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Fonte: Anna Bläckberg1, Rolf Lood1
1 Dipartimento di Scienze Cliniche Lund, Divisione di Medicina delle Infezioni, Centro Biomedico, Università di Lund, 221 00 Lund Svezia
La conoscenza delle interazioni tra antibiotici e batteri è importante per capire come i microbi evolvono la resistenza agli antibiotici. Nel 1928, Alexander Fleming scoprì la penicillina, un antibiotico che esercita la sua funzione antibatterica interferendo con la rigenerazione della parete cellulare (1). Successivamente sono stati scoperti altri antibiotici con diversi meccanismi d'azione, tra cui farmaci che inibiscono la replicazione del DNA e la traduzione proteica nei batteri; tuttavia, negli ultimi anni non sono stati sviluppati nuovi antibiotici. La resistenza agli antibiotici attuali è in aumento, con conseguenti gravi malattie infettive che non possono essere trattate efficacemente (2). Qui, descriviamo diversi metodi per valutare la resistenza agli antibiotici nelle popolazioni batteriche. Ognuno di questi metodi funziona, indipendentemente dal meccanismo d'azione degli antibiotici utilizzati, perché la morte batterica è il risultato misurato. La resistenza agli antibiotici non è solo rapidamente diffusa in modo specifico attraverso le impostazioni ospedaliere, ma anche in tutta la società. Al fine di studiare tali mezzi di resistenza, sono stati sviluppati diversi metodi, tra cui il test Epsilometro (E-test) e il test di diluizione del brodo (3).
L'E-test è un metodo consolidato ed è uno strumento economico che quantifica i dati della concentrazione minima inibitoria (MIC), la concentrazione più bassa di un antimicrobico che inibisce la crescita visibile di un microrganismo. A seconda del ceppo batterico e degli antibiotici utilizzati, il valore del MIC può variare tra sub μg/mL e >1000 μg/mL (4). L'E-test viene eseguito utilizzando una striscia di plastica contenente un gradiente antibiotico predefinito, che è impresso con la scala di lettura MIC in μg / mL. Questa striscia viene trasferita direttamente sulla matrice di agar quando viene applicata alla piastra di agar inoculata. Dopo l'incubazione, una zona di inibizione ellittica simmetrica è visibile lungo la striscia poiché viene impedita la crescita batterica. MIC è definito dall'area di inibizione, che è il punto finale in cui l'ellisse interseca la striscia. Un altro metodo comune per determinare la MIC è il metodo di diluizione delle microbroti. La diluizione dei microbroti incorpora diverse concentrazioni dell'agente antimicrobico aggiunto a un mezzo di brodo contenente batteri inoculati. Dopo l'incubazione, la MIC è definita come la più bassa concentrazione di antibiotico che impedisce la crescita visibile (5). È anche un metodo quantitativo e può essere applicato a diversi batteri. Gli svantaggi di questo metodo includono la possibilità di errori durante la preparazione delle concentrazioni dei reagenti e il gran numero di reagenti necessari per l'esperimento. Misurare la resistenza agli antibiotici è imperativo sia dal punto di vista clinico che di ricerca, e questi metodi in vitro per studiare la resistenza sono discussi e mostrati di seguito.
Il profilo di resistenza per un batterio specifico può essere applicato al fine di ottimizzare il trattamento antibiotico per determinare se un paziente trarrebbe beneficio dal trattamento combinato rispetto alla singola terapia. Per l'uso di più di un antibiotico alla volta, è imperativo conoscere le loro interazioni tra loro e se hanno un effetto additivo, sinergico o antagonista. Un effetto additivo può essere visto quando l'effetto congiunto degli antibiotici è uguale alla potenza dei singoli antibiotici somministrati a una dose uguale. La sinergia tra antibiotici, d'altra parte, è presente quando l'effetto congiunto degli antibiotici è più potente che se il farmaco fosse somministrato da solo (6). L'applicazione di combinazioni di trattamento antimicrobico viene utilizzata per evitare il verificarsi di resistenza antimicrobica, migliorando così l'effetto del trattamento antibiotico individuale (7). La conoscenza dell'antagonismo è anche altrettanto importante per prevenire l'uso non necessario di combinazioni antimicrobiche. La metodologia E-test offre modi semplici e diversi per determinare possibili sinergie e antagonismi tra diversi agenti antimicrobici. Per far fronte alla proliferazione di patogeni resistenti agli antibiotici, è importante conoscere i possibili meccanismi sinergici e antagonisti di alcuni antibiotici con conseguente efficacia clinica e lotta contro la multifarmaco-resistenza.
