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Colture pure e piastratura per striscio: isolamento di singole colonie batteriche da un campione misto

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Microbiology

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Pure Cultures and Streak Plating: Isolation of Single Bacterial Colonies from a Mixed Sample

6.3: Enrichment Cultures: Culturing Aerobic and Anaerobic Microbes on Selective and Differential Medias

6.5: 16S rRNA Sequencing: A PCR-based Technique to Identify Bacterial Species

165,366 Views

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09:03 min

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April 30, 2023

Overview

Fonte: Tilde Andersson¹, Rolf Lood¹
¹ Dipartimento di Scienze Cliniche Lund, Divisione di Medicina delle Infezioni, Centro Biomedico, Università di Lund, 221 00 Lund, Svezia

Apparentemente impossibile da determinare, la biodiversità microbica è davvero sbalorditiva con una stima di un trilione di specie coesiste (1,2). Sebbene climi particolarmente rigidi, come l’ambiente acido dello stomaco umano (3) o i laghi subglaciali dell’Antartide (4), possano essere dominati da una specie specifica, i batteri si trovano tipicamente nelle colture miste. Poiché ogni ceppo può influenzare la crescita di un altro (5), la capacità di separare e coltivare colonie “pure” (costituite da un solo tipo) è diventata essenziale sia in ambito clinico che accademico. Le colture pure consentono ulteriori esami genetici (6) e proteomici (7), l’analisi della purezza del campione e, forse più degno di nota, l’identificazione e la caratterizzazione di agenti infettivi da campioni clinici.

I batteri hanno una vasta gamma di requisiti di crescita e ci sono numerosi tipi di mezzi nutritivi progettati per sostenere sia le specie poco esigenti che le specie esigenti (8). I mezzi di crescita possono essere preparati sia in forma liquida (come brodo) che in una forma solida tipicamente a base di agar (un agente gelificante derivato dalle alghe rosse). Mentre l’inoculazione diretta in brodo comporta il rischio di generare una popolazione batterica geneticamente diversificata o addirittura mista, la placcatura e la ri-striatura creano una coltura più pura in cui ogni cellula ha un corredo genetico molto simile. La tecnica della piastra striata si basa sulla progressiva diluizione di un campione (Figura 1), con l’obiettivo di separare le singole cellule l’una dall’altra. Qualsiasi cellula vitale (di seguito denominata unità formante colonia, CFU) sostenuta dal mezzo e dall’ambiente designato può successivamente trovare una colonia isolata di cellule figlie attraverso la fissione binaria. Nonostante i rapidi tassi di mutazione all’interno delle comunità batteriche, questo gruppo di cellule è generalmente considerato clonale. La raccolta e la ri-striatura di questa popolazione assicura di conseguenza che il lavoro successivo coinvolga solo un singolo tipo batterico.

Figura 1: Una piastra striata si basa sulla diluizione progressiva del campione originale. I) L’inoculo viene inizialmente disperso utilizzando un movimento a zig-zag, creando un’area con una popolazione batterica relativamente densa. II-IV) Le strisce vengono disegnate dall’area precedente, utilizzando ogni volta un ciclo di inoculazione sterile, fino a raggiungere il quarto quadrante. V) Un movimento finale a zig-zag diretto verso il centro della placca forma una regione in cui l’inoculo è stato marcatamente diluito, permettendo alle colonie di apparire separate l’una dall’altra.

La tecnica della piastra striata può anche essere combinata con l’uso di mezzi selettivi e/o differenziali. Un mezzo selettivo inibisce la crescita di alcuni organismi(ad esempio attraverso l’aggiunta di antibiotici) mentre un mezzo differenziale aiuterà esclusivamente a distinguere l’uno dall’altro(ad esempio attraverso l’emolisi su piastre di agar nel sangue).

