità. In questo video, imparerai come costruire una colonna Winogradsky e variare le condizioni di crescita e i substrati per arricchire specifiche comunità microbiche.
In primo luogo, individuare un ecosistema acquatico appropriato, come uno stagno o una palude. I campioni di sedimenti dovrebbero provenire dall'area vicino al bordo dell'acqua ed essere completamente saturi di acqua. Quindi, utilizzare una pala e un secchio per raccogliere da uno a due litri di fango saturo. Quindi, ottenere circa tre litri di acqua dolce dalla stessa fonte e tornare in laboratorio con i campioni sul campo.
In laboratorio, indossare i dispositivi di protezione individuale appropriati, tra cui un cappotto da laboratorio e guanti. Ora, trasferisci circa 750 millilitri di fango in una ciotola di miscelazione. Quindi, setacciare il fango per rimuovere grandi rocce, ramoscelli o foglie e utilizzare un cucchiaio per rompere eventuali ciuffi. Quindi, aggiungere un po 'di acqua fresca nella ciotola di miscelazione e mescolare con un cucchiaio grande. Aggiungere acqua fino a quando la consistenza della miscela acqua-fango è simile a un frappè. Continua ad assicurarti che non ci siano grumi.
Come esperimento opzionale, selezionare i batteri alofili aggiungendo da 25 a 50 milligrammi di sale alla miscela di fango.
Quindi, trasferire circa 1/3 della miscela acqua-fango in una seconda ciotola di miscelazione. Aggiungere un tuorlo d'uovo e una manciata di giornale triturato alla ciotola. Quindi, aggiungere questa miscela alla colonna, fino a quando non è circa 1/4 pieno. Quindi, aggiungere la miscela acqua-fango senza l'uovo e il giornale alla colonna, fino a quando non è circa 3/4 piena. Quindi, aggiungi più acqua alla colonna, lasciando uno spazio di 1/2 pollice in cima. Coprire la colonna con un involucro di plastica e fissarla con un elastico.
Incubare la colonna nella luce vicino a una finestra a temperatura ambiente per le prossime quattro-otto settimane. Durante il periodo di incubazione, monitorare i cambiamenti nella colonna Winogradsky almeno una volta alla settimana per lo sviluppo di diversi strati colorati e la formazione di bolle. Inoltre, registra il tempo necessario per lo sviluppo di diversi livelli.
Un'altra modifica che può essere fatta è incubare la colonna vicino a un radiatore per selezionare i batteri termofili, o in un frigorifero per selezionare i batteri psicrofili. Variare le condizioni di luce posizionando diverse colonne in condizioni di luce alta, scarsa illuminazione o oscurità per incubare. In alternativa, limitare la lunghezza d'onda della luce in entrata coprendo la colonna con diverse tonalità di cellophane per determinare quali colori selezionare per diversi gruppi batterici. Per un altro esperimento opzionale, per arricchire i batteri ossidanti il ferro, aggiungere un chiodo alla miscela fango-acqua prima dell'aggiunta di giornale e un tuorlo d'uovo.
Dopo una o due settimane, la crescita dello strato cianobatterico è indicata da un film verde o rosso-marrone sopra lo strato di fango della classica colonna Winogradsky. Nel corso del tempo viene monitorata l'aspetto e l'evoluzione dei diversi strati, ognuno indicativo dei diversi tipi di batteri presenti. Quando si confronta una colonna cresciuta al buio con una colonna Winogradsky tradizionale, vediamo che il trattamento scuro produce lo strato nero nella parte inferiore della colonna, indicativo di batteri che riducono il solfato.
La colonna scura può anche produrre altri strati, a seconda di altre condizioni di incubazione. Inoltre, la colonna scura non produce lo strato cianobatterico verde, né gli strati rossi, viola o verdi indicativi rispettivamente di batteri viola non solforo, zolfo viola e zolfo verde. Questi gruppi dipendono dalla luce per la crescita.
La maggior parte dei microrganismi della Terra non può essere coltivata in laboratorio, spesso perché si affidano ad altri microbi all'interno delle loro comunità native. Una colonna di Winogradsky, che prende il nome dal suo inventore Sergei Winogradsky, è un ecosistema chiuso in miniatura che arricchisce le comunità microbiche all'interno di un campione di sedimenti, consentendo agli scienziati di studiare molti dei microbi che svolgono un ruolo vitale nei processi biogeochimici della Terra, senza bisogno di isolarli e coltivarli individualmente.
In genere, il fango e l'acqua di un ecosistema, come uno stagno o una palude, sono mescolati. Come esperimento facoltativo, il sale può essere aggiunto a questa miscela per arricchire varie specie alofile. Successivamente, una piccola parte della miscela viene integrata con carbonio, di solito sotto forma di cellulosa di giornale, e zolfo, di solito da un tuorlo d'uovo. Per un altro esperimento facoltativo, è possibile aggiungere un chiodo a questa miscela per arricchire alcune specie di Gallionella. Questa nuova miscela viene quindi aggiunta a una colonna trasparente, in modo che la colonna sia piena per un quarto. Infine, il resto della miscela di fango e altra acqua viene aggiunto alla colonna fino a quando non è quasi piena.
La successione, che si riferisce allo sviluppo consecutivo di diverse comunità microbiche nel tempo, può essere osservata in tempo reale con una colonna di Winogradsky. Man mano che i microbi crescono all'interno della colonna, consumano substrati specifici e modificano la chimica del loro ambiente. Quando i loro substrati sono esauriti, i microbi originali muoiono e i microbi con diverse esigenze metaboliche possono prosperare nell'ambiente alterato. Nel corso del tempo, iniziano a formarsi strati visibilmente distinti, ognuno contenente parti di una comunità batterica con diverse esigenze microambientali.
