Test di suscettibilità agli antibiotici: test dell'epsilometro per determinare i valori MIC di due antibiotici e valutare la sinergia antibiotica

1. Test epsilometrici (E-test)

1. Configurazione
   1. Indossare guanti e un cappotto da laboratorio
   2. Prepara lo spazio di lavoro sterilizzandolo con etanolo al 70%
   3. Raccogli le piastre di agar Mueller-Hinton (piastre MHA)
2. Preparazione di uno standard di torbidità McFarland n. 0.5
   1. Preparare una soluzione all'1% di cloruro di bario (BaCl_2):
      Aggiungere 1 grammo di cloruro di bario anidro (BaCl₂) in 100 ml di acqua distillata. Vortice bene.
   2. Preparare una soluzione all'1% di acido solforico (H₂SO₄):
      Aggiungere 1 mL di H₂SO₄ concentrato in 99 mL di acqua distillata. Vortice bene.
   3. Preparare uno standard di torbidità McFarland n. 0.5:
      50 μL di soluzione di BaCl₂ in 5 mL di soluzione_all'1%di H 2 SO_4. Vortice la soluzione bene per ottenere una sospensione torbida.
   4. Mantenere lo standard di torbidità McFarland n. 0,5 in un tubo coperto di lamina. Conservare a 25°C per un massimo di 6 mesi. Vortice bene ad una soluzione omogenea prima dell'uso.
3. Preparazione delle piastre MHA
   1. Raschiare i batteri del gruppo G di streptococco dalla piastra di agar del sangue usando un anello sterile. Mescolare in 1 ml di soluzione salina e vortice in una sospensione dei batteri.
   2. Confronta la sospensione con uno standard McFarland n. 0.5 per ottenere la stessa torbidità in modo da avere la stessa dimensione dell'inoculo durante gli esperimenti. Regolare la concentrazione utilizzando soluzione salina o batteri aggiuntivi.
   3. Inoculare le piastre MHA utilizzando un applicatore sterile con punta in cotone. Tamponare delicatamente la piastra per coprire la superficie. Procedere con uno dei tre metodi descritti di seguito (1.4-1.6).
4. Singolo test di resistenza agli antibiotici. Streptococco gruppo G, resistenza alla penicillina G o alla gentamicina
   1. Posizionare una striscia reattiva E (penicillina G o gentamicina) al centro della piastra MHA (Figura 1 A, B).
   2. Incubare per 18-20 ore, 37°C.
   3. Leggi i risultati. Il MIC è misurato come la zona di inibizione che interseca la striscia reattiva antibiotica graduata (Figura 1 C,D).

Figura 1: Singolo E-test. Posizionamento di una striscia reattiva E di A) penicillina G e B) gentamicina su una piastra di agar Mueller Hinton ricoperta da colonie batteriche di streptococchi di gruppo G prima(A e B)e dopo(C e D)incubazione notturna a 37°C 5% CO_2. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

5. Approccio incrociato di test sinergici. Streptococco gruppo G, resistenza alla penicillina G e alla gentamicina.
   1. Posizionare due strisce reattive E con diversi antibiotici (ad es. penicillina G e gentamicina) sulla piastra MHA inoculata in una formazione incrociata.
      1. Per i risultati più accurati, mirare a posizionare la croce con un angolo di circa 90 ° all'intersezione tra le scale ai loro valori MIC, precedentemente determinati su un singolo test di resistenza agli antibiotici (Figura 2 A).
      2. Si noti che una volta che le strisce sono posizionate sulla piastra di agar, non devono essere spostate, poiché alcuni antibiotici potrebbero già essere stati assorbiti dalla piastra. Pertanto, è più appropriato mantenere le strisce ad un angolo leggermente errato (ad esempio 85°) e fino a 1-2 mm dal valore MIC effettivo. Si consiglia di eseguire l'esperimento in triplice copia per ridurre questo problema.
   2. Incubare per 18-20 ore, 37°C.
   3. Leggi i risultati. La MIC viene misurata come la zona di inibizione che interseca la striscia reattiva antibiotica graduata su ciascuna rispettiva striscia reattiva E (Figura 2 B).
   4. Utilizzare la formula per la concentrazione inibitoria frazionaria (FIC) (Equazione 1) per determinare la sinergia.

