6.12: La trasduzione batterica tramite fagi: un metodo per trasferire la resistenza all'ampicillina da una cellula donatore di E. coli ad una ricevente

1. Configurazione

1. Prima di iniziare qualsiasi lavoro che coinvolga i microbi, sterilizzare lo spazio di lavoro utilizzando il 70% di etanolo. Utilizzare sempre i DPI necessari (camice da laboratorio e guanti).
2. Assicurarsi che le piastre di agar LB con 1x ampicillina, soluzione di lisato fagico P1 disponibile in commercio, cloroformio, citrato di sodio 1 M, glicerolo e una scatola di punte di pipette di plastica pre-sterilizzate e diffusori di cellule siano a portata di mano.
3. Preparare LB sterile in autoclave e utilizzarlo per produrre tre aliquote da 1 mL di soluzione salina LB.
   1. mM MgCl₂ (952,11-2,3803 μg), 5 mM CaCl₂ (11,098 mg), 0,1-0,2% di glucosio (100-200 μg)
   2. mM MgSO₄ (12,0366 mg), 5 mM CaCl₂ (11,098 mg)
   3. mM citrato di sodio (25,806 mg)
4. Una volta terminato, sterilizzare tutte le superfici e i guanti con etanolo al 70% e lavarsi le mani.

2. Protocollo

1. Preparazione del fago del donatore
   1. Preparare una coltura da 1 mL del ceppo E. coli del donatore W3110 in LB con 1x ampicillina coltivata durante la notte a 37 °C con aerazione e agitazione a 220 giri/min.
   2. Diluire questa coltura notturna 1:100 in 1 mL di LB fresco integrato con 10-25 mM MgCl₂, 5 mM CaCl₂e 0,1-0,2% di glucosio.
   3. Coltivare questa diluizione batterica a 37 °C per 2 ore con aerazione e agitazione a 220 giri/min.
   4. Una volta che queste cellule hanno raggiunto la fase di crescita logaritmica precoce (crescita evidente e leggera torbidità), aggiungere 40 μL di fago P1 disponibile in commercio e lasciare a 37 °C con aerazione e agitazione a 220 giri/min.
      1. Prima dell'aggiunta di fagi, la densità ottica misurata a 600 nm di queste cellule dovrebbe essere di circa 0,4 (6).
   5. Monitorare le cellule per 1-3 ore fino a quando la coltura non è stata lizzate.
      1. La lisi comporterà un aumento dei detriti cellulari e una notevole diminuzione della torbidità (cioè le cellule saranno considerate lizzate una volta che si è in grado di vedere attraverso la coltura).
   6. Aggiungere diverse gocce (50-100 μL) di cloroformio al lisato e mescolare per vortice.
      1. Il cloroformio sterilizza il lisito fagico uccidendo tutte le cellule donatrici rimanenti, lasciando solo fagi e aumentando il titolo di questo lisi.
   7. Centrifugare il lisi a 14.000 giri /min per 2 minuti per rimuovere i detriti e trasferire il surnatante in un tubo fresco.
   8. Aggiungere qualche goccia di cloroformio e conservare a 4 °C per non più di un giorno.
2. Trasduzione
   1. Preparare una coltura da 1 mL del ceppo E. coli J53 ricevente coltivato durante la notte in LB a 37 °C con aerazione e agitazione a 220 giri/min.
   2. Trasferire 100 μL di fago di liscerato di fago donatore (2.1) in un tubo di microfuga da 1,5 ml e incubare con cappuccio aperto a 37 °C per 30 minuti.
      1. Questa incubazione consente a qualsiasi cloroformio rimanente nella soluzione di lisato P1 di evaporare prima di essere aggiunto alle cellule riceventi.
   3. Pellet delicatamente le celle di ceppo ricevente mediante centrifugazione a 6.000 giri /min per 5 minuti.
   4. Spese di sospensione di queste cellule in 300 μL di LB fresco contenente 100 mM MgSO₄ e 5 mM CaCl₂. (Il fago P1 richiede che il calcio sia infettivo).
   5. Impostare due reazioni utilizzando le cellule batteriche riceventi e il fago del donatore preparato lisato: 1) reazione di trasduzione che combina 100 μL ricevente J53 ceppo E. coli e 100 μL donatore fago lisato, e 2) controllo negativo che combina 100 μL ricevente J53 ceppo E. coli e 100 μL di LB contenente 100 mM MgSO₄ e 5 mM CaCl₂.
   6. Incubare a 37 °C per 30 minuti con agitazione a 220 giri/min.
   7. Aggiungere 1 mL LB e 200 μL 1M di citrato di sodio (pH=5,5) e incubare per 1 ora a 37 °C con agitazione a 220 giri/min.
      1. Il citrato viene utilizzato per ridurre l'infettività di P1 chelando con il calcio, prevenendo la lisi dei batteri riceventi.
      2. L'incubazione di questa soluzione consente l'espressione del marcatore di resistenza all'ampicillina.
   8. Celle a pellet per centrifugazione a 6.000 giri/min per 5 minuti.
   9. Pellet di celle spese in 100 μL di LB con 100 mM di citrato di sodio (pH 5,5). Vortice e piastra intera soluzione per entrambe le reazioni su due piastre lb agar.
      1. La piastra LB deve avere 1 Amp per il campione trasdotto e nessun Amp per il controllo negativo.
      2. La contaminazione dei fagi P1 su questa piastra richiede una ri-striatura prima che le scorte del congelatore possano essere preparate.
      3. Se il fago non viene rimosso, le colture coltivate da queste colonie non cresceranno se non in presenza di un chelatore di calcio.
   10. Prelevare circa 3-4 colonie da entrambe le piastre e strisciare di nuovo su due piastre di agar LB distribuite con 100 μL di 1 M di citrato di sodio (pH = 5,5).
       1. La piastra LB deve avere 1 Amp per il campione trasdotto e nessun Amp per il controllo negativo.
   11. Incubare le piastre a 37 °C durante la notte per consentire la crescita di colonie prive di fagi.
   12. Raccogliere colonie da entrambe le piastre e utilizzarle per coltivare colture notturne in 5 ml di LB a 37 °C con aerazione e agitazione a 220 giri/min.
   13. Isolare il DNA da queste colture mediante miniprep del DNA utilizzando 4,5 ml del volume totale della coltura.
       1. Eluire il DNA utilizzando 35 μL di acqua priva di nucleasi.
       2. Misurare la concentrazione risultante mediante Nanodrop. Il DNA puro genererà un rapporto di assorbanza (A_260/280)di circa 1,8.
   14. Utilizzare i restanti 0,5 ml di ciascuna coltura per preparare 1 mL di scorte di glicerolo facendo una miscela 1:1 di glicerolo al 100% e coltura batterica.
   15. Conservare le scorte di glicerolo batterico a -80 °C.

