Diluizioni seriali e piastratura: la conta microbica

1. Configurazione

1. Un diagramma di flusso che elenca tutti i materiali, il protocollo sperimentale graduale e il metodo per scartare le forniture dovrebbe essere scritto in un quaderno di laboratorio e tenuto vicino allo spazio di lavoro sperimentale.
2. Gli spazi di lavoro devono essere sterilizzati con un antisettico appropriato (70% di etanolo) e lo sperimentatore dovrebbe mitigare il rischio di contaminazione indossando indumenti da laboratorio puliti che li proteggano anche dalle anomalie di esposizione. Gli indumenti adatti includono, ma non sono limitati a un cappotto da laboratorio, guanti in lattice o nitrile, google, respiratori e scarpe chiuse. È fondamentale mantenere la tecnica asettica in ogni momento.
3. Preparare 90 ml di soluzione salina al 0,45%. Utilizzando un cilindro graduato pulito, misurare 90 ml di acqua sterile e trasferirlo in un matraccio Erlenmeyer pulito etichettato 0,45% soluzione salina. Pesare .405 g di cloruro di sodio (Sigma-Aldrich NaCl S9888) e aggiungerlo al matraccio etichettato 0,45% salino. Ruota ripetutamente fino a quando nessun soluto rimane visibile.
4. Al termine, lo sperimentatore dovrebbe ri-sterilizzare tutte le superfici e scartare eventuali organismi indesiderati, scorte di diluenti, piastre di Petri o anelli di inoculazione usa e getta secondo le linee guida OSHA. Gli indumenti da laboratorio possono essere rimossi prima di lavarsi le mani.

2. Preparazione dei supporti

1. Selezionare i mezzi appropriati per la coltivazione di un organismo desiderato. Nella maggior parte degli scenari, un brodo consentirebbe una crescita batterica sufficiente. Poiché qui si desiderano organismi di un protocollo Winogradsky, una colonna composta da carbonato di calcio, zolfo, cellulosa e fango è stata assemblata e lasciata indisturbata per 7 giorni. La colonna con nome è separata in sezioni aerobiche, microaerofile e anaerobiche.
2. Scegli un mezzo appropriato per placcare l'organismo di interesse. L'integrazione di mezzi liquidi con agar di grado microbiologico è tipicamente impiegata come agente solidificante. LB medium/agar è sufficiente quando si raccolgono campioni dalle regioni aerobica, microaerofila e anaerobica della colonna prenaminata. Nota: i campioni della regione microaerofila non sono stati raccolti per questa procedura. Tuttavia, questi organismi dovrebbero essere coltivati in barattoli di candele. L'introduzione di una candela in questa camera di coltivazione prima della sigillatura crea un ambiente a basso contenuto di ossigeno adatto alla proliferazione microaerofila.
3. Poiché desideriamo preparare 250 ml, utilizzare fiaschi Erlenmeyer da 500 ml (o più grandi) per evitare l'ebollizione durante l'autoclave. Etichetta uno "Brodo" e l'altro "Agar".
4. Determinare la quantità di supporti necessari per creare ogni soluzione seguendo le raccomandazioni di concentrazione del produttore. LB Agar, usato qui, viene preparato combinando 25g / L con acqua ultrapura. Il nostro volume di 250 mL richiede una soluzione di 6,25 LB Agar/250 mL di acqua. Allo stesso modo, LB Broth viene preparato combinando lo stesso rapporto di LB Broth e acqua. Poiché non è integrato con un agente solidificante, non si indurirà quando raffreddato.
5. Pesare il supporto e mescolarlo con acqua in proporzioni coerenti con le raccomandazioni del produttore. Aggiungere 6,25 g di LB Agar a un pallone etichettato "Agar" e 6,25 g di LB Broth a un pallone etichettato "Brodo". Aggiungere 250 ml di acqua ultrapura a ciascun pallone.
6. Avvolgere un foglio di alluminio su ogni pallone e utilizzare un'autoclave per sterilizzare i mezzi per un minimo di 15 minuti a 121 ° C, 15 psi.
7. Utilizzando un guanto o un cuscinetto resistente al calore, rimuovere i palloni dall'autoclave al termine del ciclo e metterli in un bagno d'acqua a 40-50 ° C.
8. Una volta raggiunta la temperatura appropriata, versare il contenuto del matraccio etichettato "Brodo" in un Erlenmeyer da 250 ml o in un matraccio a fondo tondo. Etichettare il matraccio da 250 ml_{"soluzione 0".}
9. Ottenere piastre di Petri sterili da 10, 100 mm x 15 mm ed etichettarle con la data, il nome, il tipo di mezzo utilizzato e la zona della colonna Winogradsky da cui verranno raccolti gli organismi.
10. Rimuovere il pallone etichettato "Agar" dal bagno d'acqua e iniziare a versare in ciascuna delle 10 piastre di Petri. Non più di 15 ml dovrebbero essere aggiunti a ciascun piatto. Questo può anche essere eseguito con un pipettor e una pipetta sierologica da 25 ml per migliorare la precisione. Utilizzare una punta di pipetta sterile per rimuovere eventuali bolle presenti, quindi coprire con i coperchi della piastra e lasciare solidificare durante la notte.

