La trasduzione batterica tramite fagi: un metodo per trasferire la resistenza all'ampicillina da una cellula donatore di E. coli ad una ricevente

1. Configurazione

1. Prima di iniziare qualsiasi lavoro che coinvolga i microbi, sterilizzare lo spazio di lavoro utilizzando il 70% di etanolo. Utilizzare sempre i DPI necessari (camice da laboratorio e guanti).
2. Assicurarsi che le piastre di agar LB con 1x ampicillina, soluzione di lisato fagico P1 disponibile in commercio, cloroformio, citrato di sodio 1 M, glicerolo e una scatola di punte di pipette di plastica pre-sterilizzate e diffusori di cellule siano a portata di mano.
3. Preparare LB sterile in autoclave e utilizzarlo per produrre tre aliquote da 1 mL di soluzione salina LB.
   1. mM MgCl₂ (952,11-2,3803 μg), 5 mM CaCl₂ (11,098 mg), 0,1-0,2% di glucosio (100-200 μg)
   2. mM MgSO₄ (12,0366 mg), 5 mM CaCl₂ (11,098 mg)
   3. mM citrato di sodio (25,806 mg)
4. Una volta terminato, sterilizzare tutte le superfici e i guanti con etanolo al 70% e lavarsi le mani.

2. Protocollo

1. Preparazione del fago del donatore
   1. Preparare una coltura da 1 mL del ceppo E. coli del donatore W3110 in LB con 1x ampicillina coltivata durante la notte a 37 °C con aerazione e agitazione a 220 giri/min.
   2. Diluire questa coltura notturna 1:100 in 1 mL di LB fresco integrato con 10-25 mM MgCl₂, 5 mM CaCl₂e 0,1-0,2% di glucosio.
   3. Coltivare questa diluizione batterica a 37 °C per 2 ore con aerazione e agitazione a 220 giri/min.
   4. Una volta che queste cellule hanno raggiunto la fase di crescita logaritmica precoce (crescita evidente e leggera torbidità), aggiungere 40 μL di fago P1 disponibile in commercio e lasciare a 37 °C con aerazione e agitazione a 220 giri/min.
      1. Prima dell'aggiunta di fagi, la densità ottica misurata a 600 nm di queste cellule dovrebbe essere di circa 0,4 (6).
   5. Monitorare le cellule per 1-3 ore fino a quando la coltura non è stata lizzate.
      1. La lisi comporterà un aumento dei detriti cellulari e una notevole diminuzione della torbidità (cioè le cellule saranno considerate lizzate una volta che si è in grado di vedere attraverso la coltura).
   6. Aggiungere diverse gocce (50-100 μL) di cloroformio al lisato e mescolare per vortice.
      1. Il cloroformio sterilizza il lisito fagico uccidendo tutte le cellule donatrici rimanenti, lasciando solo fagi e aumentando il titolo di questo lisi.
   7. Centrifugare il lisi a 14.000 giri /min per 2 minuti per rimuovere i detriti e trasferire il surnatante in un tubo fresco.
   8. Aggiungere qualche goccia di cloroformio e conservare a 4 °C per non più di un giorno.
2. Trasduzione
   1. Preparare una coltura da 1 mL del ceppo E. coli J53 ricevente coltivato durante la notte in LB a 37 °C con aerazione e agitazione a 220 giri/min.
   2. Trasferire 100 μL di fago di liscerato di fago donatore (2.1) in un tubo di microfuga da 1,5 ml e incubare con cappuccio aperto a 37 °C per 30 minuti.
      1. Questa incubazione consente a qualsiasi cloroformio rimanente nella soluzione di lisato P1 di evaporare prima di essere aggiunto alle cellule riceventi.
   3. Pellet delicatamente le celle di ceppo ricevente mediante centrifugazione a 6.000 giri /min per 5 minuti.
   4. Spese di sospensione di queste cellule in 300 μL di LB fresco contenente 100 mM MgSO₄ e 5 mM CaCl₂. (Il fago P1 richiede che il calcio sia infettivo).
   5. Impostare due reazioni utilizzando le cellule batteriche riceventi e il fago del donatore preparato lisato: 1) reazione di trasduzione che combina 100 μL ricevente J53 ceppo E. coli e 100 μL donatore fago lisato, e 2) controllo negativo che combina 100 μL ricevente J53 ceppo E. coli e 100 μL di LB contenente 100 mM MgSO₄ e 5 mM CaCl₂.
   6. Incubare a 37 °C per 30 minuti con agitazione a 220 giri/min.
   7. Aggiungere 1 mL LB e 200 μL 1M di citrato di sodio (pH=5,5) e incubare per 1 ora a 37 °C con agitazione a 220 giri/min.
      1. Il citrato viene utilizzato per ridurre l'infettività di P1 chelando con il calcio, prevenendo la lisi dei batteri riceventi.
      2. L'incubazione di questa soluzione consente l'espressione del marcatore di resistenza all'ampicillina.
   8. Celle a pellet per centrifugazione a 6.000 giri/min per 5 minuti.
   9. Pellet di celle spese in 100 μL di LB con 100 mM di citrato di sodio (pH 5,5). Vortice e piastra intera soluzione per entrambe le reazioni su due piastre lb agar.
      1. La piastra LB deve avere 1 Amp per il campione trasdotto e nessun Amp per il controllo negativo.
      2. La contaminazione dei fagi P1 su questa piastra richiede una ri-striatura prima che le scorte del congelatore possano essere preparate.
      3. Se il fago non viene rimosso, le colture coltivate da queste colonie non cresceranno se non in presenza di un chelatore di calcio.
   10. Prelevare circa 3-4 colonie da entrambe le piastre e strisciare di nuovo su due piastre di agar LB distribuite con 100 μL di 1 M di citrato di sodio (pH = 5,5).
       1. La piastra LB deve avere 1 Amp per il campione trasdotto e nessun Amp per il controllo negativo.
   11. Incubare le piastre a 37 °C durante la notte per consentire la crescita di colonie prive di fagi.
   12. Raccogliere colonie da entrambe le piastre e utilizzarle per coltivare colture notturne in 5 ml di LB a 37 °C con aerazione e agitazione a 220 giri/min.
   13. Isolare il DNA da queste colture mediante miniprep del DNA utilizzando 4,5 ml del volume totale della coltura.
       1. Eluire il DNA utilizzando 35 μL di acqua priva di nucleasi.
       2. Misurare la concentrazione risultante mediante Nanodrop. Il DNA puro genererà un rapporto di assorbanza (A_260/280)di circa 1,8.
   14. Utilizzare i restanti 0,5 ml di ciascuna coltura per preparare 1 mL di scorte di glicerolo facendo una miscela 1:1 di glicerolo al 100% e coltura batterica.
   15. Conservare le scorte di glicerolo batterico a -80 °C.