3. Analisi dei dati e risultati

1. Conferma della trasduzione mediante qPCR
   1. Preparare due miscele master qPCR per sei reazioni qPCR, tre utilizzando primer qPCR per il gene di resistenza all'ampicillina e le altre tre utilizzando primer qPCR per un gene di pulizia (14,5 μL per reazione): 12,5 μL di miscela tampone qPCR + 1 μL di primer in avanti + 1 μL di primer inverso.
      1. In questo esperimento, abbiamo usato SYBR Green master mix.
      2. I primer genetici di pulizia sono stati progettati per amplificare un segmento di DNA all'interno del gene batterico che codifica per la DNA girasi B (7).
   2. Per ogni reazione qPCR, combinare 100 μg di DNA da ciascuna reazione (10,5 μL) con 14,5 μL di miscela master qPCR.
   3. Utilizzando una macchina qPCR e il protocollo di termociclizzazione elencato nella Tabella 1, è stata misurata l'amplificazione per la resistenza all'ampicillina e i geni di pulizia per tutte e sei le reazioni.
   4. I valori di Cq generati da qPCR sono stati utilizzati per calcolare l'efficienza di trasduzione normalizzata del gene di resistenza all'ampicillina (Figura 3), confermando il successo della trasduzione del gene di resistenza all'ampicillina.
      1. Il valore Cq, o valore di quantificazione del ciclo, di un campione è il primo numero di ciclo PCR al quale viene rilevato un segnale che supera la soglia di fondo. I valori Cq bassi corrispondono a una sequenza di destinazione maggiore, viceversa.
      2. L'efficienza di trasduzione normalizzata di un gene all'interno di un campione può essere calcolata utilizzando questi valori di Cq sottraendo il valore del gene di pulizia da quello del gene bersaglio, generando un valore ΔCq, che può essere utilizzato per calcolare l'efficienza di trasduzione normalizzata di 2^(-ΔCq).

Tabella 1: Protocollo di termociclica qPCR

I batteri possono adattarsi rapidamente a un ambiente in rapida evoluzione scambiando materiale genetico e un modo per farlo è attraverso la trasduzione, lo scambio di materiale genetico mediato da virus batterici. Un batteriofago, spesso abbreviato in fago, è un tipo di virus che infetta i batteri attaccandosi prima alla superficie dell'ospite e poi iniettando il suo DNA nella cellula batterica. Quindi degrada il DNA della cellula ospite e replica il suo genoma virale, dirottando il macchinario della cellula per sintetizzare molte copie delle sue proteine. Queste proteine fagiche quindi si autoassemblano e impacchettano i genomi dei fagi per formare una progenie multipla. Tuttavia, a causa della bassa fedeltà del meccanismo di impacchettamento del DNA, occasionalmente il fago impacchetta frammenti di DNA batterico nel capside del fago. Dopo aver indotto la lisi dell'ospite, la progenie del fago viene rilasciata e, una volta che tale fago infetta un'altra cellula ospite, trasferisce il frammento di DNA del suo ospite precedente. Questo può quindi ricombinarsi e diventare permanentemente incorporato nel cromosoma del nuovo ospite, mediando così il trasferimento genico tra i due batteri.

