Saggio delle placche: un metodo per determinare il titolo virale in unità formanti placca (UFP)

I batteriofagi, chiamati anche fagi, sono virus che infettano specificamente i batteri e possiamo confermarne la presenza e quantificarli utilizzando uno strumento chiamato saggio della placca. I batteriofagi infettano i loro ospiti sensibili attaccandosi prima alla parete cellulare batterica e iniettando il loro materiale genetico. Quindi, dirottano il macchinario biosintetico della cellula per replicare il loro DNA e produrre numerose particelle di fagi di progenie, che poi rilasciano lizzando e uccidendo la cellula ospite.

Questa attività litica è alla base di una tecnica di enumerazione dei fagi ampiamente utilizzata nota come saggio della placca o saggio del doppio strato agar. Qui, una miscela di batteriofagi viene prima preparata in un brodo nutritivo fuso contenente agar a bassa concentrazione. Tutti i batteri utilizzati nella miscela dovrebbero essere vivi e dividersi attivamente nella fase di tronco della loro crescita, il che garantirà che una grande percentuale di batteri sia vitale e in grado di formare un prato denso attorno alle placche. Successivamente, questa miscela di agar batterico-fagico fuso viene distribuita su un mezzo nutritivo di agar più solido e concentrato che è già solidificato su una piastra di Petri. Durante l'incubazione a temperatura ambiente, anche il brodo di agar-fagi-batteri a bassa concentrazione si solidifica per formare un morbido rivestimento di agar.

Qui, le cellule batteriche possono derivare ulteriori nutrienti dallo strato inferiore e dovrebbero moltiplicarsi rapidamente per produrre un prato confluente di batteri. Tuttavia, poiché le particelle di fago sono presenti anche nello strato molle, queste infetteranno e replicheranno il loro materiale genetico all'interno dei batteri, culminando nella lisi cellulare, che rilascia più progenie. Questa progenie dei fagi infetta quindi le cellule vicine, poiché lo stato semi-solido dello strato batterico-fago limita il loro movimento alle cellule ospiti più lontane. Questo ciclo di infezione e lisi continua per più cicli, uccidendo un gran numero di batteri in un'area localizzata. L'effetto della distruzione delle cellule vicine è quello di produrre una singola zona circolare chiara, chiamata placca, che può essere vista ad occhio nudo, amplificando efficacemente l'attività litica batterica del fago e consentendo la loro enumerazione.

Il numero di placche su una piastra di Petri è indicato come unità formanti placche, o PFU, e, a condizione che la concentrazione iniziale di batteriofago sia stata sufficientemente diluita, dovrebbe corrispondere direttamente al numero di particelle di fagi infettivi nel campione originale. Questa tecnica può essere utilizzata anche per la caratterizzazione della morfologia della placca, per aiutare nell'identificazione dei tipi di fagi o per isolare i mutanti dei fagi. In questo laboratorio imparerai come eseguire il test della placca per l'enumerazione dei fagi, usando il fago T7 di E. coli come esempio.

Innanzitutto, identificare un terreno adatto per la coltura delle cellule batteriche ospiti e del batteriofago. Qui il brodo di lisogeno, o terreno LB, è stato utilizzato per coltivare E. coli e il fago T7. Quindi, prendi tre bottiglie di vetro pulite ed etichettale con media, nome, e poi la prima come LB-Brodo, la seconda come LB-Bottom Agar e la terza come LB-Top Agar. Ora, pesa quattro grammi di polvere LB pre-formulata in tre set e poi trasferisci un set di terreno essiccato pesato in ogni flacone. Aggiungere 200 millilitri di acqua alla prima bottiglia. Mescolare il contenuto utilizzando un'ancoretta magnetica.

