Coniugazione: un metodo per trasferire la resistenza all'ampicillina dal donatore al ricevente E. coli

Le cellule batteriche, come E. coli, sono in grado di trasferire informazioni genetiche da cellula a cellula. La coniugazione differisce da altri meccanismi di trasferimento del DNA, come la trasduzione o la trasformazione, in quanto richiede il contatto fisico tra le cellule.

Per procedere, la coniugazione richiede una cellula donatrice che esprima il fattore di fertilità, o F, e una cellula ricevente senza di esso, una cellula F meno. Il processo richiede due passaggi. Il primo è l'instaurazione di un contatto diretto da cellula a cellula. Per fare ciò, la cellula donatrice genera una struttura filamentosa extracellulare chiamata pilo sessuale. Si chiama così poiché la coniugazione è una forma di accoppiamento per i batteri che si riproducono asessualmente, ma va notato che non si tratta di una vera riproduzione sessuale in quanto non vengono scambiati gameti e non si forma prole.

Il secondo passo è la consegna del DNA alla cellula ricevente. Dopo che il pilo sessuale stabilisce il contatto tra due cellule, viene costruito un condotto chiamato sistema di secrezione di tipo IV che consente il trasferimento del DNA. La cellula donatrice inizia quindi a replicare il DNA extracromosomico che verrà trasferito, selezionato in base alla presenza di un elemento genetico noto come OriT o origine del trasferimento. Un'estremità del DNA appena replicato viene infilata nel condotto attraverso il legame con la proteina del DNA. Man mano che il DNA viene ulteriormente replicato, viene pompato attraverso il canale, facilitato da un complesso di proteine codificate da geni situati vicino all'OriT. Una volta che il DNA è completamente trasferito, formerà un plasmide cromosomico extra o potrebbe integrarsi nel cromosoma della cellula ricevente. Qualunque sia l'endpoint del DNA trasferito, verranno quindi espressi i geni che codifica. Questa espressione genica può essere utilizzata per confermare il successo della coniugazione.

Ad esempio, si consideri uno scenario in cui il ceppo donatore esprime resistenza all'ampicillina e la trasmette nel DNA coniugato al batterio ricevente, ma il ceppo ricevente ha anche un gene di resistenza alla tetraciclina non presente nel donatore. In questo caso, quando le cellule vengono piastrate su terreni LB contenenti sia tetraciclina che ampicillina, le colonie dovrebbero crescere solo da batteri coniugati con successo, che esprimeranno entrambi i fenotipi di resistenza. Per confermare ulteriormente il successo della coniugazione, il DNA plasmidico di queste colonie può essere raccolto e quindi una sezione di DNA specifica per il plasmide trasferito può essere amplificata utilizzando la reazione a catena della polimerasi, o PCR. Quando il prodotto PCR viene eseguito su un gel per elettroforesi insieme a una scala di dimensioni standard, un frammento di PCR di dimensioni note dovrebbe essere visibile sul gel, confermando ulteriormente l'avvenuta coniugazione. In questo esperimento, un plasmide sarà utilizzato per trasferire il gene di resistenza all'ampicillina tramite coniugazione da un ceppo donatore a un ceppo ricevente resistente alle tetracicline. Successivamente, per confermare la coniugazione, la miscela di coniugazione verrà incubata su una piastra contenente entrambi gli antibiotici, lasciando solo i batteri trasformati. Infine, il successo della coniugazione sarà ulteriormente confermato con la PCR.

Prima di iniziare la procedura, indossare i dispositivi di protezione individuale appropriati, inclusi camice da laboratorio e guanti. Quindi, sterilizzare l'area di lavoro utilizzando etanolo al 70% per pulire la superficie.

In questa procedura, il gene di resistenza all'ampicillina sarà trasferito dal ceppo WM3064 di E. coli al ceppo J53 di E. coli tramite coniugazione. Il ceppo donatore WM3064 è resistente alla tetraciclina e all'ampicillina e richiede acido diaminopimeschico, o DAP, per crescere. Il ceppo ricevente J53 è resistente solo alla tetraciclina e non richiede DAP per crescere. Ciò significa che le cellule coniugate con successo dovrebbero essere resistenti alla tetraciclina e all'ampicillina e possono crescere senza DAP.

Preparare la coltura del ceppo donatore inoculando cinque millilitri di LB contenenti 0,3 millimoli di DAP con uno scarto del ceppo donatore congelato di glicerolo. Quindi, preparare il ceppo ricevente inoculando cinque millilitri di brodo LB senza DAP con uno scarto del ceppo ricevente congelato di glicerolo. Coltiva queste colture durante la notte a 37 gradi Celsius con aerazione e agitazione a 220 giri/min in un'incubatrice agitante. Una volta che le colture sono cresciute fino a un OD 600 di due, rimuovere un millilitro di coltura da ciascuna e posizionarlo in due nuove provette per microcentrifuga separate da 1,5 millilitri. Quindi, centrifugare queste aliquote a 3000 giri/min per cinque minuti per pellettare le cellule batteriche. Scartare il surnatante e lavare ogni pellet con 250 microlitri di 1X PBS. Centrifugare nuovamente i campioni e, dopo aver scartato il surnatante, risospendere ogni pellet in 500 microlitri di PBS.

Per iniziare la procedura di coniugazione, combinare prima 50 microlitri di cellule riceventi con 50 microlitri di cellule donatrici in una provetta da microcentrifuga da 1,5 millilitri e mescolare pipettando delicatamente su e giù. Quindi, pipettare 100 microlitri della coltura cellulare ricevente su un'altra piastra di tetraciclina 1X contenente DAP. Quindi, prepara il tuo controllo negativo pipettando 100 microlitri della sola coltura cellulare ricevente su una piastra di agar non selettiva contenente DAP. Quindi, incubare la coniugazione e le piastre di controllo negativo per una notte a 37 gradi Celsius.

