6.3: Culture di arricchimento: coltura di microbi aerobici e anaerobici su terreni selettivi e differenziali

1. Preparazione

1. Prima di iniziare, lavarsi accuratamente le mani e indossare guanti di dimensioni adeguate.
2. Sterilizzare la superficie di lavoro con ipoclorito di sodio al 5% (candeggina) e asciugare accuratamente.
3. Posizionare un anello di inoculazione in un pallone Erlenmeyer vuoto da 120 ml in modo che non tocchi il piano di lavoro.

2. Mezzi di crescita e culture

1. Raccogli quattro piatti di Mannitol Salt Agar (MSA), Eosin Methylene blue agar (EMB) e otto agar di soia triptica (TSA) dal frigorifero (questi possono essere acquistati commercialmente).
2. Posizionare le piastre sull'area di lavoro pulita.
3. Raccogliere le seguenti colture di brodo: Escherichia coli, Staphylococcus aureus, Staphylococcus epidermidise Proteus vulgaris. Usare cautela: poiché si tratta di organismi aerobici, i cappucci dei tubi dovrebbero essere leggermente allentati.
4. Posizionare tutte le colture in una griglia per provette sulla superficie di lavoro pulita.

3. Trasferimento di colture e incubazione

1. Stare in piedi o sedersi alla panca con tutti i materiali a portata di mano.
2. Per utilizzare la tecnica asettica per trasferire i batteri alla piastra, prima fiammare il cappio fino a quando non è arancione incandescente - e quindi lasciarlo raffreddare nell'aria.
3. Mentre il cappio si raffredda, prendi la coltura di brodo di E. colie poi apri il cappuccio usando il mignolo.
4. Fiammare rapidamente l'apertura del tubo. Ciò impedisce la contaminazione.
5. Immergere il loop nel tubo e strisciare l'organismo sul primo quadrante di una piastra EMB.
6. Dopo aver eseguito la prima striscia, fiamma il ciclo e quindi esegui una seconda striscia attraversando la prima striscia solo una o due volte. Ciò consentirà l'isolamento di una singola colonia e di determinare se vi è contaminazione.
7. Ripeti questa operazione fino a quando tutti e quattro i quadranti della piastra non sono stati striati.
8. Ora, trasferire ciascuno degli altri quattro organismi nello stesso modo di placcatura a strisce in modo che il prodotto finale sia una piastra MSA, una piastra EMB e due piastre TSA separate per organismo.
9. Una volta che tutti gli organismi sono stati trasferiti, fiamma il loop un'ultima volta e mettilo via.
10. Posizionare 1 piastra TSA con ciascun organismo nella confezione di gas, quindi agitare una bustina di gas prima di metterla nella camera accanto alle piastre. Sigillare saldamente.
11. Incubare tutte le piastre a 37°C durante la notte.
12. Sterilizzare il piano di lavoro un'ultima volta con il 5% di candeggina.

4. Lettura e registrazione dei risultati

1. Rimuovere le piastre dall'incubatore e posizionarle su un banco da laboratorio pulito
2. Prendi nota della crescita degli organismi su ogni piastra nel tuo quaderno di laboratorio. In particolare, prendi appunti dettagliati su:
   1. Numero e dimensione delle colonie (se presenti) su ciascuna piastra, per ogni ceppo placcato
   2. Aspetto dell'agar che circonda qualsiasi colonia che cresce sulle placche MSA
   3. Aspetto di eventuali colonie che crescono sulle piastre EMB
   4. Differenze nella crescita tra le piastre TSA coltivate all'esterno rispetto all'interno del pacchetto di gas

I batteri sono in grado di abitare quasi tutti gli ambienti della Terra, dalla tundra desertica alle foreste pluviali tropicali. Questa capacità di colonizzare nicchie molto diverse è dovuta alla loro adattabilità e alla vasta diversità metabolica, che consente loro di utilizzare un'ampia varietà di molecole per la generazione di energia. È questa enorme varietà di diversità che porta al fenomeno che meno dell'1% delle specie batteriche del pianeta sono considerate coltivabili e queste sono possibili solo grazie alla comprensione delle loro specifiche esigenze metaboliche e ambientali.