Quindi, utilizzando un pHmetro e mescolando costantemente, portare il pH finale a 7,4 attraverso l'aggiunta di idrossido di sodio o acido cloridrico. Ripetere l'aggiunta di acqua e la regolazione del pH anche per le altre due bottiglie rimanenti. Ora, pesa tre grammi di polvere di agar e aggiungila alla seconda bottiglia per ottenere un agar inferiore all'1,5%. Infine, pesa 1. 2 grammi di agar agar e aggiungerlo alla terza bottiglia per ottenere l'agar superiore da 6 % libbre. La condizione di brodo in bottiglia uno non necessita di un'aggiunta di agar. Tappare il flacone in modo semiermetico, quindi sterilizzare il terreno in autoclave a 121 gradi Celsius per 20 minuti. Una volta completati, rimuovere i flaconi dei terreni dall'autoclave e ruotare immediatamente i tappi dei flaconi per chiuderli completamente per evitare contaminazioni. Tenere il terreno LB-Broth e LB-Top Agar sul banco per un uso successivo. Posizionare l'LB-Bottom Agar a raffreddare a bagnomaria preimpostato a circa 45 gradi Celsius.

Quando l'agar LB-Bottom raggiunge circa 45 gradi Celsius, trasferirlo sul banco di lavoro. Quindi, sterilizzare l'area di lavoro utilizzando il 70% di etenolo. Successivamente, aggiungere 450 microlitri di cloruro di calcio sterile di un molare all'agar inferiore fuso per ottenere una concentrazione finale di 2,25 millimolari. Agitare delicatamente la bottiglia per mescolare. Quindi, prepara sette piastre di Petri pulite. Etichetta ogni piatto sul fondo con il nome del supporto e la data di preparazione. Quindi, versare 15 millilitri di agar inferiore in ciascuna delle sette piastre di Petri. Lasciare riposare le piastre per alcune ore o per una notte a temperatura ambiente. Una volta impostate, le piastre di coltura possono essere conservate a quattro gradi Celsius per diversi giorni, se necessario, capovolte per ridurre al minimo la condensa. Trasferire le piastre di Petri dal frigorifero a quattro gradi Celsius a un'incubatrice a 37 gradi Celsius un'ora prima del test.

Il giorno prima della preformazione del saggio, l'E. coli deve essere coltivato. Qui, 10 microlitri di coltura di E. coli sono stati inoculati in 10 millilitri di brodo LB. Metti i batteri a crescere per una notte in un'incubatrice vibrante impostata a 37 gradi Celsius a 160 giri/min. Quindi, il giorno del test, rimuovere la coltura batterica dall'incubatore. Semina 10 millilitri freschi di brodo LB fresco con 0,5 millilitri di coltura notturna. Posiziona queste cellule in modo che crescano in un'incubatrice vibrante impostata a 37 gradi Celsius a 160 giri/min. Successivamente, utilizzare uno spettrofotometro per verificare quando questa coltura raggiunge la crescita della fase logaritmica, indicata da una densità ottica compresa tra 0,5 e 0,7. Una volta che l'OD raggiunge questo livello, interrompere l'incubazione trasferendo la coltura cellulare sul banco. Sono ora pronti per essere utilizzati per il saggio di sovrapposizione dei fagi.

I titoli dei fagi possono variare esponenzialmente tra i diversi tipi di fagi e campioni. Quindi, per contarli in modo efficace, dovrebbero essere diluiti per generare un'ampia gamma di concentrazioni di fagi. Il giorno del saggio, generare una serie di diluizioni fagiche che vanno da un decimo a un milionesimo di concentrazione, seguendo una tecnica di diluizione di 10 volte. Per ottenere dati statisticamente significativi e accurati, eseguire la diluizione seriale in triplicato.

Quindi, sciogliere l'agar LB-top solidificato usando un forno a microonde. Quindi, mettilo a bagnomaria preimpostato a 45 gradi Celsius per un'ora. Dopo un'ora, prelevare dall'incubatrice le piastre di Petri contenenti lo strato inferiore di agar. Etichettare le piastre con la concentrazione di fagi e la data del test. Quindi, prepara sette provette pulite. Etichettare ogni provetta con il numero seriale di diluizione del fago e designarne una come controllo.

