Saggio delle placche: un metodo per determinare il titolo virale in unità formanti placca (UFP)

1. Configurazione

1. Prima di iniziare qualsiasi lavoro che coinvolga i microbi, assicurarsi che lo spazio di lavoro sia sterilizzato(ad esempio pulito con etanolo al 70%). Indossare sempre un cappotto da laboratorio e guanti, tenere i capelli lunghi legati all'indietro e assicurarsi che eventuali ferite siano particolarmente ben protette.
2. Al termine, sterilizzare tutte le superfici e lavare accuratamente / sterilizzare mani e polsi.

2. Protocollo

1. Preparazione LB Media
   Nota: A seconda del ceppo batterico dell'ospite e del batteriofago, un mezzo liquido diverso può essere più adatto per la coltura iniziale del ceppo batterico dell'ospite o un mezzo solido diverso può essere più adatto per la crescita successiva. Il brodo di lysogeny (LB) viene utilizzato in questo protocollo per il brodo e l'agar.
   1. Mescolare 4 g di LB in 200 ml di acqua distillata, in triplice copia, per il brodo LB, l'agar fondo solido e l'agar soft top. Tutte le soluzioni devono essere preparate in contenitori in grado di contenere il doppio del volume finale per evitare il trabocco durante l'autoclave.
      Nota: Se si esegue il test in triplice copia, preparare il doppio della quantità di agar inferiore LB.
   2. Regolare il pH di tutte e tre le soluzioni a 7,4 utilizzando NaOH o HCl a seconda dei casi.
   3. Aggiungere 3 g di energia agar alla bottiglia di agar inferiore per creare una soluzione di agar all'1,5% per l'agar solido
   4. Aggiungere 1,2 g di energia agar alla bottiglia di agar superiore per creare una soluzione di agar allo 0,6% per l'agar morbido.
   5. Posizionare le bottiglie, con tappi semiserdati, in un'autoclave impostata a 121°C per 20 minuti per sterilizzare le soluzioni. Chiudere i tappi non appena la corsa è terminata per evitare contaminazioni.
   6. Quando il mezzo LB ha raggiunto una temperatura di circa 45-50°C, aggiungere 450 μL di CaCl 2 sterile da₁ M a tutte e tre le soluzioni LB da 200 mL per raggiungere una concentrazione finale di 2,25 mM.
   7. Versare 15 mL di aliquote del mezzo di agar solido in piastre di Petri sterili (evitare di agitare per evitare la formazione di schiuma) e lasciare che l'agar si solidifichi per alcune ore o durante la notte a temperatura ambiente (Figura 4A). Le piastre possono essere conservate a testa in giù a 4°C per diversi giorni.
2. Coltivazione di cellule ospiti
   1. Un giorno prima del test, aggiungere 10 μL di coltura di E. coli a 10 ml di brodo LB.
   2. Incubare i batteri a 37°C durante la notte a 160 giri/min in un incubatore vibrante.
   3. La mattina del test, aggiungere 0,5 ml di coltura notturna a 10 ml di LB fresco.
      Nota: Se si esegue il test in triplice copia, preparare il doppio della quantità di questa cultura.
   4. Incubare il a 37 ° C a 160 giri / min in un incubatore vibrante fino a quando la coltura batterica è in fase di crescita logaritmica. Questo può essere determinato spettrofotometricamente da un OD600 di 0,5-0,7.
   5. Mantenere la coltura a temperatura ambiente fino a quando i batteri non devono essere aggiunti all'agar LB superiore.
3. Diluizione seriale 10 volte del batteriofago
   1. Aggiungere 180μL di brodo LB a sette pozzetti nella prima fila di un piatto da 96 pozzetti
      Nota: Si consiglia di eseguire la diluizione in triplice copia al fine di aumentarne l'affidabilità statistica. Per fare questo, preparare ulteriori diluizioni del batteriofago nella seconda e terza fila della piastra.
   2. Vortice con attenzione il campione di batteriofago originale per garantire l'omogeneità e trasferire 20 μL nel primo pozzo.
   3. Mescolare bene il campione pipettando e verso il basso.
   4. Trasferire 20 μL della sospensione risultante nel secondo pozzo.
   5. Continuare la diluizione seriale trasferendo 20 μL della soluzione nel secondo pozzo nel terzo pozzo, e così via, fino al sesto pozzo, lasciando il settimo pozzo come controllo negativo a cui non verrà aggiunta alcuna sospensione fagica. Ciò creerà un intervallo di diluizione di 10^-1-10^-6.
4. Placcatura
   1. Etichettare la base delle piastre di Petri (precedentemente preparate al punto 2.1.7) con nome, data e una breve descrizione del campione (incluso il fattore di diluizione del campione di fagi). Preriscaldarsi delle piastre di Petri in incubatrice a 37°C un'ora prima del test.
   2. Sciogliere l'agar-medium morbido solidificato (in genere fatto usando un forno a microonde; l'agar solidificato fonde a 85 ° C) e lasciarlo arrivare a circa 45 ° C. Il mezzo riscaldato può essere posto in un bagno d'acqua a 45 ° C per ~ 1 ora per raggiungere una temperatura appropriata. Dovrebbe essere abbastanza caldo da rimanere in forma liquida, ma abbastanza freddo da non uccidere i batteri aggiunti.
   3. Mescolare 4 mL di coltura batterica (dal punto 2.2) con 35 mL lb di agar morbido (a 45°C). Ruotare per distribuire uniformemente le cellule ma evitare di scuotere per evitare la formazione di schiuma (Figura 4A).
   4. Etichettare una provetta sterile per ciascuna delle fasi di diluizione seriale e una per il campione di controllo, per un totale di 7 provette etichettate. Inserire 5 mL aliquote della coltura batterica/miscela di agar molle dal punto 2.4.3 nei 7 tubi. Lavora rapidamente attraverso il passaggio 2.4.6 perché volumi così piccoli di supporti a base di agar si solidificheranno rapidamente a temperatura ambiente.
   5. Aggiungere 100 μL del campione di controllo (dal punto 2.3) alla provetta di controllo e ruotare con attenzione. Scartare la punta della pipetta utilizzata e trasferire lo stesso volume da ciascuno dei campioni di batteriofago diluiti in serie (fase 2.3) alle rispettive provette, ruotando per mescolare.
   6. Trasferire immediatamente le miscele da 5 ml sulle piastre di agar solido, preriscaldato, etichettate (Figura 4A). Ruotare delicatamente i piatti per stendere anche le miscele.
      Nota: Se si esegue il test in triplice copia, ripetere i passaggi 2.4.3-6 altre due volte.
   7. Sigillare ogni piastra con pellicola da laboratorio e lasciare che entrambi gli strati si solidifichino correttamente a temperatura ambiente (circa 15 minuti) prima di posizionarli a testa in giù in un incubatore a 37 ° C, stimolando la crescita sia dei batteri che del fago, per 24 ore o fino a quando non si sviluppano placche, in genere ci vogliono circa 1-5 giorni perché appaiano le placche (Figura 4B), ma i tempi variano considerevolmente a seconda delle condizioni di incubazione, del mezzo e delle specie batteriche.