Alla base di tutto il lavoro in microbiologia c’è l’uso di tecniche asettiche (sterili). Ogni coltura batterica deve essere considerata potenzialmente patogena in quanto vi è il rischio di crescita involontaria di ceppi insidiosi, formazione di aerosol e contaminazione di attrezzature/personale. Per ridurre al minimo questi rischi, tutti i supporti, gli articoli in plastica, metallo e vetro vengono in genere sterilizzati attraverso l’autoclave prima e dopo l’uso, sottoponendoli a vapore saturo ad alta pressione a circa 121 ° C che elimina efficacemente le cellule persistenti. Lo spazio di lavoro viene generalmente disinfettato utilizzando etanolo sia prima che dopo l’uso. Il cappotto da laboratorio e i guanti sono sempre indossati durante il lavoro con agenti infettivi.

Procedure

1. Configurazione

Tutti i microbi dovrebbero essere trattati come se fossero pericolosi. Indossare sempre un cappotto da laboratorio e guanti, legare i capelli lunghi e assicurarsi che eventuali ferite siano particolarmente ben protette.
Preparare lo spazio di lavoro sterilizzandolo utilizzando il 70% di etanolo.
Assicurarsi che le piastre di agar, le soluzioni campione e una scatola di anelli di inoculazione in plastica pre-sterilizzati o un anello metallico più una fiamma Bunsen siano a portata di mano. I loop di plastica usa e getta sono in genere pre-sterilizzati. I loop metallici devono essere immersi nel 70% di etanolo, quindi tenuti vicino all’area blu di una fiamma Bunsen e riscaldati fino a quando non sono caldi. Lasciare raffreddare il filo sollevando il coperchio della piastra (solo leggermente per evitare contaminazioni) e picchiettandolo contro il mezzo solidificato.
Completare ogni procedura con una sterilizzazione ripetuta dello spazio di lavoro e un accurato lavaggio/sterilizzazione di mani e polsi.

2. Protocollo

Preparazione dei media
1. Identificare e preparare un mezzo solido (in genere contenente l’1,5% (p / v) di agar) che sosterrà la specie / ceppo batterico utilizzato. Mescolare il mezzo in una bottiglia in grado di contenere il doppio del volume finale per evitare il trabocco in autoclave.
2. Sterilizzare il materiale ponendo il biberon, con tappo semisertato, in autoclave impostata a 121°C per 20 min.
3. Chiudere correttamente il tappo non appena il flacone viene rimosso dall’autoclave. Se il supporto deve essere utilizzato a breve, posizionare la bottiglia in un bagno d’acqua impostato a 45 ° C per conservarlo allo stato liquido. L’agar altrimenti si solidificherà a meno di 32-40 ° C e può essere successivamente riscaldato (in genere utilizzando un forno a microonde) in un punto di fusione a 85 ° C.
Preparazione della/e piastra/e di coltura
1. Contrassegnare la base delle piastre di Petri sterili (in genere 100 x 15 mm) sul lato o sul fondo con il nome dello sperimentatore, la data e il tipo di supporto.
2. Versare 20-25 mL di terreno di coltura agar a 45°C (precedentemente preparato) in ciascuna delle piastre etichettate. Se la schiuma appare lungo i bordi, questa dovrebbe essere rapidamente rimossa usando una pipetta normale e una punta sterile.
3. Rimettere immediatamente tutti i coperchi sui piatti per evitare contaminazioni.
4. Lasciare solidificare l’agar per circa 2 ore a temperatura ambiente o durante la notte a 4°C. Una volta impostate, le piastre di coltura batterica devono essere successivamente conservate capovolte a 4 ° C per ridurre al minimo la condensa sulla superficie del mezzo.
Placcatura a striature
1. Immergere un anello sterile nell’inoculo desiderato e disperdere immediatamente il campione raccolto sul primo quadrante della piastra usando un movimento a zig-zag (Figura 1, I).
2. Chiudere il coperchio e risterizzare l’anello di inoculazione o raccogliere un nuovo anello sterile monouso.
3. Effettuare 3-4 colpi irradiando dal primo quadrante (contenente una popolazione batterica relativamente densa) verso il secondo quadrante della piastra (Figura 1, II).
4. Chiudere il coperchio e risterizzare il ciclo di inoculazione o scartare il ciclo usa e getta e raccoglierne uno nuovo sterile.
5. Ripeti questa striscia di 3-4 colpi dal secondo al terzo quadrante, e poi dal terzo al quarto quadrante, usando ogni volta un ciclo sterile (Figura 1, III – IV).
6. Usando un loop sterile, fai un tratto finale in uno schema a zig-zag dal quarto quadrante verso il centro della piastra (Figura 1, V). La prevalenza batterica sarà inferiore in quest’area, consentendo idealmente di stabilire singole colonie da una singola cellula madre vitale.
7. Chiudere il coperchio e (se richiesto dalle specie batteriche) sigillare con parafilm per impedire il flusso d’aria.
8. A seconda della specie/ceppo batterico, posizionare la piastra di coltura verso l’alto in un ambiente adatto e incubare fino a quando le colonie batteriche sono visibili (colonie segregate possono apparire in entrambe le aree della piastra poiché la concentrazione iniziale può variare).
9. Per generare una popolazione batterica clonale, strisciare un’altra piastra, scambiando l’inoculo placcato sulla piastra originale con cellule isolate da una singola colonia della piastra originale.