Figura 2: Rilevamento sinergico - test incrociato. Risultati dei test di sinergia antimicrobica di MIC di penicillina G e gentamicina su Streptococco gruppo G prima (A) e dopo (B) incubazione durante la notte a 37°C 5% CO₂. Si forma un angolo di 90° tra i due singoli valori MIC (penicillina G: 0,094 μg/mL, gentamicina: 8 μg/mL). Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

6. Synergy testing approccio non cross. Streptococco gruppo G, resistenza alla penicillina G e alla gentamicina.
   1. Posizionare la striscia reattiva E al centro della piastra MHA (Figura 3 A,D).
   2. Contrassegnare la posizione in cui si trovava il valore MIC determinato in precedenza su ciascuna striscia.
   3. Incubare per 1 ora a temperatura ambiente.
   4. Scartare la striscia reattiva E per ogni piastra MHA (Figura 3 B,E).
   5. Posizionare la seconda striscia reattiva E (contenente un antibiotico diverso) rispettivamente sull'area della striscia rimossa in precedenza in modo che i loro valori MIC corrispondano al segno e siano allineati.
   6. Incubare per 18-20 ore, 37°C.
   7. Leggi i risultati. Il MIC è misurato come la zona di inibizione che interseca la striscia reattiva antibiotica graduata su ciascuna rispettiva striscia reattiva E (Figura 3 C, F).
   8. Per determinare la sinergia, viene utilizzata la formula per la concentrazione inibitoria frazionaria (FIC) (Equazione 1).

Figura 3: Rilevamento del sinergismo - test non incrociato. Risultati dei test di sinergia antimicrobica della MIC della penicillina G e della gentamicina sul gruppo streptococco G. A) Striscia di gentamicina (8 μg/mL centrata) sopra i batteri del gruppo G dello streptococco, B) Rimozione della striscia di gentamicina, C) Striscia combinata di gentamicina / penicillina G (0,094 μg / mL centrata) sopra i batteri del gruppo G dello streptococco, D) Striscia G di penicillina G (0,094 μg / mL centrata), E) Rimozione della striscia G di penicillina, F) Striscia combinata di penicillina G / gentamicina (8 μg / mL centrata) sopra i batteri del gruppo G dello streptococco. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

2. Test del brodo

1. Configurazione
   1. Indossare guanti e un cappotto da laboratorio
   2. Prepara lo spazio di lavoro sterilizzandolo con etanolo al 70%
   3. Raccogliere 15mL di brodo MH con il 50% di sangue di cavallo lisato e 20 mg / mL di β-NAD (MH-F)
2. (Facoltativo) Eseguire un E-test [Protocollo 1] per determinare il MIC su supporto solido
   1. Sebbene facoltative, tali conoscenze consentiranno una migliore progettazione sperimentale (ad esempio, le concentrazioni di antibiotici aggiunti possono essere progettate per circondare il valore MIC determinato dalla piastra), migliorando le possibilità di un esperimento di successo.
3. Preparazione di un inoculo batterico. Come detto sopra, la concentrazione batterica può essere stimata mediante misurazioni OD nm o standard di torbidità McFarland
   1. Metodo OD600 nm
      1. Ottenere una sospensione batterica con una concentrazione batterica stabilita
      2. Diluire la coltura in brodo MH-F per ottenere un OD600 di 0,003
   2. Metodo di torbidità di McFarland
      1. Mettere 15 ml di brodo MH-F in un tubo sterile.
      2. Inoculare il brodo MH-F con batteri (da un piatto) a un livello di McFarland. Vortice la soluzione vigorosamente. Versare la soluzione in una capsula di Petri sterile.
4. Preparazione di antibiotici
   1. Determinare la concentrazione di antibiotici desiderata
      1. Identificare il valore MIC dal test E- (es. 0,125 μg/mL per la penicillina G e 8 μg/mL per la gentamicina)
      2. Moltiplicare il valore MIC della piastra di agar per 2⁴-2⁷, corrispondente a quattro-sette diluizioni seriali 2x. Questa sarà la concentrazione iniziale di antibiotici. (es. per la penicillina G, sette diluizioni seriali 2x: 0,125 μg/mL x^{2 7} = 16 μg/mL; per la gentamicina, quattro diluizioni seriali 2x 8 μg/mL x 2⁴ = 128 μg/mL
      3. Moltiplicare il valore di partenza desiderato 100x per determinare generare una concentrazione stock degli antibiotici (es. scorte di 1,6 mg/ml di penicillina G e 12,8 mg/ml di gentamicina)
   2. Preparare una concentrazione di stock di antibiotici 100 volte di conseguenza
      1. Sciogliere gli antibiotici in 10 ml di acqua autoclavata e vortice per generare una soluzione madre (es. 16 mg di penicillina G e 128 mg di gentamicina per creare le scorte di cui sopra)
5. Aggiungi batteri ai pozzi delle micropiasche
   1. Aliquota 200 μl DI BRODO MH-F contenente inoculo di batteri ai pozzetti nelle prime 3 file di una piastra di microtitolato a 96 pozzetti per un esperimento di triplice copia.
6. Aggiungere antibiotici ai pozzi delle micropiasse
   1. Aggiungere 200 μL di brodo MH-F extra con batteri alla prima colonna di pozzetti (A1, B1, C1) per portare il volume totale a 400 μL.
   2. Aggiungere 4 μL della concentrazione stock di antibiotici alla prima colonna di pozzi. Poiché il campione contiene 400 μL, si otterrà una diluizione 100x degli antibiotici.
   3. Generare una diluizione seriale 2x trasferendo 200 μL di batteri/antibiotici da A1 ad A2, fino ad A11. Pipettare vigorosamente tra le diluizioni. Ripetere il passaggio per righe aggiuntive.
   4. Rimuovere 200 μL dalla colonna 11 in modo che il volume finale in tutti i pozzi sia di 200 μL.
   5. Lasciare l'ultima colonna (A12, B12, C12) senza antibiotici, come controlli.
7. Determinare i valori MIC
   1. Incubare la piastra di microtitoli a 96 pozzi per 24 ore a 37°C senza agitare.
   2. Il valore MIC è definito come l'ultimo pozzo della serie di diluizione che non presenta alcuna crescita visibile di batteri (Figura 4). Questo valore, tuttavia, può essere considerato attendibile solo se la dimensione dell'inoculo originale era corretta.