Il giorno successivo, prendi un raschietto cellulare sterile e raccogli le cellule dalla piastra di coniugazione raccogliendo le colonie. Quindi, trasferire le colonie in una provetta da microcentrifuga sterile da 1,5 millilitri contenente un millilitro di 1X PBS. Ripetere questo processo per raccogliere le cellule riceventi dall'altra piastra.

Successivamente, agitare i campioni per mescolare. Dopo la miscelazione, trasferire le provette in una centrifuga per pellettare delicatamente le cellule. Scartare il surnatante, quindi lavare i pellet cellulari in un millilitro di PBS e agitare i tubi per risospendere le cellule. Pellettare nuovamente le celle mediante centrifugazione. Scartare nuovamente il surnatante e risospendere entrambi i pellet cellulari in un millilitro di PBS. Ora, utilizzando un puntale per pipetta sterile, piastrate 100 microlitri della miscela di cellule di reazione di coniugazione su una piastra di agar LB senza DAP contenente 1X tetraciclina e 1X ampicillina. Ripetere il metodo di placcatura utilizzando 100 microlitri di una diluizione di dieci volte della stessa miscela cellulare in PBS su un'altra piastra di agar LB senza DAP contenente 1X tetraciclina e 1X ampicillina.

Infine, pipettare 100 microlitri della miscela di cellule a controllo negativo su una singola piastra di agar LB con solo tetraciclina 1X. Dopo l'incubazione notturna a 37 gradi Celsius, le colonie dovrebbero essere visibili. Utilizzando un puntale per pipetta sterile, prelevare una singola colonia dalla piastra di reazione di coniugazione e aggiungerla a una provetta contenente cinque millilitri di terreno LB selettivo contenente entrambi gli antibiotici. Quindi, ripetere l'isolamento della colonia selezionando una singola colonia dalla piastra cellulare ricevente. Coltiva queste colture durante la notte a 37 gradi Celsius con aerazione a 220 giri/min.

Il giorno successivo, pulire il piano di lavoro con etanolo al 70% e rimuovere le piastre dall'incubatrice. Usa un mini kit di preparazione del DNA per isolare il DNA da 4. 5 millilitri di ogni coltura secondo le istruzioni del produttore. Dopo aver completato la mini preparazione del DNA, eluire il DNA utilizzando 35 microlitri di acqua priva di nucleasi. Infine, usa il restante 0. 5 millilitri di ogni coltura per preparare un millilitro di brodi di glicerolo aggiungendo 0,5 millilitri di glicerolo al 100% per una diluizione uno a uno. Posiziona queste aliquote a meno 80 gradi Celsius per la conservazione fino al momento del bisogno.

Per confermare la riuscita coniugazione mediante PCR, preparare prima una master mix PCR aggiungendo 75 microlitri di master mix PCR 2X a una provetta per microcentrifuga. Quindi, aggiungere 7,5 microlitri ciascuno di un primer in avanti da 10 micromolari e un primer inverso da 10 micromolari progettato per amplificare il gene di resistenza all'ampicillina dal plasmide. Quindi, preparare una seconda master mix PCR aggiungendo 75 microlitri di master mix PCR 2X a una provetta per microcentrifuga e quindi aggiungendo 7,5 microlitri ciascuno di un primer in avanti da 10 micromolari e un primer inverso da 10 micromolari progettati per amplificare un gene di pulizia, in questo caso la DNA girasi B.

Ora, aggiungi 15 microlitri della prima master mix a una provetta per PCR e poi aggiungi 10 nanogrammi, circa due microlitri del DNA sperimentale stampo nella stessa provetta. Portare la reazione fino a un volume finale di 25 microlitri con acqua priva di nucleasi. Ripetere questi passaggi per produrre le cinque reazioni rimanenti, in modo che i tubi contengano i componenti mostrati qui. Ora, trasferisci queste reazioni su un termociclatore con il blocco preriscaldato a 98 gradi Celsius e quindi avvia il programma. Dopo aver completato la PCR, rimuovere le provette dalla macchina. Quindi, caricare due microlitri di ciascuna reazione mescolati con due microlitri di colorante di caricamento e quattro microlitri di un marcatore di peso molecolare in pozzetti consecutivi di un gel di agarosio all'1%. Impostare il gel in modo che funzioni a 150 volt per 20 minuti. Infine, visualizza il gel utilizzando un illuminatore UV.

In questo esperimento, il successo del trasferimento del gene di resistenza all'ampicillina tramite coniugazione è stato confermato tramite PCR. Qui, si dovrebbe osservare una banda di circa 500 paia di basi nel pozzetto contenente i primer coniugati del DNA e dell'ampicillina, ben due in questo esempio. Un gene di pulizia, la DNA girasi B, è stato caricato nei pozzetti tre e cinque con DNA coniugato e DNA della cellula ricevente, rispettivamente. Le bande osservate in questi pozzetti fungono da controllo positivo per garantire che il modello di DNA fosse presente e che la PCR avesse successo. Le bande non devono essere osservate nel pozzetto contenente la reazione per il DNA della cellula ricevente e la coppia di primer dell'ampicillina, ben quattro in questo esempio, perché le cellule riceventi non sono resistenti all'ampicillina. Inoltre, non si dovrebbero osservare bande nelle reazioni prive di DNA stampo, pozzetti sei e sette qui. Se queste condizioni sono soddisfatte, ciò confermerà il successo del trasferimento del gene di resistenza all'ampicillina, conferendo resistenza all'ampicillina dal ceppo WM3064 di E. coli al ceppo J53 di E. coli.