Su una capsula di Petri, se un singolo batterio subisce più cicli di riproduzione asessuata, porterà alla formazione di una colonia clonale. Tuttavia, ottenere un singolo batterio da un campione misto, come una sospensione del suolo, può essere difficile. Se si esegue un ciclo di questa cultura eterogenea, può contenere fino a un trilione di singoli batteri. Per diffondere così tanti batteri sulla superficie di una piastra di agar e ottenere una singola colonia, anche usando un modello a zig-zag, il loop dovrebbe essere trascinato continuamente sulla superficie di un numero sufficiente di piastre affiancate per circondare l’intera Liberty Island. Ovviamente, gli scienziati non usano davvero così tanti piatti. Invece, usano una tecnica chiamata streak plating.

La tecnica della piastra striata si basa sulla progressiva diluizione di un campione batterico e viene eseguita sulla superficie solida di una singola capsula di Petri. Per iniziare, la superficie del supporto è visivamente divisa in cinque sezioni assegnando quattro frammenti della circonferenza come le prime quattro sezioni e il centro della piastra come quinta. Ciò creerà effettivamente cinque piastre multimediali da una singola capsula di Petri. Successivamente, utilizzando un ciclo di inoculo desiderato, la prima sezione viene striata utilizzando un motivo a zig-zag. Quindi, viene utilizzato un nuovo anello usa e getta o, nel caso di un anello di filo, viene sterilizzato con un bruciatore Bunsen, infiammandolo fino a quando non è rovente lungo la lunghezza del filo. Questo uso di un nuovo loop, o flame sterilize loop, rimuove tutte le cellule batteriche rimanenti, aiutando nella diluizione dei batteri. L’hot loop viene quindi raffreddato nell’aria per alcuni secondi prima di essere trascinato attraverso la prima sezione per creare tre o quattro linee separate, ognuna delle quali trasporta solo una frazione di batteri nella seconda sezione. Le sezioni rimanenti sono striate allo stesso modo, usando ogni volta un anello sterile e un singolo passaggio attraverso la striscia precedente.

Utilizzando questo ciclo di striature e sterilizzazione, la concentrazione batterica in ogni sezione successiva deve essere diluita in modo che la sezione finale contenga solo pochi batteri discretamente localizzati. Al momento dell’incubazione, questi batteri discreti si moltiplicano per produrre colonie clonali isolate di cellule figlie, che sono indicate come unità formanti colonie o CFU. Questi possono essere raccolti e ri-striati per garantire che il lavoro successivo coinvolga solo un singolo tipo batterico, indicato come una coltura pura. Oltre a isolare singole colonie da una coltura batterica mista, la tecnica di placcatura a strisce viene utilizzata anche per selezionare ceppi specifici del mezzo, determinare la morfologia delle colonie batteriche o identificare diverse specie batteriche. In questo video, dimostreremo come isolare le colonie monobatte batteriche da una sospensione di campioni batterici misti tramite tecnica di placcatura a strisce.