Figura 4: Determinazione del MIC mediante diluizione del brodo. MIC è qui definito come l'ultimo pozzo che mostra chiarezza (nessuna crescita di batteri) prima che cambi torbidità. Le righe sono duplicati del valore MIC della penicillina G e le righe sono duplicati del valore MIC della gentamicina, entrambi rispetto a un isolato del gruppo streptococco G. A) risultato sperimentale effettivo, B) interpretazione schematica dei valori da A (grigio = nessuna crescita; bianco = crescita). Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figura 5: Procedura schematica delle serie di diluizione per contare la concentrazione di batteri originali. Le diluizioni sono state eseguite come descritto (20 μL diluiti in 180 μL per una serie di diluizione 10x), e quindi 10 μL dalle file A-H sono placcati su due piastre di agar del sangue separate come indicato. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

8. Determinare la dimensione dell'inoculo originale
   NOTA BENE: I saggi di microbroto sono altamente sensibili per le dimensioni originali dell'inoculo utilizzate. Una dimensione eccessiva dell'inoculo darà un risultato falso positivo, poiché gli antibiotici aggiunti non saranno più in grado di inibire la crescita a quel rapporto. Pertanto, è fondamentale verificare quanti batteri sono stati aggiunti ai microwell. Mentre i dati non saranno disponibili al punto dell'esperimento (a causa della necessità di incubazione di 24 ore) serviranno come controllo. Se il numero di batteri aggiunti rientra nell'intervallo di concentrazione dichiarato, è possibile fidarsi dei valori MIC. Se l'inoculo era troppo alto o troppo basso, l'esperimento deve essere ripetuto.
   1. Diluire in serie i batteri
      1. Preparare una piastra di microtitolo a 96 pozzetti per diluire la concentrazione batterica originale al fine di determinare la dimensione dell'inoculo. L'optimum è un volume di 200 μL con 10^5-6 batteri. Per eseguire le diluizioni, prima aliquota 180 μL PBS sterile a ciascun pozzo in B-H (in triplice 1-3).
      2. Quindi, aggiungere 100 μl di soluzione batterica ad A (in triplice 1-3).
      3. Generare una diluizione seriale 10x (in triplice) trasferendo 20 μl di batteri da A a B, pipetta vigorosamente. Ripetere i passaggi per C-H.
   2. Placcare le diluizioni batteriche per la determinazione delle dimensioni dell'inoculo
      1. Contrassegnare le piastre di agar del sangue secondo la Figura 5.
      2. Trasferire 10 μL dalla diluizione seriale alla piastra secondo la Figura 5.
      3. Incubare la piastra a 37°C per 20-24 ore.
   3. Determinare la dimensione dell'inoculo batterico
      1. Contare i numeri batterici in punti all'interno di 5-50 colonie (Figura 6).
      2. Calcolare la dimensione iniziale dell'inoculo calcolando la media dei campioni triplicati, moltiplicare per il fattore di diluizione (ad esempio 10x per i campioni B, 100x per i campioni C, 1000x per i campioni D, ecc.) e quindi per 100 per compensare il volume di spotting di 10 μL, con conseguente dimensione dell'inoculo in cfu/mL. Se l'inoculo è entro 10^5-6 cfu / mL i dati MIC possono essere considerati attendibili.

Figura 6: Determinazione della dimensione dell'inoculo. I batteri inoculati secondo la figura 5 sono stati incubati per 20-24 ore a 37°C e poi contati. La riga D ha un buon numero di colonie da contare (ad esempio 5-50). I campioni in A non sono diluiti, B è diluito 10x, C è diluito 100x e D è diluito 1000x, e solo 10 μL è placcato in ogni punto. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.