Sequenziamento dell'rRNA 16S: una tecnica basata sulla PCR per identificare le specie batteriche

1. Configurazione

1. Durante la manipolazione dei microrganismi, è necessario seguire una buona pratica microbiologica. Tutti i microrganismi, in particolare i campioni sconosciuti, devono essere trattati come potenziali agenti patogeni. Seguire la tecnica asettica per evitare di contaminare i campioni, i ricercatori o il laboratorio. Lavarsi le mani prima e dopo aver maneggiato i batteri, usare guanti e indossare indumenti protettivi.
2. Effettuare una valutazione del rischio per il protocollo sperimentale per l'isolamento del DNA genomico e la purificazione del prodotto PCR. Alcuni reagenti possono essere dannosi!
3. La coltura pura è essenziale per il sequenziamento dell'rRNA 16S. Prima di procedere all'isolamento del DNA genomico, assicurarsi che il materiale di partenza sia completamente puro. Questo può essere fatto con la placcatura a strisce per isolare le singole colonie. Questi possono essere ulteriormente coltivati striati su piatti singolarmente o in brodo, se necessario.
4. Attrezzature di laboratorio necessarie:
   1. Termocicclatore per PCR. La funzione del termocicatore è quella di alzare e abbassare la temperatura secondo un programma prestabilito. Durante la creazione del programma ti verrà chiesto di inserire i valori di temperatura e tempo per ogni fase della PCR e il numero totale di cicli.
   2. Sistema di elettroforesi su gel di acarosio. Viene utilizzato per separare i frammenti di DNA in base alle loro dimensioni e carica. In questo protocollo, l'elettroforesi su gel di acarosio verrà utilizzata per visualizzare la qualità del DNA genomico isolato e dei prodotti PCR.

2. Protocollo

Nota: Il protocollo dimostrato si applica al sequenziamento del gene rRNA 16S da una coltura pura di batteri. Non si applica agli studi metagenomici.

1. Coltura di batteri per l'isolamento del DNA genomico (gDNA).
   1. Fai crescere il tuo microrganismo su un terreno adatto. Sia i mezzi liquidi che solidi possono essere utilizzati in questa fase. Scegli le condizioni che producono la migliore crescita. Durante la pianificazione dell'esperimento, tieni presente che i batteri a crescita lenta potrebbero richiedere diversi giorni per raggiungere la fase di crescita tardiva / stazionaria. In questo protocollo, Bacillus subtilis 168 è stato coltivato in brodo di lipogenia (LB) durante la notte in un incubatore vibrante impostato a 200 giri / min, 37 ° C.
2. Isolamento del gDNA.
   1. Se i batteri sono stati coltivati su un terreno solido, raschiare alcune cellule usando un anello sterile e risuscimarle in 1 mL di acqua distillata
   2. Se i batteri sono stati coltivati in mezzo liquido, utilizzare circa 1,5 ml di una coltura notturna.
   3. Pellet le cellule mediante centrifugazione (1 minuto, 12.000 - 16.000 × g), rimuovere il surnatante e utilizzare le cellule per l'isolamento del gDNA utilizzando un kit commerciale o protocolli standard[ad esempio preparazione totale del DNA CTAB (13) o estrazione fenolo-cloroformio (14)]. Qui, un kit commerciale è stato utilizzato per isolare gDNA da 1,5 mL di B. subtilis 168 coltura notturna, OD₆₀₀ = 1,5.
      Nota 1: Per alcuni batteri Gram-negativi questo passaggio può essere omesso e sostituito da un semplice rilascio di DNA dalle cellule mediante ebollizione. Sospendare il pellet batterico in acqua distillata e incubare in un blocco riscaldante impostato a 100 °C per 10 minuti.
      Nota 2: Le cellule batteriche Gram-positive sono difficili da distruggere. Si raccomanda quindi di scegliere un metodo o un kit di isolamento del gDNA dedicato all'isolamento da questo gruppo di batteri.
3. Controllo qualità gDNA.
   1. Controllare la qualità del gDNA isolato mediante elettroforesi su gel di agarosio. In primo luogo, mescolare 5 μL del gDNA isolato con 1 μL del colorante di carico (6x) e caricare il campione su un gel di agarosio allo 0,8% che contiene un reagente di colorazione del DNA.
   2. Caricare uno standard di massa molecolare ed eseguire l'elettroforesi fino a quando il fronte del colorante raggiunge il fondo del gel.
   3. Una volta completata l'elettroforesi, visualizzare il gel su un transilluminatore adatto (luce UV o blu). Il gDNA appare come una banda molecolare alta spessa (superiore a 10 kb). Un esempio del controllo di qualità del gDNA è mostrato nella Figura 3.
   4. Se il gDNA supera il controllo di qualità(cioèla banda molecolare alta è presente e c'è poco o nessuna sbavatura del gDNA), diluire il gDNA in serie etichettando prima 3 tubi microcentrifuga come segue: "10x", "100x" e "1000x".
   5. Pipettare 90 μL di acqua distillata sterile in ciascuno dei 3 tubi.
   6. Prendere 10 μL della soluzione di gDNA e aggiungerla al tubo contrassegnato "10x".
   7. Pipettare accuratamente l'intero volume(cioè 100 μL) su e giù per garantire che la soluzione sia miscelata uniformemente. Quindi, prendere 10 μL della soluzione da questo tubo e trasferirlo sul tubo contrassegnato "100x".
   8. Miscelare come descritto in precedenza e ripetere la stessa procedura trasferendo 10 μL della soluzione dal tubo "100x" al tubo "1000x". Queste diluizioni saranno utilizzate come modello nella reazione PCR.