L'esecuzione di manipolazioni dei media e dell'ambiente in laboratorio non solo consente ai ricercatori di sperimentare per trovare le condizioni ottimali per la coltura di una specie di interesse, ma consente anche l'arricchimento, il processo di modifica delle condizioni per selezionare specie specifiche da una coltura mista. Alcune specie microbiche sono generaliste e in grado di tollerare un'ampia varietà di stati o ambienti. Tali organismi possono crescere facilmente in condizioni di laboratorio, ma possono anche essere impediti di crescere se viene fornito loro un habitat estremo, che può aiutare se l'obiettivo è quello di arricchirsi per gli organismi di una coltura mista che sono tolleranti a questa condizione.

Gli organismi esigenti possono essere coltivabili, ma solo quando sono soddisfatte condizioni specifiche. Le specie Neisseria o Haemophilus, ad esempio, richiedono terreni contenenti globuli rossi parzialmente scomposti e un'alta concentrazione di anidride carbonica, che può anche scoraggiare la crescita di altre specie. Gli estremofili prendono il nome dalla loro preferenza per condizioni estreme, come temperature molto basse o alte, condizioni ridotte o assenti di ossigeno o in presenza di sale alto. Queste condizioni sono probabilmente intollerabili per la maggior parte degli altri microbi.

Per arricchire ulteriormente un organismo di interesse, alcuni tipi di terreni contengono indicatori che forniscono informazioni sul metabolismo dell'organismo. Il sale di mannitolo agar inibisce la crescita di organismi sensibili all'alto contenuto di sale. I batteri Gram negativi in genere non possono sopravvivere, ma il genere Staphylococcus gram positivo è in grado di prosperare. Inoltre, l'agar MSA indica tutte le colonie in grado di fermentare il mannitolo perché i sottoprodotti acidi della fermentazione trasformeranno l'indicatore rosso metile nel terreno in un giallo brillante. Ciò può consentire una selezione più specifica di una specie.

Un altro mezzo di arricchimento comune, l'eosina blu di metilene, contiene eosina e coloranti blu di metilene, che sono tossici per gli organismi gram positivi. Contiene anche lattosio e batteri su queste piastre che possono fermentare, questo produrrà acidi che abbassano il pH favorendo l'assorbimento del colorante. Queste colonie assorbono grandi quantità di pigmento e appaiono scure e metalliche. In questo laboratorio, coltiverai quattro diversi organismi di prova in tre diverse condizioni di terreno e poi in condizioni aerobiche rispetto a quelle anaerobiche prima di osservarne lo sviluppo.

Prima di iniziare l'esperimento, lavarsi accuratamente le mani e asciugarle, prima di indossare guanti da laboratorio di dimensioni adeguate. Quindi, sterilizzare il piano di lavoro con candeggina al 5%, strofinandolo accuratamente. Quindi, prendi un anello di inoculazione sterile e posizionalo in un pallone vuoto da 125 millilitri in modo che non tocchi la superficie del banco. Quindi, dal frigorifero, raccogli quattro piastre di Mannitol Salt Agar, o MSA, quattro piastre di agar blu di metilene eosina, EMB e otto piastre di agar di soia triptica, o TSA. Il terreno TSA è un terreno di coltura non selettivo che verrà utilizzato per le due diverse condizioni ambientali. Infine, raccogli le tue colture di interesse in un rack per provette. Qui verranno coltivati Escherichia coli, Staphylococcus aureus, Staphylococcus epidermis e Proteus vulgaris.