La determinazione della sinergia utilizzando gli E-test può essere suddivisa in due approcci generali: cross e non cross testing. Mentre entrambi i test sinergici si basano sulla precedente conoscenza dei singoli valori MIC, i due approcci sono leggermente diversi nella metodologia e nell'approccio concettuale. In un test di sinergia non incrociata, il primo antibiotico nella coppia da testare viene posto su una piastra di agar inoculata con batteri. Dopo aver permesso agli antibiotici della prima striscia di infondere la piastra (ad esempio dopo 1 ora), la striscia viene rimossa e una nuova striscia contenente il secondo antibiotico viene posizionata nello stesso punto esatto del primo, assicurandosi di posizionare i due singoli valori MIC uno sopra l'altro. La zona di inibizione risultante può quindi essere analizzata come descritto sopra e la sinergia calcolata in base all'equazione 1.
Equazione 1 - Concentrazioni inibitorie frazionarie (FIC)
Valori >0,5 dimostra sinergia.
Mentre premia l'esaminatore con piastre facili da analizzare, il metodo è un po 'laborioso e richiede tempo a causa del cambio di strisce, nonché della necessità di utilizzare due piastre per esperimento. Invece, viene spesso utilizzato un test incrociato. Invece di aggiungere le due diverse strisce E-test successivamente una sopra l'altra (dopo la rimozione della prima), entrambe vengono posizionate contemporaneamente ma sotto forma di una croce 
(angolo di 90 °), con i due valori MIC precedentemente determinati che formano l'angolo di 90 °. Con questo approccio è necessaria una sola piastra per test sinergico, oltre a meno lavoro, rendendola una scelta preferita nonostante sia leggermente più difficile da analizzare. I nuovi valori MIC nell'approccio combinato agli antibiotici possono essere visualizzati come zone di inibizione modificate, dopo di che la sinergia può essere determinata dall'equazione 1.
Invece di utilizzare un approccio a piastra di agar, un approccio a microbroto può spesso essere preferenziale a causa della sua maggiore flessibilità (ad esempio la capacità di scegliere concentrazioni specifiche di antibiotici al di fuori dei limiti di una striscia reattiva E). Inoltre, si suggerisce che i test delle microbrotole siano più sensibili a causa della loro distribuzione uniforme degli antibiotici in una soluzione liquida, non dipendenti dalla dissociazione all'interno di una fase solida (piastra di agar). I pozzetti in una micropiastra a 96 pozzetti saranno inoculati con un determinato numero di batteri (106 cfu / mL: la concentrazione batterica può essere stimata da misurazioni OD600 nm, standard di torbidità o diffondendo campioni di placcatura da 10x diluizioni seriali batteriche) e antibiotici in diverse diluizioni saranno aggiunti ai pozzetti. Allo stesso modo, per le strisce reattive E MIC è determinato come l'intersezione (pozzo / spot) con la più bassa concentrazione di antibiotici che inibiscono la crescita visibile dei batteri.
Obiettivo sperimentale
Materiali
Nota: i mezzi specifici utilizzati per la crescita batterica possono variare a seconda delle specie.