3. Analisi dei dati e risultati

1. Conferma della trasduzione mediante qPCR
   1. Preparare due miscele master qPCR per sei reazioni qPCR, tre utilizzando primer qPCR per il gene di resistenza all'ampicillina e le altre tre utilizzando primer qPCR per un gene di pulizia (14,5 μL per reazione): 12,5 μL di miscela tampone qPCR + 1 μL di primer in avanti + 1 μL di primer inverso.
      1. In questo esperimento, abbiamo usato SYBR Green master mix.
      2. I primer genetici di pulizia sono stati progettati per amplificare un segmento di DNA all'interno del gene batterico che codifica per la DNA girasi B (7).
   2. Per ogni reazione qPCR, combinare 100 μg di DNA da ciascuna reazione (10,5 μL) con 14,5 μL di miscela master qPCR.
   3. Utilizzando una macchina qPCR e il protocollo di termociclizzazione elencato nella Tabella 1, è stata misurata l'amplificazione per la resistenza all'ampicillina e i geni di pulizia per tutte e sei le reazioni.
   4. I valori di Cq generati da qPCR sono stati utilizzati per calcolare l'efficienza di trasduzione normalizzata del gene di resistenza all'ampicillina (Figura 3), confermando il successo della trasduzione del gene di resistenza all'ampicillina.
      1. Il valore Cq, o valore di quantificazione del ciclo, di un campione è il primo numero di ciclo PCR al quale viene rilevato un segnale che supera la soglia di fondo. I valori Cq bassi corrispondono a una sequenza di destinazione maggiore, viceversa.
      2. L'efficienza di trasduzione normalizzata di un gene all'interno di un campione può essere calcolata utilizzando questi valori di Cq sottraendo il valore del gene di pulizia da quello del gene bersaglio, generando un valore ΔCq, che può essere utilizzato per calcolare l'efficienza di trasduzione normalizzata di 2^(-ΔCq).

	Temperatura	Ore
Denaturazione	94 °C	2 minuti
40 cicli:
Denaturazione	94 °C	15 secondi
Ricottura, estensione e fluorescenza letta	60 °C o 5 °C al di sotto del primer Tm più basso	1 min

Tabella 1: Protocollo di termociclica qPCR