Figura 3: Elettroforesi su gel di agarosio di gDNA isolato da Bacillus subtilis. Corsia 1: M - marcatore di massa molecolare (dall'alto verso il basso: 10000 bp, 8000 bp, 6000 bp, 5000 bp, 4000 bp, 3500 bp, 3000 bp, 2500 bp, 2000 bp, 1500 bp, 1000 bp). Corsia 2: gDNA - DNA genomico isolato da Bacillus subtilis. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

4. Amplificazione del gene rRNA 16S mediante PCR.
   Nota: Il protocollo PCR riportato di seguito è ottimizzato per una particolare coppia di DNA polimerasi e primer 8F - 1492R (vedere Tabella 1). L'ottimizzazione del protocollo è necessaria per ogni coppia di polimerasi e primer.
   1. Scongelare tutti i reagenti sul ghiaccio.
   2. Preparare la miscela master PCR come mostrato nella Tabella 2. Poiché la DNA polimerasi è attiva a temperatura ambiente, la configurazione della reazione deve essere eseguita su ghiaccio, cioè i tubi PCR e i componenti della reazione devono essere mantenuti sul ghiaccio tutto il tempo. Preparare una reazione per ogni campione di gDNA e una reazione per il controllo negativo. Il controllo negativo è una miscela PCR senza il modello gDNA e viene utilizzato per garantire che gli altri componenti della reazione non siano contaminati.
      Nota: In caso di più campioni, viene comunemente preparato un mix master. Master mix è una soluzione contenente tutti i componenti di reazione ad eccezione del modello. Aiuta a omettere il pipettaggio ripetitivo, evitare errori di pipettaggio e garantisce un'elevata coerenza tra i campioni. Per preparare il master mix, moltiplicare il volume di ciascun componente (ad eccezione del modello di DNA) per il numero di campioni testati. Mescolare tutti i componenti in tubo microcentrifuga e pipettare l'intero volume su e giù più volte.
   3. Aliquota 49 μL della miscela master nei singoli tubi PCR.
   4. Aggiungere un modello da 1 μL nei tubi con miscela master. Per il controllo negativo aggiungere 1 μL di acqua sterile. Per garantire che i componenti siano ben miscelati, pipettare delicatamente la miscela su e giù ~ 10 volte con una pipetta impostata su 30-50μL.
   5. Impostare la macchina PCR con il programma mostrato nella Tabella 3.
   6. Inserire i tubi nella macchina PCR e avviare il programma.
   7. Una volta completato il programma, esaminare la qualità del prodotto PCR mediante elettroforesi su gel di agarose.
   8. Una reazione PCR di successo utilizzando la coppia di primer 8F-1492R produce una singola banda di circa 1,5 kb (Figura 4). Se sono presenti altre bande (cioè prodotti non specifici), ottimizzare il programma PCR regolando la temperatura di ricottura. Se è presente una singola banda di dimensioni previste, procedere al passaggio successivo. Qui, la reazione PCR con modello di gDNA diluito 100x ha prodotto il miglior prodotto in quanto aveva una banda netta di dimensioni previste e mancava di prodotti non specifici. Quindi è stato scelto per essere purificato e inviato per il sequenziamento.
   9. Prima del sequenziamento, il prodotto deve essere ripulito da primer residui, desossiribonucleotidi, polimerasi e tampone che erano presenti nella reazione PCR. I prodotti PCR possono essere isolati utilizzando un kit di purificazione PCR commerciale. La reazione PCR viene caricata su una colonna che contiene una matrice legante il DNA. Il prodotto PCR si associa alla colonna, mentre altri componenti scorrono attraverso la colonna. La colonna viene quindi lavata con tampone di lavaggio e, infine, il DNA viene eluito nel tampone scelto. Verificare che il buffer di eluizione integrato con il kit sia compatibile con il sequenziamento.
   10. Inviare il prodotto PCR purificato per il sequenziamento del DNA. Seguire le linee guida per la presentazione dei campioni di sequenziamento presso l'impianto di sequenziamento scelto. Per la migliore copertura della sequenza, utilizzare i primer di amplificazione PCR (gli stessi utilizzati nella sezione 2.4.1) come primer di sequenziamento. Qui, i primer 8F e 1492R sono stati utilizzati per sequenziare il prodotto PCR.