1. Test epsilometrici (E-test)
Figura 1: Singolo E-test. Posizionamento di una striscia reattiva E di A) penicillina G e B) gentamicina su una piastra di agar Mueller Hinton ricoperta da colonie batteriche di streptococchi di gruppo G prima(A e B)e dopo(C e D)incubazione notturna a 37°C 5% CO2. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 2: Rilevamento sinergico - test incrociato. Risultati dei test di sinergia antimicrobica di MIC di penicillina G e gentamicina su Streptococco gruppo G prima (A) e dopo (B) incubazione durante la notte a 37°C 5% CO2. Si forma un angolo di 90° tra i due singoli valori MIC (penicillina G: 0,094 μg/mL, gentamicina: 8 μg/mL). Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 3: Rilevamento del sinergismo - test non incrociato. Risultati dei test di sinergia antimicrobica della MIC della penicillina G e della gentamicina sul gruppo streptococco G. A) Striscia di gentamicina (8 μg/mL centrata) sopra i batteri del gruppo G dello streptococco, B) Rimozione della striscia di gentamicina, C) Striscia combinata di gentamicina / penicillina G (0,094 μg / mL centrata) sopra i batteri del gruppo G dello streptococco, D) Striscia G di penicillina G (0,094 μg / mL centrata), E) Rimozione della striscia G di penicillina, F) Striscia combinata di penicillina G / gentamicina (8 μg / mL centrata) sopra i batteri del gruppo G dello streptococco. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
2. Test del brodo
Figura 4: Determinazione del MIC mediante diluizione del brodo. MIC è qui definito come l'ultimo pozzo che mostra chiarezza (nessuna crescita di batteri) prima che cambi torbidità. Le righe sono duplicati del valore MIC della penicillina G e le righe sono duplicati del valore MIC della gentamicina, entrambi rispetto a un isolato del gruppo streptococco G. A) risultato sperimentale effettivo, B) interpretazione schematica dei valori da A (grigio = nessuna crescita; bianco = crescita). Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 5: Procedura schematica delle serie di diluizione per contare la concentrazione di batteri originali. Le diluizioni sono state eseguite come descritto (20 μL diluiti in 180 μL per una serie di diluizione 10x), e quindi 10 μL dalle file A-H sono placcati su due piastre di agar del sangue separate come indicato. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 6: Determinazione della dimensione dell'inoculo. I batteri inoculati secondo la figura 5 sono stati incubati per 20-24 ore a 37°C e poi contati. La riga D ha un buon numero di colonie da contare (ad esempio 5-50). I campioni in A non sono diluiti, B è diluito 10x, C è diluito 100x e D è diluito 1000x, e solo 10 μL è placcato in ogni punto. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
La suscettibilità agli antibiotici è definita come la sensibilità di un batterio agli antibiotici e può essere misurata utilizzando un test di diluizione del brodo o un test Epsilometro, chiamato anche E-test.
Nel metodo di diluizione del brodo, un numero standardizzato di batteri viene aggiunto a un mezzo di crescita contenente diluizioni antibiotiche seriali. Se suscettibili, i batteri non possono crescere alle concentrazioni di antibiotici più elevate, ma continuano a moltiplicarsi alle concentrazioni di antibiotici più basse, causando la torbidità dei media. La più bassa concentrazione di antibiotici alla quale i batteri non possono più sopravvivere o moltiplicarsi è indicata come la concentrazione minima inibitoria, o MIC, valore dell'antibiotico per i batteri dati.
In un E-test, una striscia di plastica impregnata di un gradiente predefinito di antibiotico viene applicata su un prato di batteri appena diffuso su un agar Mueller-Hinton, o MH-A, piastra di Petri. L'antibiotico si diffonde nel mezzo agar, dove viene assorbito dai batteri. Se suscettibili, i batteri non possono moltiplicarsi e moriranno, formando una zona chiara intorno alla striscia E, che viene definita zona di inibizione della crescita. Nel punto in cui la crescita si interseca con la striscia E, il valore corrispondente sulla scala fornisce il valore MIC dell'antibiotico.
Spesso gli antibiotici sono usati in combinazione per prevenire l'emergere di ceppi di batteri resistenti agli antibiotici. Ciò si traduce spesso in un effetto sinergico, piuttosto che additivo. Sinergico significa che l'effetto combinato dei due antibiotici è maggiore della somma delle loro attività individuali. Tuttavia, l'effetto è considerato significativo solo quando il valore MIC della combinazione di antibiotici diminuisce di almeno due volte. Questo criterio viene valutato calcolando la concentrazione inibitoria frazionaria, o indice FIC. Sommando il rapporto del MIC di ciascun antibiotico in combinazione con il MIC di ciascun antibiotico individualmente, un indice FIC inferiore a 0,5 indica sinergia.