Quando l'agar LB-top raggiunge i 45 gradi Celsius, trasferirlo sul banco di lavoro. Ora, aggiungi 450 microlitri di cloruro di calcio molare all'agar da 200 millilitri per ottenere una concentrazione finale di 2,25 millimolari. Agitare delicatamente la bottiglia per mescolare. Quindi, aggiungere 35 millilitri di LB-top agar e quattro millilitri di sospensione batterica in una provetta conica sterile. Agitare delicatamente per distribuire uniformemente le cellule, ma evitare di agitare per evitare la formazione di schiuma.

Ora, aliquotare cinque millilitri di questa miscela di batteri e agar superiore in ciascuna delle sette provette. Quindi, trasferire 100 microlitri di campioni di batteriofago diluiti in serie e terreni di controllo, che dovrebbero essere semplicemente terreni senza batteriofagi, nelle provette rispettosamente etichettate. Agitare delicatamente il composto per garantire una miscelazione corretta. Trasferire delicatamente cinque millilitri di miscela di batteriofagi sulla rispettiva piastra di Petri. Distribuire uniformemente la miscela su tutta la superficie facendo roteare delicatamente la piastra di Petri.

Una volta che tutte le piastre di Petri sono stratificate con la miscela, lasciare solidificare lo strato superiore incubando a temperatura ambiente per 15 minuti. Dopo aver completato questi passaggi, ripetere il processo per la seconda e poi la terza serie di piastre di Petri utilizzando le restanti due serie di diluizioni dei fagi. Sigillare ogni piatto con parafilm e incubare a temperatura ambiente per 15 minuti. Posizionare la piastra di coltura capovolta a una temperatura adeguata per 24 ore o fino a quando non si sviluppano le placche. Qui, le piastre sono state poste in un'incubatrice a 37 gradi Celsius per un giorno, una condizione di crescita stimolante per E. coli e il fago T7.

Le placche appariranno dopo uno o cinque giorni di incubazione, a seconda della specie batterica, delle condizioni di incubazione e della scelta del terreno. Qui, le placche erano visibili dopo un giorno di incubazione a 37 gradi Celsius. Iniziare controllando le piastre contrassegnate come controllo e assicurarsi che non si siano formate placche in queste piastre, poiché ciò indicherebbe una contaminazione virale. Per determinare il titolo dei fagi nel campione originale, iniziare con le piastre contenenti il campione di fagi più diluito e contare le placche senza rimuovere i coperchi, contrassegnandole per indicare quali sono già state contate. Ripetere il conteggio per ogni piatto in ogni set. Alcune targhe potrebbero avere troppe o troppo poche placche per essere contate. Considera da 10 a 150 come numero ideale di placche.

Successivamente, generare una tabella che elenca i valori del numero di placca per le diverse diluizioni e repliche. Quindi, calcolare i valori medi del numero di placca per le piastre di diluizione che contenevano il numero ideale di conteggi della placca. In questo esempio, si tratta del numero medio di placche formate nelle piastre di diluizione da 10 a meno tre e da 10 a meno quattro. Ora, aggiustare per il fattore di diluizione dei fagi dividendo i valori medi della placca ottenuti per i rispettivi fattori di diluizione dei fagi. Qui, il numero medio di placche formate da 10 a meno tre e da 10 a meno quattro piastre di diluizione, è stato diviso per i rispettivi fattori di diluizione per ottenere il numero di unità di formazione delle placche, o PFU, in 100 microlitri di miscela di fagi. Per convertire il valore in PFU per millilitro, moltiplicare i valori generati per 10, poiché durante la fase di preparazione della sovrapposizione dei batteriofagi sono stati utilizzati solo 100 microlitri di miscela di diluizione dei fagi, producendo un fattore di diluizione aggiuntivo di 10. Infine, calcolare la media dei valori ottenuti dalle diverse piastre di diluizione. Questo darà il numero medio di PFU per millilitro. Il numero di PFU corrisponde al numero di particelle infettive di fagi nel campione originale.