Ad esempio, i microbi fotosintetici, in gran parte composti da cianobatteri, formano strati verdi o rosso-marroni vicino alla parte superiore della colonna. Poiché la fotosintesi produce ossigeno, spesso visto come bolle nella parte superiore della colonna, si forma un gradiente con le concentrazioni di ossigeno più alte vicino alla parte superiore e la più bassa verso il basso. A seconda dei substrati disponibili, diverse comunità microbiche possono crescere nello strato inferiore anaerobico. Le bolle in questo strato possono indicare la presenza di metanogeni, che creano gas metano attraverso la fermentazione. Qui, la fermentazione microbica della cellulosa si traduce in acidi organici. I riduttori di solfato ossidano quegli acidi per produrre solfuro e la loro attività è indicata dal sedimento nero. Il solfuro si diffonde verso l'alto nella colonna, creando un altro gradiente in cui le concentrazioni di solfuro sono più alte verso la parte inferiore della colonna e più basse vicino alla parte superiore. Verso il centro della colonna, gli ossidanti di zolfo utilizzano l'ossigeno dall'alto e il solfuro dal basso. Con una luce adeguata, si sviluppano ossidanti fotosintetici dello zolfo, come i batteri dello zolfo verde e viola. I batteri solforati verdi tollerano concentrazioni di solfuro più elevate. Pertanto, crescono direttamente sotto i batteri dello zolfo viola. Direttamente sopra questo strato, i batteri viola non solforati formano uno strato rosso-arancio. Gli ossidanti di zolfo non fotosintetici sono indicati dalla presenza di filamenti bianchi.
Condizioni come la luce e la temperatura possono anche essere variate per arricchire altre comunità. In questo video imparerai come costruire una colonna di Winogradsky e variare le condizioni di crescita e i substrati per arricchire specifiche comunità microbiche.
Innanzitutto, individua un ecosistema acquatico appropriato, come uno stagno o una palude. I campioni di sedimento dovrebbero provenire dall'area vicino al bordo dell'acqua ed essere completamente saturi d'acqua. Quindi, usa una pala e un secchio per raccogliere uno o due litri di fango saturo. Successivamente, prelevare circa tre litri di acqua dolce dalla stessa fonte e riportarli in laboratorio con i campioni sul campo.
In laboratorio, indossare i dispositivi di protezione individuale appropriati, tra cui camice e guanti. A questo punto, trasferite circa 750 millilitri di fango in una ciotola. Quindi, setaccia il fango per rimuovere grandi rocce, ramoscelli o foglie e usa un cucchiaio per rompere eventuali grumi. Quindi, aggiungi un po' di acqua fresca nella ciotola e mescola con un cucchiaio grande. Aggiungere acqua fino a quando la consistenza della miscela di acqua e fango è simile a un frappè. Continua ad assicurarti che non ci siano grumi.
Come esperimento facoltativo, selezionare i batteri alofili aggiungendo da 25 a 50 milligrammi di sale alla miscela di fango.
Quindi, trasferire circa 1/3 della miscela di acqua e fango in una seconda ciotola. Aggiungere un tuorlo d'uovo e una manciata di giornale sminuzzato nella ciotola. Quindi, aggiungi questo composto alla colonna, fino a quando non è pieno per circa 1/4. Successivamente, aggiungere la miscela di acqua e fango senza l'uovo e il giornale alla colonna, fino a riempirla per circa 3/4. Quindi, aggiungi altra acqua alla colonna, lasciando uno spazio di 1/2 pollice sopra. Coprire la colonna con pellicola trasparente e fissarla con un elastico.
Incubare la colonna alla luce vicino a una finestra a temperatura ambiente per le successive quattro-otto settimane. Durante il periodo di incubazione, monitorare i cambiamenti nella colonna di Winogradsky almeno una volta alla settimana per lo sviluppo di strati di colore diverso e la formazione di bolle. Inoltre, registra il tempo necessario per lo sviluppo dei diversi strati.
Un'altra modifica che può essere fatta è incubare la colonna vicino a un radiatore per selezionare i batteri termofili, o in un frigorifero per selezionare i batteri psicrofili. Varia le condizioni di luce posizionando diverse colonne in condizioni di luce alta, scarsa o oscurità per incubare. In alternativa, limitare la lunghezza d'onda della luce in entrata coprendo la colonna con diverse tonalità di cellophane per determinare quali colori selezionano per i diversi gruppi batterici. Per un altro esperimento facoltativo, per arricchire i batteri che ossidano il ferro, aggiungere un chiodo alla miscela di fango e acqua prima dell'aggiunta di giornale e tuorlo d'uovo.
Dopo una o due settimane, la crescita dello strato cianobatterico è indicata da una pellicola verde o rosso-marrone sopra lo strato di fango della classica colonna di Winogradsky. Nel tempo viene monitorato l'aspetto e l'evoluzione dei diversi strati, ognuno indicativo dei diversi tipi di batteri presenti. Quando si confronta una colonna cresciuta al buio con una colonna Winogradsky tradizionale, si vede che il trattamento scuro produce lo strato nero nella parte inferiore della colonna, indicativo di batteri che riducono i solfati.
La colonna scura può anche produrre altri strati, a seconda di altre condizioni di incubazione. Inoltre, la colonna scura non produce lo strato cianobatterico verde, né gli strati rossi, viola o verdi indicativi rispettivamente di batteri viola non zolfo, zolfo viola e zolfo verde. Questi gruppi dipendono dalla luce per la crescita.
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