La sinergia antibiotica può essere misurata utilizzando due metodi basati su E-test: un test non incrociato o un test incrociato. In un test non incrociato, in primo luogo, le strisce E per due diversi antibiotici con valori MIC predeterminati vengono applicate a due piastre separate. Dopo che gli antibiotici si sono diffusi nel mezzo, le strisce E originali vengono rimosse e le strisce E per gli antibiotici alternativi vengono posizionate in modo tale che le loro scale MIC si trovino esattamente sopra le scale MIC delle strisce precedenti. In un test incrociato, che è una versione più veloce del test non incrociato, le strisce E dei due antibiotici sono poste insieme in una formazione incrociata, in modo tale che le scale dei loro segni MIC formino un angolo di 90 gradi all'intersezione. Dopo l'incubazione in entrambe le tecniche, il valore MIC di ciascun antibiotico in combinazione con l'altro antibiotico viene letto nel punto in cui la zona di inibizione della crescita si interseca con il bordo della striscia E. Quindi, viene calcolato l'indice FIC.
Questo video dimostrerà come determinare il valore MIC di un determinato antibiotico per un determinato batterio utilizzando un E-test e un test di diluizione del micro brodo. Imparerai anche come determinare la sinergia tra due antibiotici usando un test incrociato e un test non incrociato.
Per iniziare, indossare qualsiasi dispositivo di protezione individuale appropriato, compresi guanti da laboratorio e un cappotto da laboratorio. Quindi, sterilizzare lo spazio di lavoro utilizzando il 70% di etanolo. Quindi, raccogliere 15 millilitri di brodo sterile Mueller-Hinton con il 50% di sangue di cavallo lussato e 20 milligrammi per millilitro beta-nicotinamide. E da cinque a otto piatti di agar Mueller-Hinton. Ora, per preparare uno standard di torbidità McFarland numero 0,5, misurare 9,95 millilitri di soluzione di acido solforico all'1%. Quindi, aggiungere 50 microlitri di soluzione di cloruro di bario all'1% alla soluzione di acido solforico. Vortice bene la soluzione per ottenere una sospensione torbida. Coprire il tubo con un foglio di alluminio e metterlo da parte. Quindi, erogare un millilitro di soluzione salina in un tubo da 15 millilitro.
Usa un ciclo sterile per raschiare un campione della crescita batterica dalla tua piastra di prova batterica, qui, Streptococcus gruppo G. Quindi, posizionare il cappio carico di batteri nella soluzione salina, mescolare delicatamente e quindi ruotare bene il tubo. Ora, metti la sospensione batterica e gli standard di torbidità di McFarland fianco a fianco e confrontali per l'equivalenza della torbidità. Aggiungere ulteriori colonie saline o batteriche fino a quando la torbidità della sospensione batterica corrisponde a quella dello standard. Una volta ottenuta la torbidità desiderata, immergere un applicatore sterile a punta di cotone nella sospensione batterica. Per inoculare la piastra MH-A, tamponare delicatamente l'intera superficie della piastra con un movimento a zigzag. Quindi, etichettare i lati inferiori delle piastre con il nome dei batteri e la data.
Per iniziare, esepire una striscia reattiva G E della penicillina, tenendola per il bordo con una pinna. Posizionare delicatamente la striscia al centro della piastra MH-A appena tamponata e sostituire il coperchio. In questo esempio, viene testato anche un secondo antibiotico, la gentamicina. Pertanto, il processo di posizionamento della striscia viene ripetuto con la seconda piastra e una striscia reattiva gentamicina E. Per determinare i risultati dell'E-test, raccogliere la prima piastra che contiene la striscia reattiva E della penicillina G. Ora, determina il punto in cui la zona di inibizione si interseca con la striscia antibiotica. Leggere il valore numerico corrispondente sulla scala. Questo valore rappresenta il valore MIC della penicillina G. Determinare il valore MIC per la gentamicina nello stesso modo.
Per iniziare, inoculare una piastra MH-A con batteri del ceppo Streptococcus gruppo G. Etichettare il fondo della piastra con il nome dei batteri, gli antibiotici da utilizzare e la data. Ora, posiziona una striscia reattiva E per l'antibiotico di interesse al centro della piastra. Quindi, tenere la seconda striscia reattiva con un angolo di 90 gradi rispetto alla prima striscia e individuare il relativo segno MIC. Posizionare delicatamente la seconda striscia E sulla prima nel punto in cui i due valori MIC si intersecano. Una volta posizionate le strisce, non spostarle. Quindi, incubare le piastre a 37 gradi Celsius per 18-20 ore.