Per iniziare, indossa guanti da laboratorio e un cappotto da laboratorio. Quindi, sterilizzare lo spazio di lavoro utilizzando il 70% di etanolo. Quindi, selezionare un mezzo adatto che sostenga la specie o il ceppo batterico utilizzato e iniziare a preparare il supporto. Qui, l’agar LB comune viene preparato pesando dieci grammi di mezzi in polvere pre-formulati e 7,5 grammi di agar. Aggiungere i componenti pesati e asciugati a una bottiglia di vetro in grado di contenere il doppio del volume finale per evitare il trabocco. Quindi, aggiungere 500 millilitri di acqua alla bottiglia e tapparla semi-strettamente. Sterilizzare il supporto mettendo la bottiglia in un’autoclave impostata a 121 gradi Celsius per venti minuti. Dopo il completamento, utilizzare guanti resistenti al calore o un cuscinetto caldo per rimuovere il supporto dalla macchina e quindi ruotare immediatamente il tappo della bottiglia per chiuderlo ermeticamente.

Per l’uso in giornata, lasciare raffreddare il supporto mettendo la bottiglia in un bagno d’acqua riscaldato a circa 45 gradi Celsius, per preservare il supporto allo stato liquido. In alternativa, il supporto può essere lasciato a temperatura ambiente per essere riposto allo stato solido. Quando necessario, microonde la bottiglia con il coperchio leggermente aperto per sciogliere il supporto e lasciare raffreddare il supporto utilizzando un bagno d’acqua a 45 gradi Celsius.

Quindi, prendi una manica di piastre di Petri sterili e, con un pennarello permanente, etichettale con i nomi dell’investigatore e dei media, nonché la data. Quindi, trasferire il volume richiesto di supporti in un recipiente sterile e aggiungere antibiotici o altri componenti sensibili, se necessario. Qui, 50 millilitri di media vengono miscelati con 100 microlitri di Kanamicina per una concentrazione finale di 25 microgrammi per millilitro. Ruotare il tubo per garantire una distribuzione uniforme dei componenti aggiunti in tutto il supporto. Lentamente, in modo da evitare la formazione di bolle, versare da 20 a 25 millilitri di terreno di coltura di circa 45 gradi Celsius in ciascuna delle piastre. Se compaiono bolle o schiuma, rimuovere rapidamente utilizzando una pipetta normale e una punta sterile. Quindi, sostituire immediatamente tutti i coperchi per evitare la contaminazione. Lasciare che l’agar si solidifichi a temperatura ambiente per almeno due ore o durante la notte. Una volta solidificate, conservare le piastre di coltura a testa in giù a quattro gradi Celsius per ridurre al minimo la condensa sulla superficie del mezzo.

Per strisciare la cultura di scelta, prima prendi un piatto di coltura pulito e rimuovi il coperchio. Lavorando rapidamente, immergere un anello sterile usa e getta nell’inoculo desiderato e quindi tamponare immediatamente il ciclo sul primo quadrante della piastra con un movimento a zig-zag. Sostituire il coperchio del piatto, scartare il ciclo di inoculazione utilizzato, quindi selezionare un nuovo ciclo sterile. Usando il nuovo loop, fai da tre a quattro tratti attraversando la linea del tampone originale che si irradia dal primo quadrante, che dovrebbe contenere una popolazione di batteri relativamente densa nel secondo quadrante. Chiudere nuovamente il coperchio ed eliminare il cappio. Con un nuovo loop, ripeti di nuovo questa azione, ma questa volta strisciando dal secondo al terzo quadrante. Quindi, con un nuovo loop di nuovo, fai un’altra striscia dalla terza alla quarta sezione della piastra. Infine, con un nuovo loop, fai un ultimo colpo in uno schema a zig-zag dal quarto quadrante verso il centro della piastra. La prevalenza batterica sarà inferiore in quest’area, consentendo idealmente di stabilire singole colonie da una singola cellula madre vitale.

