Curve di crescita: generazione di curve di crescita utilizzando le unità formanti colonia e la misurazione della densità ottica

1. Configurazione

1. Materiali di laboratorio richiesti: mezzi liquidi, mezzi di agar solidificati, palloni Erlenmeyer, provette da 15 ml, soluzione salina tamponata con fosfato (PBS), diffusore di cellule batteriche, etanolo al 70% e uno spettrofotometro. Tutte le soluzioni e i bicchieri devono essere sterilizzati prima dell'uso.
2. Preparare la postazione di lavoro sterilizzando con etanolo al 70%. Lavora vicino a un bruciatore Bunsen per prevenire la contaminazione dei supporti.
3. Quando si lavora con i batteri, devono essere utilizzati adeguati dispositivi di protezione individuale e tecnica asettica. Un cappotto da laboratorio e guanti sono necessari quando si lavora con colture batteriche.
4. Ricette per tamponi, soluzioni e reagenti
   1. Soluzione salina tamponata con fosfato (PBS) (8).
   2. Brodo Luria-Bertani (LB) (9).

2. Protocollo

1. Preparazione dei media
   1. Identificare il mezzo di crescita con cui far crescere i batteri e preparare sia il brodo liquido che il mezzo di agar solido (1,5% p/v agar) in flaconi autoclavabili separati. Qui, il brodo LB e l'agar LB sono stati preparati per la crescita di Escherichia coli.
   2. Sterilizzare il materiale con un tappo semisertato in autoclave impostato a 121 °C per 35 min.
   3. Per i mezzi di agar, dopo l'autoclave, porre a bagnomaria impostato a 50 °C per 30 minuti per raffreddare. Una volta raffreddato, versare 20-25 mL di agar media in piastre di Petri circolari 100x15mm. Lasciare impostare le piastre 24 ore a temperatura ambiente prima dell'uso.
2. Preparazione iniziale dei batteri
   1. Da stock congelati, strisciare batteri per l'isolamento su agar media selezionati per ottenere isolati di singole colonie. Incubare in condizioni di crescita consentite per i batteri scelti. Qui, E. coli viene striato su LB agar e viene incubato a 37 ° C durante la notte (16-18h).
   2. Utilizzando un anello di inoculazione sterile, selezionare una singola colonia dalla piastra striata e inoculare 4 mL di liquido in una provetta da 15 ml e crescere in condizioni consentite per i batteri scelti. Qui, E. coli viene coltivato a 37 °C con agitazione a 210 giri / min durante la notte (16-18h).
3. Impostazione della curva di crescita
   1. Preparazione del pallone di crescita
      1. Palloni Erlenmeyer di dimensioni adeguate per autoclave. In genere, viene utilizzato un rapporto 1:5 tra il supporto e il volume totale del pallone. Qui, 100 mL LB media viene utilizzato in un pallone da 500 ml.
      2. Utilizzando una pipetta sierologica, trasferire il mezzo sterile al pallone Erlenmeyer.
   2. Preparazione della serie di diluizione
      1. Etichetta 15 mL di provette: -1, -2, -3, -4, -5, -6, -7, -8 e -9, distribuendo 9 ml di PBS in ciascuna. Questi numeri corrispondono al fattore di diluizione utilizzato per calcolare CFU/mL. È necessario un nuovo set di tubi per ogni timepoint di raccolta. (Figura 2)
   3. Preparazione del piatto di agar
      1. Targhette etichettanti con tempo di raccolta e fattore di diluizione. Per ogni timepoint ci sarà una piastra per ogni diluizione.
4. Protocollo della curva di crescita
   1. Inoculazione dei media
      1. Utilizzando la coltura liquida durante la notte preparata come parte del punto 2.2.2, inoculare il mezzo del pallone con un volume di coltura di 1:1000. Qui, 100 μL di coltura liquida durante la notte vengono aggiunti a 100 mL di liquido LB.
      2. Ruotare i media per distribuire uniformemente i batteri.
   2. Raccolta Timepoint
      1. Impostazione delle condizioni di crescita
         1. Posizionare il pallone in condizioni di crescita sperimentali scelte per i batteri dati. I timepoint dovrebbero essere presi frequentemente per i batteri a crescita rapida e possono essere presi a intervalli più lunghi per i batteri a crescita lenta. Qui, E. coli viene coltivato a 37 ° C con agitazione a 210 giri al minuto (rpm) e timepoint presi ogni 1 ora.
      2. Misurazione della densità ottica (OD600)
         1. In ogni punto temporale, incluso il timepoint di partenza (t = 0), prelevare 1 mL di coltura batterica ed erogare in una cuvetta spettrofotometrica.
         2. Pulire la cuvetta e registrare la densità ottica a una lunghezza d'onda di 600 nm. Se la lettura della densità ottica è maggiore di 1,0, diluire 100 μL di coltura 1:10 con 900 μL di materiale fresco, registrare la densità ottica e moltiplicare questo valore per 10 per la misurazione OD600.
      3. Misurazione dell'unità formante colonie (CFU/mL)
         1. In ogni momento, prelevare 1 mL di coltura batterica ed erogare nella provetta di vetro -1 contenente 9 mL di PBS.
         2. Per la serie di diluizione, trasferire in serie 1 mL dal tubo -1 lungo tutti i tubi di diluizione al -9, vorticosamente dopo ogni trasferimento. (Figura 2)
         3. Per ogni diluizione, erogare 100 μL di sospensione cellulare alla piastra di agar del supporto solido marcata in modo corrispondente. (Figura 2)
         4. Utilizzando uno spandiconcime che è stato sterilizzato in etanolo, passato attraverso una fiamma del bruciatore Bunsen e raffreddato toccando la superficie dell'agar, distribuire i 100 μL di sospensione cellulare fino a quando la superficie della piastra di agar diventa asciutta.
         5. Incubare le piastre di diffusione capovolte a una temperatura che supporti la crescita dei batteri. Qui, E. coli viene incubato a 37°C.
         6. Dopo l'incubazione, una volta che sorgono colonie visibili, contare il numero di colonie batteriche su ciascuna piastra e registrare questi valori insieme al fattore di diluizione associato per tutte le piastre in ogni punto temporale.