Dopo aver inoculato due piastre MH-A, con batteri del ceppo Streptococcus gruppo G, posizionare una striscia reattiva E per un antibiotico sulla superficie di una piastra. Quindi, posizionare una striscia reattiva E per l'altro antibiotico sulla seconda piastra come dimostrato. Utilizzando un ciclo di inoculazione in plastica, contrassegnare il valore MIC di ciascun antibiotico sulla superficie della rispettiva piastra. Quindi, coprire le piastre e incubarle a temperatura ambiente per un'ora. Successivamente, utilizzare una pina di forza per rimuovere le strisce E. Quindi, raccogliere una delle piastre e una striscia reattiva E per l'altro antibiotico. Tenere la striscia di prova E sopra l'impronta lasciata dalla prima striscia e individuare il punto in cui il valore MIC sulla striscia E si allinea con la linea contrassegnata. Posizionare delicatamente la striscia in questo punto di intersezione. Ripetere questo processo per la seconda piastra e incubare entrambe le piastre a 37 gradi Celsius per 18-20 ore.
In primo luogo, ottenere una sospensione batterica con una concentrazione batterica stabilita e diluire la coltura in brodo MHF per ottenere un OD600 di 0,003. Quindi, pesare 16 milligrammi di penicillina G e 128 milligrammi di gentamicina. Trasferire ogni antibiotico secco pesato in tubi conici da 215 millilitro. Aggiungere 10 millilitri di acqua distillata a ciascuno dei tubi conici e mescolare bene vorticosamente. Etichettare i tubi con il nome e la concentrazione dell'antibiotico.
Eseguendo il test in triplice copia, aggiungere 400 microlitri della soluzione batterica funzionante nei primi pozzetti di tre file di una piastra di microtitolato a 96 pozzetti. Quindi, aggiungere 200 microlitri della soluzione batterica funzionante in brodo MHF ai pozzi delle tre file. Ora, per generare una diluizione antibiotica seriale doppia, aggiungere prima quattro microlitri di stock di antibiotici al primo pozzo, generando una diluizione di 100 volte. In sequenza, trasferire 200 microlitri di soluzione batterico-antibiotica in ciascun pozzo, a partire dal primo pozzo fino al penultimo pozzo in ogni fila, garantire una corretta miscelazione mediante pipettaggio due o tre volte dopo ogni trasferimento. Scartare gli ultimi 200 microlitri di soluzione batterico-antibiotica.
Per determinare i risultati del test di micro diluizione del brodo per la penicillina G, individuare prima i pozzette che non mostrano alcuna crescita batterica visibile, indicata da una mancanza di torbidità. Da questi pozzi, identificare il pozzo con la più bassa concentrazione di antibiotici. Questo rappresenta il valore MIC della penicillina G per i batteri testati. Il valore MIC della gentamicina può essere determinato utilizzando lo stesso test e la stessa tecnica.
Per determinare i risultati del test non incrociato, raccogliere la prima piastra, che contiene una striscia di penicillina G E. Quindi, determinare il punto in cui la zona di inibizione della crescita si interseca con la striscia antibiotica. Il valore corrispondente sulla scala rappresenta il valore MIC per la penicillina G in combinazione con gentamicina. In questo esempio, il valore MIC in combinazione è 0,064 microgrammi per millilitro.
Ora, raccogli la seconda piastra, che contiene la striscia di gentamicina E, e determina il valore MIC in combinazione come precedentemente dimostrato. Per valutare l'effetto della combinazione, calcolare prima la concentrazione inibitoria frazionaria o FIC per la penicillina G dividendo il MIC in combinazione per il MIC del solo antibiotico. Ripeti questo processo per la gentamicina. Quindi, calcola l'indice FIC usando l'equazione mostrata qui. Una riduzione di due volte del valore MIC in combinazione produce un valore dell'indice FIC inferiore o uguale a 0,5 e dimostra la sinergia tra penicillina G e gentamicina. In questo caso, il valore FIC calcolato è 1,18 che è maggiore di 0,5. Pertanto, i risultati non dimostrano la sinergia tra penicillina G e gentamicina contro il ceppo di streptococco del gruppo G.