Sostituire il coperchio della piastra e, se appropriato per le specie batteriche, sigillare la piastra con para pellicola per impedire il flusso d’aria. Capovolgere la piastra di coltura per evitare gocciolamenti di condensa, quindi posizionare a una temperatura adeguata per la crescita. Qui, un’incubatrice è impostata su 37 gradi Celsius. Lasciare incubare la piastra fino a quando le colonie batteriche sono visibili. Per generare una popolazione batterica clonale, selezionare una colonia discreta da questa piastra. Ora, con il loop sterile, tocca la colonia bersaglio e, come prima, fai una striscia nel primo quadrante di una nuova piastra. Continuare a sterilizzare alternativamente il loop e strisciare i quadranti rimanenti della piastra come precedentemente dimostrato, terminando con lo zig-zag al centro. Chiudere la piastra e posizionarla per incubare fino a formare colonie discrete. Una volta che queste colonie sono cresciute, in genere rappresentano ceppi clonali puri.

La piastra striata iniziale può contenere colonie provenienti da cellule di diverse specie batteriche o cellule con diverso corredo genetico, a seconda della purezza del campione. Attraverso il successivo isolamento di una singola colonia, dove tutte le unità sono derivate da una cellula madre comune, la seconda procedura di striatura genera una popolazione batterica relativamente clonale, adatta per un’ulteriore caratterizzazione o inoculazione in brodo.

Results

La stestra iniziale può contenere colonie provenienti da cellule con diverso corredo genetico o (a seconda della purezza del campione) da diverse specie batteriche (Figura 2A).

Attraverso il successivo isolamento di una singola colonia, dove tutte le unità sono derivate da una comune cellula madre, la seconda procedura di striatura genera una popolazione batterica relativamente clonale, adatta per un’ulteriore caratterizzazione o inoculazione in brodo (Figura 2B).

Figura 2: Una cultura pura può essere generata da un campione misto attraverso l’isolamento di una singola colonia appartata. A) La crescita di una singola cellula batterica (CFU) ha generato una colonia clonale, separata da quelle di altre specie e ceppi. Questo CFU è stato utilizzato per la successiva strisciatura su una nuova piastra B) Una seconda piastra, dove la popolazione batterica è costituita esclusivamente da cellule derivate dal CFU iniziale.

Applications and Summary

La capacità di ottenere e coltivare una colonia batterica pura è essenziale, sia in ambito clinico che accademico. La streak plating consente l’isolamento di una popolazione di cellule relativamente clonali, originata da un CFU condiviso, che può essere di particolare interesse durante la diagnosi o per un’ulteriore caratterizzazione dell’isolato. Un campione viene striato su un mezzo nutritivo a base di agar adatto e incubato fino a quando le colonie diventano visibili. Una colonia isolata viene successivamente raccolta e ri-striata su un secondo piatto.

References

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Transcript

On a Petri dish, if a single bacterium undergoes multiple rounds of asexual reproduction, it will lead to the formation of a clonal colony. However, obtaining a single bacterium from a mixed sample, such as a soil suspension, can be difficult. If one loopful of this heterogeneous culture is taken, it can contain as many as one trillion individual bacteria. To spread this many bacteria out onto the surface of an agar plate and obtain a single colony, even using a zig-zag pattern, the loop would need to be dragged continuously over the surface of enough plates set side-by-side to encircle the entirety of Liberty Island. Obviously, scientists do not really use that many plates. Instead, they use a technique called streak plating.

The streak plate technique is based on progressive dilution of a bacterial sample, and it is performed over the solid media surface of a single Petri dish. To begin, the media surface is visually divided into five sections by assigning four fragments of the circumference as the first four sections, and the plate’s center as the fifth. This will effectively create five media plates out of a single Petri dish. Next, using a loopful of desired inoculum, the first section is streaked using a zig-zag pattern. Then, either a new disposable loop is used, or in the case of a wire loop, it is sterilized with a Bunsen burner, flaming it until it is red hot along the length of the wire. This use of a new loop, or flame sterilize loop, removes any remaining bacterial cells, assisting in the dilution of the bacteria. The hot loop is then cooled in the air for a few seconds before being dragged through the first section to create three to four separate lines, each carrying only a fraction of bacteria into the second section. The remaining sections are streaked in the same manner, using a sterile loop each time, and a single pass through the previous streak.

