Creazione di una colonna di Winogradsky: un metodo per arricchire le specie microbiche presenti in un campione di sedimento

1. Configurazione

1. Per impostare una colonna Winogradsky, avrai bisogno di alcune forniture di base:
   • Una pala, un secchio e una bottiglia per raccogliere i campioni sul campo
   • Un recipiente verticale e trasparente, come un cilindro graduato o una bottiglia d'acqua di plastica di circa 1L
   • Involucro di plastica e elastici
   • grandi ciotole di miscelazione e cucchiaio grande per mescolare
   • Una fonte di zolfo (tuorlo d'uovo o solfato di calcio)
   • Una fonte di carbonio organico (cellulosa, sotto forma di giornale triturato)
   • Una fonte di luce (finestra soleggiata o lampada da tavolo)
   • Suolo o fango raccolti da una palude, zona umida, stagno o ruscello
   • Acqua dello stesso habitat
   • FACOLTATIVO Per alcuni degli esperimenti facoltativi descritti in questo protocollo sarà necessario quanto segue:
     • Sale da tavola
     • Cellophane di colore diverso
     • Una fonte di ferro (come un chiodo o lana d'acciaio)
     • Un frigorifero con una fonte di luce
     • Un radiatore vicino a una fonte di luce
2. Se si utilizza una bottiglia d'acqua di plastica, tagliare l'area del collo in modo che la colonna sia di forma cilindrica. Rimuovere eventuali involucri in modo che la luce possa penetrare attraverso la plastica.
3. Le uova crude possono contenere Salmonella e devono essere maneggiate con cura. Dovrebbero essere seguite tecniche adeguate per il lavaggio delle mani. In alternativa, è possibile utilizzare l'uovo sodo. Inoltre, non c'è modo di sapere con certezza se fango o sedimenti sono contaminati da acque reflue o altre sostanze nocive. I guanti devono essere usati quando si mescola il fango e si imposta la colonna.

2. Assemblaggio di una colonna Winogradsky

1. Usando la pala, scavare e raccogliere il fango nel secchio. I sedimenti dovrebbero essere vicino al bordo dell'acqua e completamente saturi di acqua. Avrai bisogno di abbastanza fango per riempire ogni colonna Winogradsky. Raccogliere un po 'd'acqua dalla stessa fonte nella bottiglia del campione (sono necessari circa 3000 ml per colonna).
2. In laboratorio, trasferisci abbastanza fango nella prima ciotola di miscelazione per riempire ~ 75% della colonna di volume da 1 litro. Quindi, setacciare per rimuovere grandi rocce, ramoscelli o foglie mentre si utilizza il cucchiaio per rompere i ciuffi.
3. Aggiungi un po 'dell'acqua che hai raccolto nella ciotola di miscelazione mentre mescoli. Aggiungere fino a quando la consistenza della miscela acqua-fango è come un frappè. Continua ad assicurarti che non ci siano grumi.
4. Trasferire circa 1/3 del frappè di fango d'acqua nella seconda ciotola. Aggiungere il tuorlo d'uovo e una manciata di giornale tritato e mescolare.
5. Aggiungere la miscela di fango, tuorlo d'uovo e giornale alla colonna fino a quando la colonna è piena di circa 1/4.
6. Aggiungere la normale miscela acqua-fango nella colonna fino a quando la colonna è piena di circa 3/4.
7. Aggiungi l'acqua aggiuntiva alla colonna, lasciando solo un piccolo spazio (~ 1/2 pollice) di aria in cima.
8. Coprire la colonna con un involucro di plastica e fissare con un elastico.
9. Incubare la colonna nella luce a temperatura ambiente.
10. Per le prossime 4-8 settimane, monitorare i cambiamenti nella colonna Winogradsky per lo sviluppo di diversi strati colorati e la formazione di bolle, come descritto nella Tabella 1. Inoltre, è necessario registrare il tempo necessario per lo sviluppo di diversi livelli.

3. Modifiche opzionali alla colonna Winogradsky classica

1. Aggiungere 25-50 g di sale per 1L di colonna Winogradsky al fango raccolto prima di aggiungere acqua e mescolare (passaggio 2.3). L'aggiunta di sale seleziona per i batteri alofili (amanti del sale).
2. Substrati alternativi, come il ferro, sotto forma di chiodo o lana d'acciaio, possono essere aggiunti alla colonna insieme al tuorlo d'uovo e al giornale triturato (passaggio 2.4). Questo arricchirà i batteri ossidanti il ferro, come la Gallionella,e apparirà come uno strato color ruggine.
3. Invece della temperatura ambiente (passaggio 2.9), la colonna può essere incubata vicino a un radiatore per selezionare i batteri termofili (amanti del calore) o in un frigorifero con una fonte di luce da selezionare per i batteri psicrofili (amanti del freddo).
4. La quantità di luce che una colonna riceve durante l'incubazione (passaggio 2.9) può anche essere variata posizionando diverse colonne in condizioni di luce alta, scarsa illuminazione o oscurità.
5. La lunghezza d'onda della luce in arrivo può essere limitata coprendo la colonna con cellophanes diversamente ombreggiati mentre incuba (passaggio 2.9) per determinare quali colori selezionano per diversi gruppi batterici.

4. Analisi dei dati

1. Dopo 1-3 settimane, dovrebbe essere visibile una colorazione verde sulla parte superiore dello strato di fango della classica colonna Winogradsky (Fig. 2A). Questi sono i primi segni di crescita dello strato cianobatterico.
2. Nel tempo, continuare a monitorare l'aspetto e l'evoluzione dei diversi strati, ognuno indicativo dei diversi tipi batterici. SUGGERIMENTO: Fare riferimento ai concetti e alla tabella 1 per capire quali batteri contribuiscono ai diversi strati.

Figura 2A: Una foto di una classica colonna Winogradsky che ha incubato a temperatura ambiente per 21 giorni. Si noti il sedimento verde, indicativo di cianobatteri, nella parte superiore della colonna.

3. Se sono state preparate anche modifiche alla classica colonna Winogradsky, confrontare i risultati di ciascuna colonna.
   1. Osservate i livelli in ciascuna delle colonne Winogradsky modificate. Prendi nota di quanto segue:
      • Le colonne presentano lo stesso numero di livelli?
      • Gli strati sono dello stesso colore e spessore?
      • Gli strati si verificano alle stesse profondità?
      • Quanto tempo ci è voluto per sviluppare ogni colonna?
      • Una colonna si è sviluppata più lentamente delle altre?