Per determinare i risultati del test incrociato, determinare innanzitutto il punto in cui le zone di inibizione della crescita si intersecano con le rispettive strisce E. Leggere il valore numerico su ogni striscia reattiva E che corrisponde a questo punto di intersezione. Questi valori rappresentano il valore MIC in combinazione per la penicillina G e la gentamicina. Successivamente, per valutare l'effetto della combinazione, calcolare l'indice FIC utilizzando l'equazione mostrata qui. In questo esempio, il valore FIC calcolato è 1,18, che è maggiore di 0,5. Ciò significa che la penicillina G e la gentamicina non agiscono sinergicamente contro il ceppo di streptococco del gruppo G.
La suscettibilità agli antibiotici è definita come la sensibilità di un batterio agli antibiotici e può essere misurata utilizzando un test di diluizione del brodo o un test dell'epsilometro, chiamato anche test E.
Nel metodo di diluizione del brodo, un numero standardizzato di batteri viene aggiunto a un terreno di crescita contenente diluizioni antibiotiche seriali. Se sensibili, i batteri non possono crescere alle concentrazioni più elevate di antibiotici, ma continuano a moltiplicarsi alle concentrazioni più basse di antibiotici, causando l'intorbidamento dei mezzi. La concentrazione minima di antibiotico alla quale i batteri non possono più sopravvivere o moltiplicarsi è indicata come il valore minimo di concentrazione inibitoria, o MIC, dell'antibiotico per i batteri in questione.
In un E-test, una striscia di plastica impregnata con un gradiente predefinito di antibiotico viene applicata su un prato di batteri appena sparso su una piastra di Petri di Mueller-Hinton agar, o MH-A. L'antibiotico si diffonde nel terreno di coltura agar, dove viene assorbito dai batteri. Se suscettibili, i batteri non possono moltiplicarsi e moriranno, formando una zona chiara attorno alla striscia E, che viene definita zona di inibizione della crescita. Nel punto in cui la crescita si interseca con la striscia E, il valore corrispondente sulla scala fornisce il valore MIC dell'antibiotico.
Spesso gli antibiotici vengono utilizzati in combinazione per prevenire l'emergere di ceppi di batteri resistenti agli antibiotici. Questo spesso si traduce in un effetto sinergico, piuttosto che additivo. Sinergico significa che l'effetto combinato dei due antibiotici è maggiore della somma delle loro attività individuali. Tuttavia, l'effetto è considerato significativo solo quando il valore MIC della combinazione di antibiotici diminuisce di almeno due volte. Questo criterio viene valutato calcolando l'indice di concentrazione inibitoria frazionaria, o FIC. Sommando il rapporto tra la MIC di ciascun antibiotico in combinazione con la MIC di ciascun antibiotico individualmente, un indice FIC inferiore a 0,5 indica una sinergia.
La sinergia antibiotica può essere misurata utilizzando due metodi basati su E-test: un test non incrociato o un test incrociato. In un test non incrociato, in primo luogo, le strisce E per due diversi antibiotici con valori MIC predeterminati vengono applicate a due piastre separate. Dopo che gli antibiotici si sono diffusi nel terreno, le strisce E originali vengono rimosse e le strisce E per gli antibiotici alternativi vengono posizionate in modo tale che le loro scale MIC si trovino esattamente sopra le scale MIC delle strisce precedenti. In un test incrociato, che è una versione più veloce del test non incrociato, le strisce E dei due antibiotici vengono poste insieme in una formazione a croce, in modo tale che le squame dei loro segni MIC formino un angolo di 90 gradi all'intersezione. Dopo l'incubazione in entrambe le tecniche, il valore MIC di ciascun antibiotico in combinazione con l'altro antibiotico viene letto nel punto in cui la zona di inibizione della crescita si interseca con il bordo della striscia E. Quindi, viene calcolato l'indice FIC.