3. Analisi dei dati e risultati

1. Conteggio delle placche
   1. Assicurarsi che non siano visibili placche nelle piastre contrassegnate come "controllo", in quanto ciò indicherebbe una contaminazione virale.
   2. Inizia con le piastre etichettate 10^-6, contenenti il campione di batteriofago più diluito. Conta le placche senza togliere il coperchio, contrassegnandole con una penna mentre vai a indicare quali placche sono già state contate.
   3. Conta i piatti rimanenti. Alcuni piatti possono avere troppo poche o troppe placche da contare. Utilizzare le piastre con 10-150 placche per ulteriori analisi.
2. Calcolo della PFU
   1. Dividere il numero di placche per il fattore di diluizione (es. 10^-6 per il campione più diluito) per raggiungere il numero di unità formanti placche (PFU) in 100 μL di miscela fagica.
      Nota: Se si esegue il test in triplice copia, utilizzare il numero medio di placche dalle tre piastre.
   2. Per determinare la concentrazione (in PFU/mL) del campione originale, moltiplicare per un fattore di diluizione aggiuntivo di 10, poiché sono stati placcati solo 100 μL di campione. (vale a)
   3. Calcola il valore medio del PFU/mL per tutte le diluizioni che avevano tra 10 e 150 placche per ottenere un risultato più affidabile.