Componente	Concentrazione finale	Volume per reazione	Volume per x reazioni (master mix)
5x tampone di reazione	1x	10 μL	10 μL × x
10 mM dNTPs	200 μM	1 μL	1 μL × x
10 μM Primer 8F	0,5 μM	2,5 μL	2,5 μL × x
10 μM Primer 1492R	0,5 μM	2,5 μL	2,5 μL × x
Phusion polimerasi	1 unità	0,5 μL	0,5 μL × x
Modello DNA *	-	1 μL	-
ddH2O	-	32,5 μL	32,5 μL × x
Volume totale		50 μL	49 μL × x

Tabella 2: Componenti di reazione PCR. * utilizzare il gDNA diluito 10x, 100x o 1000x dal passaggio 2.3.

Passo	Temperatura	Ore	Cicli
Denaturazione iniziale	98°C	30 secondi
Denaturazione	98°C	10 secondi	25-30
Ricottura	60°C	30 secondi
Estensione	72°C	45 secondi
Estensione finale	72°C	7 minuti
Tenere	4°C	∞

Tabella 3: Programma PCR per l'amplificazione del gene rRNA 16S.

Figura 4: Elettroforesi su gel di agarosio di prodotti PCR amplificata utilizzando primer 8F e 1492R e gDNA come modello. Il campione di gDNA di B. subtilis (vedere Figura 3) è stato diluito 10, 100 e 1000 volte al fine di testare il miglior risultato. Corsia 1: M - marcatore di massa molecolare (dall'alto verso il basso: 10000 bp, 8000 bp, 6000 bp, 5000 bp, 4000 bp, 3500 bp, 3000 bp, 2500 bp, 2000 bp, 1500 bp, 1000bp, 750 bp, 500 bp, 250 bp). Corsia 2: Reazione PCR con modello diluito 10x. Corsia 3: Reazione PCR con modello diluito 100x. Corsia 4: Reazione PCR con modello diluito 1000x. Corsia 5: (C-) - controllo negativo (reazione senza il modello di DNA). Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

3. Analisi dei dati e risultati

Nota: Il prodotto PCR viene sequenziato utilizzando i primer avanti (qui 8F) e inverso (qui 1492R). Pertanto, vengono generati due set di sequenza di dati, uno per il primer in avanti e uno per il primer inverso. Per ogni sequenza vengono generati almeno due tipi di file: i) un file di testo contenente la sequenza del DNA e ii) un cromatogramma del DNA, che mostra la qualità del sequenziamento.

1. Per il primer in avanti, aprire il cromatogramma ed esaminare attentamente la sequenza. Un cromatogramma ideale per una sequenza di qualità dovrebbe avere picchi uniformemente distanziati e segnali di fondo scarsi o nulli (Figura 5A).
2. Se il cromatogramma non è di alta qualità, la sequenza deve essere scartata o il file di testo della sequenza deve essere rivisto in base a quanto segue:
   1. La presenza di doppi picchi in tutto il cromatogramma indica la presenza di più modelli di DNA. Questo può essere il caso se la coltura batterica non era pura. Tale sequenza dovrebbe essere scartata (Figura 5B).
   2. Un cromatogramma ambiguo potrebbe derivare dalla presenza di picchi colorati diversi nella stessa posizione. Uno degli errori più comuni è la presenza di due picchi colorati diversi nella stessa posizione e l'assegnazione impropria delle basi da parte del software di sequenziamento (Figura 5C). Correggere manualmente eventuali nucleotidi assegnati in modo errato e modificarli nel file di testo.
   3. I cromatogrammi a bassa risoluzione possono provocare "picchi ampi" che spesso causano un conteggio errate dei nucleotidi in queste regioni (Figura 5D). Questo errore è difficile da correggere e pertanto eventuali discrepanze nell'ulteriore fase di allineamento non devono essere considerate affidabili.
   4. La scarsa qualità di lettura del cromatogramma e la presenza di picchi multipli sono comunemente osservate alle estremità 5' e 3' della sequenza. Alcuni software sequencer rimuovono automaticamente questi frammenti di bassa qualità (Figura 5E) e i nucleotidi non sono inclusi nel file di testo. Se la sequenza non è stata troncata automaticamente, determinare i frammenti di bassa qualità(ad esempio segnale debole, picchi sovrapposti, perdita di risoluzione) alle estremità e rimuovere le rispettive basi dal file di testo.