Using this cycle of streaking and sterilizing, the bacterial concentration in every subsequent section should be diluted so that the final section contains only a few discretely located bacteria. Upon incubation, these discrete bacteria multiply to produce isolated clonal colonies of daughter cells, which are referred to as Colony Forming Units, or CFUs. These can be harvested and re-streaked to ensure that subsequent work involves only a single bacterial type, referred to as a pure culture. As well as isolating single colonies from a mixed-bacterial culture, the streak plating technique is also used to select media-specific strains, determine bacterial colony morphology, or identify different bacterial species. In this video, we will demonstrate how to isolate single-bacterial colonies from a mixed-bacterial sample suspension via streak plating technique.

To begin, put on laboratory gloves and a lab coat. Next, sterilize the workspace using 70% ethanol. Next, select a suitable medium that will sustain the utilized bacterial species or strain and begin preparing the media. Here, common LB agar is prepared by weighing out ten grams of pre-formulated, powdered media and 7.5 grams of agar. Add the weighed, dried components to a glass bottle which is able to hold twice the final volume to avoid overflow. Then, add 500 milliliters of water to the bottle, and cap it semi-tightly. Sterilize the media by placing the bottle in an autoclave set to 121 degrees Celsius for twenty minutes. After completion, use heat-proof gloves or a hot pad to remove the media from the machine and then immediately twist the bottle cap to close it tightly.

For the same-day use, let the media cool down by placing the bottle into a water bath heated to approximately 45 degrees Celsius, to preserve the media in a liquid state. Alternatively, the media can be left at room temperature to store at solid state. When needed, microwave the bottle with the lid slightly open to melt the media, and allow the media to cool using a 45 degree Celsius water bath.

Next, take a sleeve of sterile Petri dishes, and with a permanent marker, label them with the investigator and media names as well as the date. Then, transfer the required volume of media into a sterile vessel, and add antibiotics or other sensitive components if necessary. Here, 50 milliliters of media is mixed with 100 microliters of Kanamycin for a final concentration of 25 micrograms per milliliter. Swirl the tube to ensure even distribution of the added components throughout the media. Slowly, so as to avoid bubble formation, pour 20 to 25 milliliters of approximately 45 degree Celsius culture medium into each of the plates. If bubbles or foam appear, swiftly remove using a regular pipette and a sterile tip. Then, immediately replace all lids to prevent contamination. Allow the agar to solidify at room temperature for at least two hours or overnight. Once solidified, store the culture plates upside down at four degrees Celsius to minimize condensation on the medium’s surface.

To streak the culture of choice, first take a clean culture plate and remove the lid. Working quickly, submerge a disposable, sterile loop into the desired inoculum and then immediately swab the loop over the first quadrant of the plate using a zig-zag motion. Replace the lid of the dish, discard the used inoculation loop, and then select a new sterile loop. Using the new loop, make three to four strokes crossing the original swab line radiating from the first quadrant, which should contain a relatively dense bacteria population into the second quadrant. Close the lid once more, and discard the loop. With a new loop, repeat this action again, but this time streaking from the second into the third quadrant. Then, with a new loop again, make another streak from the third into the fourth section of the plate. Finally, with a fresh loop, make one last stroke in a zig-zag pattern from the fourth quadrant towards the center of the plate. The bacterial prevalence will be lower in this area, ideally allowing individual colonies to be established from a single viable mother cell.

Replace the plate lid, and if appropriate for the bacterial species, seal the plate with para film to prevent airflow. Turn the culture plate upside down to prevent condensation drips, and then place at a suitable temperature for growth. Here, an incubator is set to 37 degrees Celsius. Allow the plate to incubate until bacterial colonies are visible. To generate a clonal bacterial population, select one discrete colony from this plate. Now, with the sterile loop, touch the target colony, and as before, make a streak in the first quadrant of a new plate. Continue to alternately sterilize the loop and streak the remaining quadrants of the plate as previously demonstrated, ending with the zig-zag to the center. Close the plate, and place it to incubate until discrete colonies form. Once these colonies are grown, they will typically represent pure clonal strains.

The initial streak plate may contain colonies originating from cells from different bacterial species or cells with different genetic makeup, depending upon the sample purity. Through subsequent isolation of a single colony, where all units are derived from a common mother cell, the second streaking procedure generates a relatively clonal bacterial population, suitable for further characterization or inoculation into broth.

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