3. Preparazione del diluente

1. Preparare dieci provette in grado di conservare 20 ml o più in un rack ed etichettarle T1-T10. Ogni numero di tubo è coerente con il fattore di diluizione a cui corrisponde (cioè T4 = 1x10^-4 o 0,0001 o 1/10.000 di concentrazione di stock).
2. Pipettare 9 mL di soluzione salina allo 0,45% in ciascuna delle 10 provette.
3. Gli spazi vuoti salini sono ora pronti per essere sterilizzati in autoclave. Utilizzare un foglio di alluminio per coprire ciascuna delle 10 provette e quindi trasferirle su un rack per provette compatibile con l'autoclave. Sterilizzare per un minimo di 15 minuti a 121°C, 15 psi.
4. Rimuovere gli spazi vuoti utilizzando guanti resistenti al calore e lasciare raffreddare. Coprire e conservare a 4°C fino a quando i tubi non hanno raggiunto la temperatura ambiente o quando sono freddi al tatto.

4. Coltivazione dell'organismo bersaglio

1. Inoculare_{"soluzione 0"}con una singola colonia da una piastra precedentemente striata o 50 μL di un brodo congelato. Lasciare all'organismo bersaglio il tempo di replicarsi posizionando la_{"soluzione 0"}inoculata in un incubatore a 37°C durante la notte con agitazione (se necessario). (Nota: il pallone deve essere coperto per evitare contaminazioni. Se l'organismo bersaglio è aerobico, utilizzare una garza sterile e tappi di cotone per prevenire la contaminazione. Se si valutano le regioni della colonna Winogradsky, è sufficiente rimuovere 1 grammo da ciascuna zona desiderata (aerobica e anaerobica ai fini di questo studio) e risospentare in T1 prima di procedere al passaggio 5.3.

5. Diluizione seriale

1. Ottenere il pallone etichettato "Brodo nutriente" dall'incubatrice e agitare vigorosamente.
2. Pipettare 1 mL di_{"soluzione 0"}nella provetta etichettata T1. Vortice T1. Se si valutano gli espianti di Winogradsky, pesare 1 grammo della zona desiderata e aggiungerlo a T1 prima del vortice. (Nota: qui viene utilizzato 1 mL per semplicità- possono essere utilizzati anche volumi più piccoli o più grandi di diluente).
3. Rimuovere 1 mL dalla provetta T1 e aggiungerlo alla provetta T2. Vortice T2.
4. Rimuovere 1 mL dalla provetta T2 e aggiungerlo alla provetta T3. Vortice T3.
5. Rimuovere 1 mL dalla provetta T3 e aggiungerlo alla provetta T4. Vortice T4.
6. Rimuovere 1 mL dalla provetta T4 e aggiungerlo alla provetta T5. Vortice T5.
7. Rimuovere 1 mL dalla provetta T5 e aggiungerlo alla provetta T6. Vortice T6.
8. Rimuovere 1 mL dalla provetta T6 e aggiungerlo alla provetta T7. Vortice T7.
9. Rimuovere 1 mL dalla provetta T7 e aggiungerlo alla provetta T8. Vortice T8.
10. Rimuovere 1 mL dalla provetta T8 e aggiungerlo alla provetta T9. Vortice T9.
11. Rimuovere 1 mL dalla provetta T9 e aggiungerlo alla provetta T10.