3. Analisi dei dati e risultati

1. Grafico della curva di crescita della densità ottica (OD600)
   1. Traccia la densità ottica (OD600) rispetto al tempo su una scala semi-logaritmo. (Figura 3)
2. Grafico della curva di crescita dell'unità formante colonia (CFU/mL)
   1. Per ogni punto temporale, scegli la piastra di diluizione in cui i conteggi delle colonie rientravano nell'intervallo di 30-300 batteri. Moltiplicare il numero di conteggi delle colonie per il fattore di diluizione e quindi per 10 poiché la diffusione di 100 μL è considerata un'ulteriore diluizione 1:10 nel calcolo di CFU/ mL.
      
   2. Traccia le unità che formano la colonia rispetto al tempo su una scala semi-logaritmo. (Figura 4)
3. Correlazione tra densità ottica e unità formanti colonie
   1. Tracciare le unità formanti la colonia rispetto alla densità ottica su una scala lineare per letture OD600 inferiori o uguali a 1,0 OD600 poiché la relazione tra OD600 e CFU / mL è meno accurata oltre 1,0 OD600. Qui vengono tracciati i primi sei punti temporali. (Figura 5)
   2. Generare una linea di tendenza di regressione lineare che visualizza l'equazione e il valore R^2.
4. Determinazione del tempo di raddoppio dei batteri
   1. Utilizzando il grafico della curva di crescita dell'unità di formazione della colonia, durante la fase esponenziale, identificare due punti sul grafico con la pendenza più ripida tra loro per calcolare il tempo di raddoppio.
   2. Calcolo del tempo di raddoppio
      1. 
      2. ΔTime = t₂ - t₁, dove t₁ = Timepoint 1 e t₂ = Timepoint 2
      3. , dove b = numero di batteri a t₂, B = numero di batteri a t₁e n = numero di generazioni. Derivato da: .
      4. Calcola il tempo di raddoppio utilizzando: