Curve di crescita: generazione di curve di crescita utilizzando le unità formanti colonia e la misurazione della densità ottica

I batteri si riproducono attraverso un processo chiamato divisione cellulare, che si traduce in due cellule figlie identiche. Se le condizioni di crescita sono favorevoli, le popolazioni batteriche cresceranno in modo esponenziale.

Le curve di crescita batterica tracciano la quantità di batteri in una coltura in funzione del tempo. Una tipica curva di crescita progredisce attraverso quattro fasi: fase di ritardo, fase esponenziale, fase stazionaria e fase di morte. La fase di ritardo è il tempo necessario ai batteri per raggiungere uno stato in cui possono crescere e dividersi rapidamente. Successivamente, i batteri passano alla fase esponenziale, caratterizzata da una rapida crescita e divisione cellulare. Il tasso di crescita esponenziale della coltura batterica durante questa fase può essere espresso come il tempo di raddoppio, il tasso più veloce con cui i batteri possono riprodursi in condizioni specifiche. Segue la fase stazionaria, in cui la crescita delle cellule batteriche si stabilizza e i tassi di crescita e morte si uniformano a causa dell'esaurimento dei nutrienti ambientali. Infine, i batteri entrano nella fase di morte. È qui che la crescita batterica diminuisce bruscamente e una grave deplezione dei nutrienti porta alla lisi delle cellule.

Due tecniche possono essere utilizzate per quantificare la quantità di batteri presenti in una coltura e tracciare una curva di crescita. Il primo di questi è tramite unità formanti colonie, o CFU. Per ottenere le CFU viene eseguita una serie da una a dieci di nove diluizioni a intervalli regolari. La prima di queste diluizioni, quella negativa in questo esempio, contiene 9 ml di PBS e 1 ml di coltura batterica. Il risultato è un fattore di diluizione 1:10. Quindi, 1 ml di questa soluzione viene trasferito alla provetta successiva, negativa due, ottenendo un fattore di diluizione 1:100. Questo processo continua attraverso l'ultimo tubo, negativo nove, con un fattore di diluizione finale di 1:1 miliardi. Successivamente, vengono placcati 100 microlitri di ciascuna diluizione. Le piastre vengono quindi incubate e le colonie clonali vengono contate. La piastra di diluizione per un dato punto temporale che cresce tra 30 e 300 colonie viene utilizzata per calcolare le CFU per millilitro per quel punto temporale.

Il secondo metodo comune per misurare la concentrazione batterica è la densità ottica. La densità ottica di una coltura può essere misurata istantaneamente, in relazione a un bianco di supporto, con uno spettrofotometro. In genere per queste misurazioni viene utilizzata una lunghezza d'onda di 600 nanometri, nota anche come OD600, che aumenta all'aumentare della densità cellulare. Sebbene la densità ottica sia meno precisa delle CFU, è conveniente perché può essere ottenuta istantaneamente e richiede relativamente pochi reagenti. Entrambe le tecniche possono essere utilizzate insieme per creare una curva standard che si avvicina in modo più accurato alla conta delle cellule batteriche di una coltura. In questo video imparerai come ottenere CFU e misurazioni OD600 da diluizioni seriali temporizzate di E. coli. Quindi, due curve di crescita utilizzando rispettivamente le misure CFU e OD600 verranno tracciate prima di essere correlate da una curva standard.

Quando si lavora con i batteri, è importante utilizzare dispositivi di protezione individuale appropriati come camice da laboratorio e guanti e osservare una corretta tecnica asettica.

Successivamente, sterilizzare la stazione di lavoro con etanolo al 70%. Per prima cosa, preparare il brodo LB e il terreno di coltura agar solido LB in bottiglie autoclavabili separate. Dopo aver chiuso parzialmente i tappi delle bottiglie, sterilizzare il terreno in autoclave impostato a 121 gradi Celsius per 35 minuti. Quindi, lasciare raffreddare il terreno di coltura agar a bagnomaria impostato a 50 gradi Celsius per 30 minuti. Una volta raffreddata, versare da 20 a 25 ml in ciascuna capsula di Petri. Dopodiché, lasciare riposare le piastre per 24 ore a temperatura ambiente.

Per preparare gli isolati della singola colonia che verranno successivamente utilizzati per produrre una coltura batterica liquida, utilizzare brodo precedentemente congelato e un'adeguata tecnica di striatura per striare E. coli per l'isolamento su agar LB. Incubare la capsula a 37 gradi Celsius durante la notte. Successivamente, raffreddare un anello di inoculazione sterilizzato a fiamma sull'agar prima di selezionare una singola colonia dalla piastra striata. Inoculare 4 mL di terreno liquido in una provetta da 15 mL. Quindi, far crescere l'E. coli a 37 gradi Celsius durante la notte con agitazione a 210 giri/min.

Per impostare il volume 1:1000 di coltura batterica che verrà utilizzato nella curva di crescita, procurarsi prima un pallone di Erlenmeyer da 500 ml sterilizzato in autoclave. Quindi, utilizzare una pipetta sierologica da 50 ml per trasferire 100 ml di terreno sterile nel pallone. Quindi, etichettare nove provette da 15 ml consecutivamente da una a nove. Questi numeri corrispondono al fattore di diluizione che verrà utilizzato per calcolare l'unità formante la colonia, o CFU. Quindi, aggiungere 9 ml di PBS 1X a ciascuna provetta. Successivamente, etichettare le piastre di agar preparate con i punti temporali e i fattori di diluizione corrispondenti che verranno coltivati. In questo esempio con E. coli, dopo il punto temporale iniziale, i punti temporali vengono presi una volta ogni ora. Utilizzando la coltura liquida di E. coli precedentemente preparata durante la notte, inoculare il terreno nell'autoclave Pallone di Erlenmeyer da 500 ml con volume di coltura 1:1000. Agitare il terreno per distribuire uniformemente i batteri.