Figura 5: Esempi di risoluzione dei problemi relativi al sequenziamento del DNA. A) Un esempio di sequenza cromatografica di qualità (picchi uniformemente distanziati e non ambigui). B) Sequenza di scarsa qualità che di solito si verifica all'inizio del cromatogramma. L'area della zona grigia è considerata di bassa qualità e rimossa automaticamente dal software di sequenziamento. Più basi possono essere tagliate manualmente. C) Presenza di picchi doppi (indicati da frecce). Un nucleotide indicato dalla freccia rossa è stato letto dal sequencer come "T" (picco rosso), ma il picco blu è più forte e può anche essere interpretato come "C". D) I picchi sovrapposti indicano la contaminazione da DNA(cioè più di un modello). E) Perdita di risoluzione e i cosiddetti "picchi larghi" (contrassegnati da rettangolo) che impediscono una chiamata di base affidabile. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

3. Ripetere 3.1 e 3.2 per il primer inverso.
4. Infine, assemblate le sequenze avanti e indietro in un'unica sequenza contigua. Una buona sequenza produce una sequenza fino a 1100 bp. Considerando che il prodotto PCR è lungo ~ 1500 bp, le sequenze ottenute utilizzando primer avanti e indietro dovrebbero parzialmente sovrapporsi.
   1. Unisci le due sequenze usando il programma di assemblaggio della sequenza del DNA, ad esempio uno strumento gratuito come CAP3 (http://doua.prabi.fr/software/cap3) (15).
   2. Inserire le due sequenze in formato FASTA nella casella indicata. Fai clic sul pulsante "Invia" e attendi che i risultati restituiscano.
   3. Per visualizzare la sequenza assemblata premere "Contigs" nella scheda dei risultati. Per visualizzare i dettagli dell'allineamento premere "Dettagli assemblaggio".
      Nota 1: Se il software CAP3 viene utilizzato per l'assemblaggio contig, non è necessario convertire la sequenza di primer inversa in reverse-complementary; tuttavia, questo passaggio potrebbe essere necessario se viene utilizzato un altro programma.
      Nota 2: Il formato FASTA è un formato basato su testo per rappresentare la sequenza nucleotidica. La prima riga (la riga di descrizione) in un file FASTA inizia con un simbolo ">" seguito dal nome o da un identificatore univoco della sequenza. Segue la linea di descrizione la sequenza nucleotidica. Incollate le sequenze nel seguente formato:
      
      >sequence_frw_primer
      Incolla qui la sequenza dal file di testo
      >sequence_rvs_primer
      Incolla qui la sequenza dal file di testo
5. Effettuare una ricerca nel database visitando il sito Web per lo strumento di ricerca di allineamento locale di base (BLAST; https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi).
   1. Selezionare lo strumento "Nucleotide BLAST" per confrontare la sequenza con il database.
   2. Inserisci la tua sequenza (il contig assemblato in 3.5) nella casella di testo "Sequenza di query", quindi seleziona il database "Sequenze di rRNA 16S (batteri e Archea)" nel menu a scorrimento verso il basso.
   3. Premere il pulsante "BLAST" nella parte inferiore della pagina. Verranno restituite le sequenze più simili. Un risultato BLAST di esempio è mostrato nella Figura 6. Nell'esperimento presentato il primo colpo è il ceppo B. subtilis 168, che mostra l'identità al 100% con la sequenza disponibile nel database BLAST.
   4. Se il primo colpo non mostra l'identità al 100%, vai all'allineamento e controlla le mancate corrispondenze. Facendo clic sul colpo in alto, verrai indirizzato ai dettagli dell'allineamento. I nucleotidi allineati saranno uniti da brevi linee verticali mentre i nucleotidi non corrispondenti hanno uno spazio tra di loro. Tornate al cromatogramma che avete ricevuto dalla società di sequenziamento e rivedete la sequenza ancora una volta con l'attenzione sulla regione non corrispondente. Correggere la sequenza se vengono trovati altri errori. Eseguire nuovamente BLAST utilizzando la sequenza corretta.

Figura 6: Esempio del risultato del nucleotide BLAST. La sequenza del gene rRNA 16S da coltura pura di B. subtilis 168 è stata utilizzata come sequenza di query. Il top hit mostra l'identità al 100% (sottolineata) al ceppo B. subtilis 168, come previsto. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.