Coniugazione: un metodo per trasferire la resistenza all'ampicillina dal donatore al ricevente E. coli

1. Configurazione

1. Autoclave circa 1L di Luria-Bertani medium (LB). Questo LB sterile sarà utilizzato per produrre circa 5 ml di LB contenente 0,3 mM di acido diaminopimetico (DAP).
2. Raccogliere le seguenti piastre: piastre di agar LB con 1X Tet e 0,3 mM DAP, piastre lb agar con 1X Tet solo e piastre LB agar con solo 1X Amp/Tet.
3. Assicurarsi che un po 'di glicerolo e una scatola di punte di pipette di plastica pre-sterilizzate siano a portata di mano.
4. Prima di iniziare qualsiasi lavoro che coinvolga i microbi, sterilizzare lo spazio di lavoro con il 70% di etanolo. Indossare sempre i dispositivi di protezione individuale necessari, tra cui un camice da laboratorio e guanti.
5. Una volta terminato, sterilizzare tutte le superfici e i guanti con etanolo al 70% e lavarsi le mani.

2. Preparazione del ceppo del donatore e del ricevente

1. Preparare colture batteriche da 5 ml dei ceppi donatori e riceventi e coltivarle durante la notte a 37 °C con aerazione e agitazione a 220 giri/min. Il ceppo donatore deve essere coltivato in LB con 0,3 mM DAP.
2. Girare verso il basso 1 mL di entrambe le colture (~ 3000 rpm per 5 minuti) e lavare le celle con PBS.
3. Spese di sodio delle cellule in 500 μL di soluzione salina tamponata con fosfato (PBS).

3. Coniugazione

1. Combinare 50 μL di cellule riceventi con 50 μL di cellule donatrici in un tubo di microcentrifuga e mescolare mediante pipettaggio.
2. Incubare la miscela cellulare per 1 ora a 37 °C. Ciò migliorerà l'efficienza della coniugazione prima e durante la fase successiva della placcatura.
3. Pipettare 100 μL della miscela cellulare su una piastra di agar con 1X Tet e 0,3 mM DAP. Non stendere sul piatto.
4. Pipettare 100 μL di coltura cellulare ricevente su una piastra di agar con 1X Tet e 0,3 mM DAP. Non stendere sul piatto.
5. Incubare entrambe le piastre durante la notte a 37 °C.
6. Raschiare la miscela cellulare di coniugazione e la coltura cellulare ricevente con un raschietto cellulare sterile. Trasferire le cellule in un tubo microcentrifuga sterile e risospentare le cellule in 1 mL di PBS.
7. Ruotare le celle e ruotarle delicatamente verso il basso (~ 3000 giri / min per 5 minuti).
8. Risuspendare le cellule in 1 mL di PBS.
9. Placcare la miscela di cellule di reazione di coniugazione su una piastra di agar LB con solo 1X Amp/Tet. Su questa piastra, solo i batteri riceventi che hanno ottenuto con successo il gene di resistenza Amp tramite coniugazione dovrebbero crescere.
10. Placcare le cellule riceventi su una piastra di agar LB con solo 1X Tet. Su questa piastra, solo i batteri riceventi non coniugati, che non hanno il gene di resistenza Amp, dovrebbero crescere.
11. Incubare le piastre durante la notte a 37 °C.
12. Prelevare singole colonie da entrambe le piastre e utilizzarle per coltivare colture notturne in 5 ml di mezzi (37 °C con aerazione a 220 giri/min).

4. Isolamento del DNA

1. Isolare il DNA dalle colture precedentemente preparate utilizzando 4,5 ml del volume totale di coltura mediante DNA miniprep.
2. Per fare questo, eluire il DNA usando 35 μL di acqua priva di nucleasi.
3. Il DNA puro genererà un rapporto di assorbanza (A_260/280)di circa 1,8.
4. Utilizzare i restanti 0,5 ml di ciascuna coltura per preparare le scorte di glicerolo facendo una miscela 1: 1 di coltura batterica e glicerolo al 100%.
5. Conservare le scorte congelatrici a -80 °C.

5. Conferma della coniugazione del trasferimento plasmidiale mediante PCR

1. Preparare due master mix PCR, ciascuno con un diverso set di primer avanti e indietro, uno mirato a un segmento di 500 coppie di basi all'interno del gene di resistenza all'ampicillina e l'altro mirato a un segmento all'interno di un gene di pulizia.
   1. I primer genetici di housekeeping sono stati progettati per amplificare un segmento di DNA all'interno del gene batterico che codifica per la DNA girasi B (14).
   2. I seguenti volumi di reagenti sono stati utilizzati per preparare 90 μL di ciascuna miscela master:
      7,5 μL di primer avanti da 10 μM
      7,5 μL di primer inverso da 10 μM
      75 μL di 2X PCR Master Mix
2. Preparare le seguenti sei reazioni PCR utilizzando una miscela master da 15 μL, 10 ng di DNA modello e acqua priva di nucleasi fino a un volume finale di 25 μL.
   Reazione coniugante DNA e ampicillina primer
   DNA di reazione coniugale e primer per la pulizia
   Primer di controllo negativo del DNA e dell'ampicillina
   DNA di controllo negativo e primer per le pulizie
   Senza primer dna e ampicillina
   Nessun DNA e primer per le pulizie
3. Trasferire queste reazioni a una macchina PCR con il blocco preriscaldato a 98 C e iniziare il termociclico nelle seguenti condizioni:
   98 °C per 30 secondi
   25-35 cicli di 98 °C per 5-10 secondi, 45-72 °C per 10-30 secondi e 72 °C per 15-30 secondi per kb
   72 °C per 5-10 minuti
   Tenere a 4 °C
4. Caricare tutte e sei le reazioni PCR su un gel di acarosio all'1% ed eseguire a ~ 150V per circa 20 minuti.
5. Visualizza il prodotto PC utilizzando un illuminatore UV.