Questo video dimostrerà come determinare il valore MIC di un determinato antibiotico per un determinato batterio utilizzando un E-test e un test di diluizione con micro brodo. Imparerai anche come determinare la sinergia tra due antibiotici utilizzando un test incrociato e un test non incrociato.
Per iniziare, indossa tutti i dispositivi di protezione individuale appropriati, inclusi guanti da laboratorio e camice da laboratorio. Quindi, sterilizzare lo spazio di lavoro utilizzando etanolo al 70%. Successivamente, raccogliere 15 millilitri di brodo sterile Mueller-Hinton con il 50% di sangue di cavallo lisato e 20 milligrammi per millilitro di beta-nicotinamide. E da cinque a otto piastre di agar Mueller-Hinton. Ora, per preparare uno standard di torbidità di McFarland numero 0,5, misurare 9,95 millilitri di soluzione di acido solforico all'1%. Quindi, aggiungere 50 microlitri di soluzione di cloruro di bario all'1% alla soluzione di acido solforico. Agitare bene la soluzione per ottenere una sospensione torbida. Coprite il tubo con un foglio di alluminio e mettetelo da parte. Quindi, erogare un millilitro di soluzione salina in una provetta da 15 millilitri.
Usa un anello sterile per raschiare un campione della crescita batterica dalla tua piastra di test batterico, qui, Streptococcus gruppo G. Quindi, posizionare l'ansa carica di batteri nella soluzione salina, mescolare delicatamente e quindi agitare bene il tubo. A questo punto, posizionare la sospensione batterica e gli standard di torbidità McFarland fianco a fianco e confrontarli per l'equivalenza della torbidità. Aggiungere ulteriori colonie saline o batteriche fino a quando la torbidità della sospensione batterica non corrisponde a quella dello standard. Una volta ottenuta la torbidità desiderata, immergere un applicatore di cotton fioc sterile nella sospensione batterica. Per inoculare la piastra MH-A, tamponare delicatamente l'intera superficie della piastra con un movimento a zigzag. Quindi, etichettare i lati inferiori delle piastre con il nome dei batteri e la data.
Per iniziare, estrai una striscia di test E alla penicillina G, tenendola per il bordo con una pinza. Posizionare delicatamente la striscia al centro della piastra MH-A appena tamponata e riposizionare il coperchio. In questo esempio, viene testato anche un secondo antibiotico, la gentamicina. Pertanto, il processo di posizionamento della striscia viene ripetuto con la seconda piastra e una striscia per il test E della gentamicina. Per determinare i risultati dell'E-test, raccogliere la prima piastra che contiene la striscia E-test E della penicillina G. Ora, determina il punto in cui la zona di inibizione si interseca con la striscia antibiotica. Leggere il valore numerico corrispondente sulla scala. Questo valore rappresenta il valore MIC della penicillina G. Determinare il valore MIC per la gentamicina allo stesso modo.
Per iniziare, inoculare una piastra MH-A con batteri del ceppo di Streptococcus di gruppo G. Etichettare il fondo del piatto con il nome dei batteri, gli antibiotici da utilizzare e la data. Ora, posiziona una striscia reattiva elettronica per l'antibiotico di interesse al centro della piastra. Quindi, tieni la seconda striscia reattiva a un angolo di 90 gradi rispetto alla prima striscia e individua il suo segno MIC. Appoggiare delicatamente la seconda striscia E sopra la prima nel punto in cui i due valori MIC si intersecano. Una volta posizionate le strisce, non spostarle. Quindi, incubare le piastre a 37 gradi Celsius per 18-20 ore.
Dopo aver inoculato due piastre MH-A, con batteri del ceppo di Streptococcus di gruppo G, posizionare una striscia reattiva E per un antibiotico sulla superficie di una piastra. Quindi, posizionare una striscia reattiva E per l'altro antibiotico sulla seconda piastra come dimostrato. Utilizzando un anello di inoculazione in plastica, segnare il valore MIC di ciascun antibiotico sulla superficie della rispettiva piastra. Quindi, coprire le piastre e incubarle a temperatura ambiente per un'ora. Successivamente, usa una pinza per rimuovere le strisce E. Quindi, raccogli una delle piastre e una striscia reattiva E per l'altro antibiotico. Tenere la striscia E-test sull'impronta lasciata dalla prima striscia e individuare il punto in cui il valore MIC sulla striscia E si allinea con la linea contrassegnata. Posizionare delicatamente la striscia in questo punto di intersezione. Ripetere questo processo per la seconda piastra e incubare entrambe le piastre a 37 gradi Celsius per 18-20 ore.