Per iniziare, accendi un bruciatore Bunsen, che verrà utilizzato per sterilizzare gli strumenti. Quindi, posizionare una piastra MSA, una piastra EMB e due piastre TSA a portata di mano. Quindi, selezionare una delle colture batteriche. Inoculerai tutte e quattro queste piastre con la prima coltura. Con la mano libera, raccogli l'ansa di inoculazione e poi sterilizzala nella fiamma del bruciatore fino a quando non si illumina di arancione per un paio di secondi. Lasciare raffreddare l'anello all'aria. Quindi, aprire il tubo di coltura del brodo e fiammeggiare rapidamente l'apertura. Immergere l'anello nella coltura e poi strisciare l'organismo sul primo quadrante della prima piastra. Quindi sterilizzare nuovamente l'ansa alla fiamma e striare il secondo quadrante. Ripetere questa azione di sterilizzazione a fiamma e poi striature per completare il terzo e il quarto quadrante. Lo striato in questo modo dovrebbe dare colonie isolate e anche consentire la conferma che la coltura non è contaminata.

Ora, riposiziona il coperchio ed etichetta il fondo della piastra con il nome del batterio, il tipo di supporto, la data e le tue iniziali. Quindi, ripetere la striatura utilizzando la stessa coltura batterica per ciascuna delle tre piastre rimanenti, avendo cura di etichettarle ogni volta. Ora che la prima coltura è stata striata, ripetere questi passaggi per gli altri batteri per ottenere una piastra MSA inoculata, una piastra EMB e due piastre TSA inoculate per ogni specie. Una volta che tutti gli organismi sono stati trasferiti, accendi il cappio un'ultima volta.

Per determinare quali organismi possono crescere in un ambiente a ridotto contenuto di ossigeno, aprire un sistema di camere a gas sigillate e posizionare una serie di quattro piastre per batteri TSA all'interno. Quindi, posizionare una bustina di condizione anaerobica nella camera e sigillarla ermeticamente. Infine, posizionare tutte le piastre, comprese quelle all'interno del sistema di camere a gas sigillate, in un'incubatrice a 37 gradi Celsius durante la notte. In futuro, controlla le piastre ogni 24-48 ore per dare alle colonie il tempo di crescere e metabolizzare eventuali reagenti indicatori.

Per valutare la capacità delle diverse specie batteriche di rispondere a ciascuna condizione di crescita, esaminare prima le piastre per la crescita e registrare quali specie sono state in grado di produrre colonie su ciascun tipo di terreno e nella condizione anaerobica rispetto a quella aerobica. Nota il colore degli organismi che crescono, nonché le dimensioni e la forma delle colonie.

Il terreno di agar al sale di mannitolo è selettivo per gli organismi gram positivi che sono in grado di sopravvivere in 6. Cloruro di sodio al 5%. In questo esperimento, ciò significava che i gram negativi E. coli e P. vulgaris non crescevano a causa delle alte concentrazioni di sale. S. epidermis e S. aureus sono stati in grado di crescere, tuttavia, confermando che sono gram positivi. Inoltre, c'è una chiara differenza tra le due specie perché lo S. aureus è in grado di fermentare il mannitolo trasformando l'indicatore rosso metile nel mezzo in un giallo brillante a causa dei sottoprodotti acidi della fermentazione. Questo non è stato osservato nel caso di S. epidermis.

Il mezzo EMB, d'altra parte, è selettivo per gli organismi gram negativi perché i coloranti eosina e blu di metilene sono tossici per le cellule gram positive. La membrana esterna dei batteri gram negativi impedisce a questi coloranti tossici di entrare nelle cellule, il che significa che sono in grado di crescere. Inoltre, questo mezzo indica se la specie batterica presente è in grado di fermentare il lattosio. Qui, le colonie di E. coli assumono un colore viola scuro, a volte con una lucentezza metallica verde che indica la fermentazione. P. vulgaris cresce su questo substrato ma non fermenta il lattosio e quindi appare di un colore rosato chiaro al viola per essere in presenza del colorante. Nella condizione anaerobica, le specie batteriche sui terreni TSA dovrebbero ancora crescere, ma potrebbero farlo molto male rispetto a quelle con ossigeno in abbondanza. Questo perché nessuna delle specie di prova è un anaerobo obbligato.

Esperimenti come questo per arricchire l'ambiente di crescita possono aiutare a favorire e isolare una specie specifica da un campione misto. Possono anche aiutare a determinare le condizioni di crescita ottimali per diverse specie batteriche in un ambiente di laboratorio, aiutando così ulteriori ricerche.