6. Placcatura diffusa

1. Pipetta 100 μL di un campione diluito da T1 direttamente su una capsula di Petri. Questo passaggio può essere, ma non è necessario che sia, ripetuto per ogni tubo.
2. Ottenere un'asta di diffusione sterile e monouso o una fiamma sterilizzare un'asta di diffusione del vetro. In senso orario/antiorario, far scivolare la parte orizzontale dell'asta di diffusione per distribuire equamente il campione all'interno della capsula di Petri.
3. Ripetere l'operazione per ogni zona della colonna Winogradsky da valutare.
4. Incubare le piastre in un incubatore a 37°C per 24 ore. Per gli organismi anaerobici, utilizzare una camera anaerobica.

7. Striature

1. Selezionare una diluizione appropriata dell'organismo bersaglio. Ad esempio,_{la soluzione 4} produrrà una diluizione di 1/10.000 della concentrazione iniziale. Tipicamente, le diluizioni di 1/1.000^th (T3/Solution), 1/1.000.000^th (T6/Solution₆) e 1/1.000.000.000^th (T9/Solution₉) vengono valutate per enumerare i microbi.
2. Utilizzando un anello di inoculazione monouso sterile in plastica o un anello di inoculazione in metallo riutilizzabile che è stato sotto tiro per non meno di 10 secondi, immergersi nella soluzione desiderata dal passaggio 5. I circuiti di inoculazione calibrati devono trasferire 0,01 ml. (Attenzione: non lasciare che il loop fiammato contatti i batteri immediatamente dopo la rimozione dal calore)
3. Sollevare leggermente il coperchio della capsula di Petri su un lato in modo che solo l'anello inoculante possa accedere all'agar. Fai scivolare il loop inoculante attraverso la parte superiore del supporto a zig-zag facendo attenzione a non compromettere l'agar. Abbassare il coperchio della capsula di Petri.
4. Utilizzare un nuovo ciclo di inoculazione monouso o risterizzare il ciclo riutilizzabile.
5. Ruotare la piastra di circa 1/3 (~118°) e ridurre la frequenza del movimento a zig-zag.
6. Ancora una volta, utilizzare un nuovo loop usa e getta o ri-sterilizzare un loop metallico prima di ruotare un tempo finale e ridurre ancora una volta la frequenza a zig-zag. Abbassare il coperchio della capsula di Petri.
7. Ripetere i passaggi 7.2 - 7.6 fino a quando almeno tre piastre di Petri sono state striate per tre diverse diluizioni, utilizzando un nuovo loop usa e getta o riaccheggiando un loop riutilizzabile (Figura 2).
8. Mettere le piastre di Petri striate in un'incubatrice a 37 ° C durante la notte. Per gli organismi anaerobici, utilizzare una camera anerobica.

8. Analisi dei dati e risultati

1. Le colture sono state raccolte dalle zone ossiche e anossiche di una colonna Winogradsky di 7 giorni. Queste zone sono adatte rispettivamente per anaerobi eterotrofici e ferro-ossidanti.
2. Gli espianti a colonna sono stati diluiti in serie prima di striature o diffusione su piastre LB Agar.
3. Streaking ha rivelato una popolazione mista da ciascuna delle zone Winogradsky valutate. Le piastre diffuse hanno prodotto risultati simili.
4. Per calcolare CFU/mL o CFU/g, mediare il numero di colonie contate da tre piastre. Moltiplicare il numero medio di colonie per il fattore di diluizione e dividere per la quantità aliquota. Ad esempio, se una media di 65 colonie fosse contate su piastre inoculate con 0,1 mL di_{soluzione 6} (T6) la formula descritta in precedenza sarebbe pari a 650.000.000 CFU/mL.
5. Le colonie isolate possono ora essere scelte da ciascuna piastra per l'uso in saggi di arricchimento per determinare l'identità delle specie.