Colture pure e piastratura per striscio: isolamento di singole colonie batteriche da un campione misto

1. Configurazione

1. Tutti i microbi dovrebbero essere trattati come se fossero pericolosi. Indossare sempre un cappotto da laboratorio e guanti, legare i capelli lunghi e assicurarsi che eventuali ferite siano particolarmente ben protette.
2. Preparare lo spazio di lavoro sterilizzandolo utilizzando il 70% di etanolo.
3. Assicurarsi che le piastre di agar, le soluzioni campione e una scatola di anelli di inoculazione in plastica pre-sterilizzati o un anello metallico più una fiamma Bunsen siano a portata di mano. I loop di plastica usa e getta sono in genere pre-sterilizzati. I loop metallici devono essere immersi nel 70% di etanolo, quindi tenuti vicino all'area blu di una fiamma Bunsen e riscaldati fino a quando non sono caldi. Lasciare raffreddare il filo sollevando il coperchio della piastra (solo leggermente per evitare contaminazioni) e picchiettandolo contro il mezzo solidificato.
4. Completare ogni procedura con una sterilizzazione ripetuta dello spazio di lavoro e un accurato lavaggio/sterilizzazione di mani e polsi.

2. Protocollo

1. Preparazione dei media
   1. Identificare e preparare un mezzo solido (in genere contenente l'1,5% (p / v) di agar) che sosterrà la specie / ceppo batterico utilizzato. Mescolare il mezzo in una bottiglia in grado di contenere il doppio del volume finale per evitare il trabocco in autoclave.
   2. Sterilizzare il materiale ponendo il biberon, con tappo semisertato, in autoclave impostata a 121°C per 20 min.
   3. Chiudere correttamente il tappo non appena il flacone viene rimosso dall'autoclave. Se il supporto deve essere utilizzato a breve, posizionare la bottiglia in un bagno d'acqua impostato a 45 ° C per conservarlo allo stato liquido. L'agar altrimenti si solidificherà a meno di 32-40 ° C e può essere successivamente riscaldato (in genere utilizzando un forno a microonde) in un punto di fusione a 85 ° C.
2. Preparazione della/e piastra/e di coltura
   1. Contrassegnare la base delle piastre di Petri sterili (in genere 100 x 15 mm) sul lato o sul fondo con il nome dello sperimentatore, la data e il tipo di supporto.
   2. Versare 20-25 mL di terreno di coltura agar a 45°C (precedentemente preparato) in ciascuna delle piastre etichettate. Se la schiuma appare lungo i bordi, questa dovrebbe essere rapidamente rimossa usando una pipetta normale e una punta sterile.
   3. Rimettere immediatamente tutti i coperchi sui piatti per evitare contaminazioni.
   4. Lasciare solidificare l'agar per circa 2 ore a temperatura ambiente o durante la notte a 4°C. Una volta impostate, le piastre di coltura batterica devono essere successivamente conservate capovolte a 4 ° C per ridurre al minimo la condensa sulla superficie del mezzo.
3. Placcatura a striature
   1. Immergere un anello sterile nell'inoculo desiderato e disperdere immediatamente il campione raccolto sul primo quadrante della piastra usando un movimento a zig-zag (Figura 1, I).
   2. Chiudere il coperchio e risterizzare l'anello di inoculazione o raccogliere un nuovo anello sterile monouso.
   3. Effettuare 3-4 colpi irradiando dal primo quadrante (contenente una popolazione batterica relativamente densa) verso il secondo quadrante della piastra (Figura 1, II).
   4. Chiudere il coperchio e risterizzare il ciclo di inoculazione o scartare il ciclo usa e getta e raccoglierne uno nuovo sterile.
   5. Ripeti questa striscia di 3-4 colpi dal secondo al terzo quadrante, e poi dal terzo al quarto quadrante, usando ogni volta un ciclo sterile (Figura 1, III - IV).
   6. Usando un loop sterile, fai un tratto finale in uno schema a zig-zag dal quarto quadrante verso il centro della piastra (Figura 1, V). La prevalenza batterica sarà inferiore in quest'area, consentendo idealmente di stabilire singole colonie da una singola cellula madre vitale.
   7. Chiudere il coperchio e (se richiesto dalle specie batteriche) sigillare con parafilm per impedire il flusso d'aria.
   8. A seconda della specie/ceppo batterico, posizionare la piastra di coltura verso l'alto in un ambiente adatto e incubare fino a quando le colonie batteriche sono visibili (colonie segregate possono apparire in entrambe le aree della piastra poiché la concentrazione iniziale può variare).
   9. Per generare una popolazione batterica clonale, strisciare un'altra piastra, scambiando l'inoculo placcato sulla piastra originale con cellule isolate da una singola colonia della piastra originale.