Question 1

Che cosa significa che le cellule di E. coli siano competenti?

Accepted Answer

Le cellule competenti di E. coli sono in grado di assorbire molecole di DNA dal loro ambiente. La competenza chimica viene indotta incubando le cellule in una soluzione di cloruro di calcio, che rende la membrana cellulare permeabile al DNA. Questo trattamento permette al DNA con carica negativa di superare la repulsione dalla superficie cellulare batterica anch'essa a carica negativa.

Question 2

Perché è necessario un passaggio di shock termico durante la trasformazione batterica?

Accepted Answer

Il calore a 42 gradi Celsius per 45 secondi spinge il DNA attraverso la parete cellulare batterica e le membrane nelle cellule competenti. Questo cambiamento di temperatura, seguito da un rapido raffreddamento sul ghiaccio, favorisce l'assorbimento del DNA creando uno squilibrio di temperatura che migliora il processo di trasformazione e aumenta l'efficienza.

Question 3

Come fanno i geni di resistenza agli antibiotici ad aiutare nell'identificazione dei batteri trasformati con successo?

Accepted Answer

I plasmidi come pUC19 portano geni di resistenza agli antibiotici che fungono da marcatori selezionabili. Quando i batteri trasformati vengono piastre su terreni selettivi contenenti ampicillina, solo le cellule che hanno acquisito il plasmide sopravvivono ed esprimono il prodotto del gene di resistenza. Le cellule non trasformate non possono sopravvivere su terreni contenenti antibiotici.

Question 4

Qual è lo scopo del calcolo dell'efficienza di trasformazione in questo esperimento?

Accepted Answer

L'efficienza di trasformazione misura quante cellule batteriche riescono ad assorbire con successo il DNA plasmidico per microgramma di DNA utilizzato. Viene calcolata dividendo le colonie-unità di formazione (CFU) contate su piastre selettive per la quantità di DNA impiattato e il fattore di diluizione, fornendo una valutazione quantitativa del successo della procedura di trasformazione.

Question 5

Perché le cellule di E. coli devono essere in fase di crescita medio-esponenziale prima della trasformazione?

Accepted Answer

Le cellule batteriche nella fase di crescita medio-esponenziale sono fisiologicamente abbastanza robuste da resistere al trattamento di shock termico durante la trasformazione. Le cellule in altre fasi di crescita sono troppo sensibili allo stress termico, con conseguente perdita di vitalità e significativa diminuzione dell'efficienza di trasformazione.

Question 6

Come fa la digestione con enzimi di restrizione a confermare la riuscita della trasformazione plasmidica?

Accepted Answer

Dopo aver isolato il DNA plasmidico dalle colonie trasformate, un enzima di restrizione taglia il DNA in posizioni prevedibili. Quando il pUC19 digeribile viene fatto correre su un gel di agarose, produce una singola banda a 2.686 paia di basi, confermando la dimensione del plasmide prevista e verificando la trasformazione di successo del DNA desiderato.

Question 7

Quali diversi stati conformazionali può adottare il DNA plasmidico circolare in un gel?

Accepted Answer

Il DNA plasmidico circolare non tagliato può esistere in molteplici stati conformazionali: superavvolto, circolare aperto o forme più lineari. Ogni conformazione migra attraverso il gel a velocità diverse, facendo sì che la corsia del plasmide non digeribile mostri due o tre bande di diversa luminosità anziché una singola banda.

Trasformazione di cellule di E. coli tramite l'utilizzo di una procedura basata sul metodo del cloruro di calcio - Quiz di valutazione