Per effettuare la trasduzione dei fagi in laboratorio è necessario un ceppo donatore che contenga un gene di interesse, un ceppo ricevente che ne sia privo, un fago che possa infettare entrambi i ceppi e un metodo per selezionare i batteri trasdotti. Nella maggior parte dei casi, si tratta di un mezzo di crescita solido selettivo che supporta la crescita dei batteri trasdotti ma inibisce la crescita di quelli non trasdotti. Per iniziare, il ceppo donatore che contiene il gene di interesse viene coltivato in un terreno di coltura liquido. Quando tutti i batteri si dividono attivamente nella fase logaritmica della loro crescita, la coltura viene inoculata con il fago bersaglio. Dopo tre o quattro ore di incubazione, quando quasi tutti i batteri hanno lisinato e rilasciato le particelle di fago, il lisato di fago donatore viene inoculato in una coltura appena coltivata del ceppo batterico ricevente. Dopo una breve incubazione di un'ora, la coltura dovrebbe ora contenere una miscela di cellule batteriche trasdotte e non trasdotte e questa viene sottoposta a screening per le cellule trasdotte distribuendo una frazione della sospensione su un appropriato terreno di crescita solido selettivo. Dopo un'ulteriore incubazione, le cellule trasdotte dovrebbero crescere e moltiplicarsi per produrre colonie visibili. Queste colonie possono quindi essere selezionate per ulteriori analisi utilizzando una varietà di metodi per confermare ulteriormente il successo della trasduzione, come la PCR delle colonie, il sequenziamento del DNA o la PCR quantitativa.

Prima di iniziare la procedura, indossare tutti i dispositivi di protezione individuale appropriati, inclusi camice da laboratorio e guanti. Quindi, sterilizzare l'area di lavoro con etanolo al 70% e pulire la superficie.

Successivamente, preparare tre aliquote da un millilitro di soluzione salina LB. Ora, prepara una coltura del ceppo donatore aggiungendo 100 microlitri di E. coli a una fiala conica da 15 millilitri contenente cinque millilitri di terreno di crescita LB con 500 microgrammi di ampicillina. Quindi, coltiva la coltura durante la notte a 37 gradi Celsius con aerazione e agitazione a 220 giri/min. Il giorno successivo, pulire il piano di lavoro con etanolo al 70% prima di rimuovere la coltura dall'incubatrice a scuotimento. Successivamente, diluire la coltura notturna da uno a 100 aggiungendo 10 microlitri di ceppo donatore a 990 microlitri di LB fresco integrato con soluzione salina.

Lasciare che la diluizione batterica cresca a 37 gradi Celsius per due ore con aerazione e agitazione a 220 giri/min. Una volta che le cellule hanno raggiunto la fase iniziale di log, rimuovere la coltura dall'incubatore, aggiungere 40 microlitri di fago P1 alla coltura e incubare nuovamente. Continuare a monitorare le cellule per una o tre ore fino a quando la coltura non si è lisata. Quindi, aggiungere da 50 a 100 microlitri di cloroformio al lisato e mescolare a vortici. Quindi, centrifugare il lisato per rimuovere i detriti e trasferire il surnatante in una nuova provetta. Aggiungere alcune gocce di cloroformio al surnatante e conservarlo a quattro gradi Celsius per non più di un giorno.

Per iniziare la procedura di trasduzione, ottenere una coltura di un millilitro di ceppo ricevente. Quindi, trasferire 100 microlitri di lisato di fagi donatori in una provetta da microcentrifuga da 1,5 millilitri e incubarla a 37 gradi Celsius con il tappo aperto per 30 minuti per consentire l'evaporazione del cloroformio rimasto. Mentre il lisato di fagi donatore incuba, pellettare le cellule di ceppo riceventi mediante centrifugazione delicata. Scartare il surnatante e risospendere il pellet cellulare in 300 microlitri di LB fresco contenente 100 millimolari di solfato di magnesio e cinque millimolari di cloruro di calcio.