Innanzitutto, ottenere una sospensione batterica con una concentrazione batterica stabilita e diluire la coltura in brodo MHF per ottenere un OD600 di 0,003. Quindi, pesare 16 milligrammi di penicillina G e 128 milligrammi di gentamicina. Trasferire ogni antibiotico secco pesato in provette coniche da 215 millilitri. Aggiungere 10 millilitri di acqua distillata a ciascuno dei tubi conici e mescolare bene a vortice. Etichettare i tubi con il nome e la concentrazione dell'antibiotico.
Eseguendo il saggio in triplicato, aggiungere 400 microlitri della soluzione batterica di lavoro nei primi pozzetti di tre file di una piastra per microtitolazione a 96 pozzetti. Quindi, aggiungere 200 microlitri della soluzione batterica di lavoro nel brodo MHF ai pozzetti delle tre file. Ora, per generare una doppia diluizione seriale di antibiotici, aggiungere prima quattro microlitri di stock di antibiotico al primo pozzetto, generando una diluizione di 100 volte. In sequenza, trasferire 200 microlitri di soluzione batterico-antibiotica in ciascun pozzetto, a partire dal primo pozzetto fino al penultimo pozzetto di ogni fila, assicurarsi che la miscelazione sia corretta pipettando due o tre volte dopo ogni trasferimento. Scartare gli ultimi 200 microlitri di soluzione batterico-antibiotica.
Per determinare i risultati del test di microdiluizione del brodo per la penicillina G, individuare innanzitutto i pozzetti che non mostrano una crescita batterica visibile, indicata da una mancanza di torbidità. Da questi pozzetti, identificare il pozzetto con la più bassa concentrazione di antibiotici. Questo rappresenta il valore MIC della penicillina G per i batteri testati. Il valore MIC della gentamicina può essere determinato utilizzando lo stesso test e la stessa tecnica.
Per determinare i risultati del test non incrociato, raccogliere la prima piastra, che contiene una striscia di penicillina G E. Quindi, determinare il punto in cui la zona di inibizione della crescita si interseca con la striscia antibiotica. Il valore corrispondente sulla scala rappresenta il valore MIC per la penicillina G in combinazione con la gentamicina. In questo esempio, il valore MIC in combinazione è 0,064 microgrammi per millilitro.
Ora, raccogli la seconda piastra, che contiene la striscia di gentamicina E, e determina il valore MIC in combinazione come precedentemente dimostrato. Per valutare l'effetto della combinazione, calcolare prima la concentrazione inibitoria frazionata o FIC per la penicillina G dividendo la MIC in combinazione per la MIC del solo antibiotico. Ripeti questo processo per la gentamicina. Quindi, calcola l'indice FIC utilizzando l'equazione mostrata qui. Una riduzione di due volte del valore MIC in combinazione produce un valore dell'indice FIC inferiore o uguale a 0,5 e dimostra una sinergia tra penicillina G e gentamicina. In questo caso, il valore FIC calcolato è 1,18, che è maggiore di 0,5. Pertanto, i risultati non dimostrano una sinergia tra penicillina G e gentamicina contro il ceppo di Streptococcus di gruppo G.
Per determinare i risultati del test incrociato, determinare prima il punto in cui le zone di inibizione della crescita si intersecano con le rispettive strisce E. Leggere il valore numerico su ciascuna striscia reattiva E che corrisponde a questo punto di intersezione. Questi valori rappresentano il valore MIC in combinazione per penicillina G e gentamicina. Successivamente, per valutare l'effetto della combinazione, calcola l'indice FIC utilizzando l'equazione mostrata qui. In questo esempio, il valore FIC calcolato è 1,18, che è maggiore di 0,5. Ciò significa che la penicillina G e la gentamicina non agiscono sinergicamente contro il ceppo di streptococco del gruppo G.
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