Dopo aver spento uno spettrofotometro, pulire la cuvetta con un panno privo di lanugine. Quindi, erogare 1 mL di coltura nella cuvetta e posizionarla nello spettrofotometro per ottenere la densità ottica della coltura al punto zero temporale. Quindi, far crescere l'E. coli a 37 gradi Celsius agitando a 210 giri/min. Ad ogni punto temporale dopo punto zero, prelevare un altro 1 mL di coltura batterica dal pallone e ripetere la misurazione della densità ottica. Se la lettura della densità ottica è maggiore di 1,0, diluire 100 microlitri di coltura batterica con 900 microlitri di terreno fresco e quindi misurare nuovamente la densità ottica. Questo valore può essere moltiplicato per 10 per la misurazione OD 600.

Per ottenere l'unità di misura formante colonia per ogni punto temporale, prelevare un ulteriore 1 mL di coltura batterica dal pallone in ogni punto temporale. Erogare la coltura batterica in quella negativa e frullare a vortice. Quindi, eseguire la serie di diluizione trasferendo prima 1 mL dalla provetta negativa a quella negativa e a vortice per mescolare. Trasferire 1 mL dalla provetta negativa a due nella provetta negativa a tre e agitare per mescolare. Continuare questo trasferimento seriale lungo tutte le provette di diluizione fino alla provetta negativa a nove. Erogare 100 microlitri di sospensione cellulare sulla piastra etichettata in modo corrispondente per ogni diluizione. Per ogni diluizione, sterilizzare uno spandiconcime in etanolo, passarlo attraverso la fiamma di un bruciatore Bunsen e raffreddarlo toccando la superficie dell'agar lontano dall'inoculo. Quindi, utilizzare lo spandiconcime per stendere la sospensione cellulare fino a quando la superficie della piastra di agar non diventa asciutta. Incubare le piastre capovolte a 37 gradi Celsius. Una volta che le colonie visibili si presentano, contare il numero di colonie batteriche su ogni piastra. Registrare questi valori e i fattori di diluizione associati per ciascuna piastra in ogni momento.

Per creare una curva di crescita OD 600, dopo essersi assicurati che tutti i punti dati siano stati inseriti correttamente in una tabella, selezionare tutti i punti temporali e i dati corrispondenti. Per generare un grafico della curva di crescita delle unità formanti colonie, scegliere la piastra di diluizione in cui il conteggio delle colonie è compreso nell'intervallo da 30 a 300 batteri per ogni punto temporale. Moltiplica il numero di colonie per il fattore di diluizione e poi per dieci. Questo perché la diffusione di 100 microlitri è considerata una diluizione aggiuntiva 1:10 quando si calcolano le unità formanti colonie per millilitro. Successivamente, traccia le unità di formazione della colonia rispetto al tempo su una scala semi-logaritmica.

Questi grafici prodotti con misure di OD 600 e CFU, rispettivamente, possono fornire preziose informazioni sulla cinetica di crescita di E. coli. La densità ottica e le unità di formazione delle colonie possono essere correlate, in modo che le CFU per millilitro possano essere stimate da misurazioni OD 600, risparmiando tempo e materiali in esperimenti futuri.

Per fare ciò, tracciare le unità formanti colonie rispetto alla densità ottica su una scala lineare per letture OD 600 inferiori o uguali a 1. 0. Successivamente, genera una linea di tendenza di regressione lineare in formato Y = MX + B, dove M è la pendenza e B è l'intercetta y. Fare clic con il pulsante destro del mouse sui punti dati e selezionare Aggiungi linea di tendenza e lineare. Quindi, seleziona la casella per visualizzare l'equazione sul grafico e visualizzare il valore R al quadrato sul grafico. Il valore R al quadrato è la misura statistica della corrispondenza dei dati con la linea di regressione adattata. In questo esempio, i primi 6 punti temporali sono tracciati con OD 600 sull'asse x e CFU per millilitro sull'asse y. In esperimenti futuri con le stesse condizioni di crescita, questi valori di pendenza e intercetta y possono essere inseriti in questa equazione per stimare le CFU da letture OD 600. Quindi, guarda il grafico della curva di crescita delle unità di formazione delle colonie. Durante la fase esponenziale, identificare due punti temporali con la pendenza più ripida tra di loro. Per calcolare il tempo di raddoppio, calcolare prima la variazione di tempo tra i punti temporali selezionati. Quindi, calcola il cambiamento nelle generazioni utilizzando l'equazione mostrata qui. Qui, la b minuscola è il numero di batteri al punto temporale tre e la B maiuscola è il numero di batteri al punto temporale due. Infine, dividi il cambiamento nel tempo per il cambiamento nelle generazioni. In questo esempio, il tempo di raddoppio è 0. 26 ore o 15 minuti e 19 secondi. Il confronto dei tempi di raddoppio tra diversi trattamenti sperimentali ci permette di identificare le migliori condizioni di crescita per una determinata specie batterica. Pertanto, il trattamento con il tempo di raddoppio più basso sarà il più ottimale tra le condizioni testate.