Successivamente, impostare la reazione di trasduzione combinando 100 microlitri del ceppo ricevente e 100 microlitri del lisato del fago donatore in una provetta da microcentrifuga. Quindi, impostare il controllo negativo combinando 100 microlitri del ceppo ricevente e 100 microlitri del LB con solfato di magnesio e cloruro di calcio. Dopo l'incubazione, aggiungere 200 microlitri di citrato di sodio molare e un millilitro di LB a entrambe le provette e mescolare pipettando delicatamente su e giù. Quindi, dopo che le provette sono state incubate per un'ora, pellettare delicatamente le cellule mediante centrifugazione.

Dopo la centrifugazione, scartare il surnatante e risospendere le cellule pellettate in 100 microlitri di LB con 100 millimolari di citrato di sodio. Agitare le soluzioni e pipettare l'intero campione trasdotto su una piastra di agar LB con ampicillina 1X. Infine, pipettare l'intero volume della miscela di cellule di controllo negative su una piastra di agar LB senza ampicillina. Dopo aver incubato le piastre per una notte a 37 gradi Celsius, utilizzare una punta di pipetta sterile per prelevare da tre a quattro colonie dalla piastra di trasduzione e strisciarle su una nuova piastra di agar LB contenente 1X ampicillina e 100 microlitri di citrato di sodio molare. Ripetere questo metodo di placcatura per il controllo negativo su un'altra piastra di agar LB contenente solo 100 microlitri di citrato di sodio molare. Quindi, incubare le piastre a 37 gradi Celsius durante la notte per consentire la crescita di colonie prive di fagi.

Il giorno successivo, pulire il piano di lavoro con etanolo al 70% prima di rimuovere le piastre dall'incubatrice. Utilizzando un puntale per pipetta sterile, prelevare tre colonie dalla piastra di trasduzione e aggiungerle ciascuna in una provetta separata contenente cinque millilitri di terreno LB. Quindi, selezionare tre colonie dalla piastra di controllo negativa e aggiungerle a un'altra provetta contenente cinque millilitri di terreno LB. Coltiva le colture durante la notte a 37 gradi Celsius con aerazione e agitazione a 220 giri/min. Dopo aver sterilizzato il piano di lavoro come precedentemente dimostrato, utilizzare un kit di miniprep del DNA per isolare il DNA da 4,5 millilitri di ciascuna coltura secondo le istruzioni del produttore. Quindi, eluire il DNA con 35 microlitri di acqua priva di nucleasi e misurare la concentrazione risultante con uno spettrofotometro da laboratorio. Infine, preparare le scorte di glicerolo aggiungendo i restanti 0,5 millilitri di entrambe le soluzioni batteriche a 0,5 millilitri di glicerolo al 100%.

Per confermare la trasduzione, preparare prima due miscele master qPCR per 24 reazioni qPCR. Per la prima master mix, aggiungere 150 microlitri di miscela tampone qPCR a una provetta per microcentrifuga e 12 microlitri ciascuno di un primer diretto e inverso progettato per amplificare il gene di resistenza all'ampicillina. Successivamente, preparare una seconda master mix qPCR aggiungendo 150 microlitri di master mix qPCR a una provetta da microcentrifuga e quindi aggiungendo 12 microlitri ciascuno di un primer diretto e un primer inverso progettati per amplificare un gene di pulizia.

Per ogni reazione qPCR, combinare 100 microgrammi di DNA sperimentale da ciascuna reazione con 14,5 microlitri di master mix qPCR. Ora, prepara le reazioni rimanenti come precedentemente dimostrato. Trasferire le reazioni su un termociclatore preriscaldato a 94 gradi Celsius e quindi avviare il programma. Infine, utilizzare i valori di quantificazione del ciclo, o Cq, generati dalla qPCR per calcolare l'efficienza di trasduzione normalizzata del gene di resistenza all'ampicillina.

I valori di quantificazione del ciclo, o Cq, per i geni di interesse sono stati tabulati per ciascuno dei controlli negativi e dei campioni trasdotti. Valori Cq bassi, tipicamente inferiori a 29 cicli, come i campioni trasdotti in questo esempio, indicano quantità elevate della sequenza target.

Un gene di pulizia, anch'esso qui tabulato, viene utilizzato come controllo di carico per normalizzare la quantità di DNA in ogni reazione e come controllo positivo per garantire che la qPCR funzioni. A condizione che vengano caricate le stesse quantità del gene housekeeping, si trova relativamente alla stessa velocità in ogni campione.

Successivamente, per calcolare il valore delta Cq per ciascun campione, sottrarre il valore Cq del gene housekeeping per ciascun campione dal valore Cq del gene bersaglio corrispondente. Ad esempio, il delta Cq del primo controllo negativo è 13,54. Quindi, utilizzare questo valore per calcolare l'efficienza di trasduzione normalizzata di ciascun campione utilizzando la formula mostrata qui. Infine, è possibile calcolare l'efficienza di trasduzione media normalizzata per ciascun gruppo di campioni.