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Tipicamente, con i nuovi mRNA è nota solo una parte della sua sequenza completa. Le sequenze nucleotidiche mancanti alle estremità dell'mRNA possono essere determinate utilizzando un metodo basato sulla PCR chiamato Rapid Amplification of cDNA Ends, o RACE.
Negli eucarioti, gli mRNA maturi hanno caratteristiche strutturali distintive ad entrambe le estremità. All'estremità a cinque primi, la maggior parte ha un residuo di guanosina metilata collegato all'mRNA tramite un legame trifosfato da cinque a cinque primi. Questo è anche noto come limite a cinque numeri primi. All'estremità dei tre primi, la maggior parte degli eucarioti ha una coda da 20 a 250 residui di adenilato, chiamata coda di poli(A).
Ora, se la sequenza nucleotidica anche di un piccolo segmento è nota in qualsiasi punto all'interno dell'mRNA, la sequenza fino alla sua estremità a tre primi può essere amplificata utilizzando un primer specifico per il gene e un primer oligo(dT) non specifico che si ricottura alla coda di poli(A) all'estremità a tre primi. Questo sottoinsieme della tecnica RACE è chiamato RACE a tre numeri primi e consente il rilevamento di varianti di trascrizione e diverse regioni non tradotte a tre numeri primi, o UTR.
La sequenza all'estremità dei cinque numeri primi può essere amplificata in modo simile. Per fare ciò, una coda di poli(A) viene prima attaccata all'estremità dei cinque primi. Quindi, utilizzando un primer oligo(dT) non specifico che ricottura alla coda aggiunta e un primer specifico per il gene, la sequenza fino all'estremità a cinque primi può essere amplificata. Questo sottoinsieme di RACE è noto come RACE a cinque numeri primi e viene utilizzato per trovare varianti di giunzione differenziali a cinque numeri primi e UTR alternative a cinque numeri primi.
Per eseguire RACE a tre numeri primi per identificare diversi trascritti codificati da un dato gene, l'RNA viene prima isolato dall'organismo o dal tessuto di interesse. Successivamente, il cDNA viene sintetizzato dagli mRNA isolati con una reazione di trascrizione inversa che utilizza un primer oligo(dT) e un enzima trascrittasi inversa, che genera DNA complementare da un modello di RNA. Successivamente, dal pool di cDNA generato, l'estremità a tre primi sconosciuta del cDNA bersaglio viene estesa tramite PCR, utilizzando il primer oligo(dT) non specifico e un primer specifico per il gene, e amplificata durante la reazione di PCR.
Tuttavia, a causa della natura generica del primer non specifico e del dispriming casuale da parte del primer specifico del gene, possono ricottura in cDNA fuori bersaglio, causandone anche l'amplificazione. Per ovviare a questo problema, viene condotto un secondo ciclo di PCR utilizzando primer nidificati, che si legano a valle del primo set di primer. Questa seconda serie di primer amplifica ulteriormente il cDNA di interesse ma non il prodotto non specifico, aumentando la specificità e la resa della reazione.
Infine, i prodotti della PCR vengono separati mediante elettroforesi su gel di agarosio, che separa diversi trascritti del gene bersaglio in base alle loro dimensioni, producendo bande distinte. La banda di interesse può quindi essere asportata, purificata e infine sequenziata per ottenere la sequenza completa del trascritto.
In questo video, dimostreremo la tecnica RACE a tre prime per identificare e isolare diversi trascritti codificati dal gene Drosophila dSmad2.
Prima di iniziare la sintesi e l'amplificazione del cDNA, utilizzare un software di progettazione di primer per creare un primer specifico a cinque numeri primi per il gene di interesse, dSmad2 in questo esempio. Per garantire che il primer sia altamente specifico, dovrebbe essere di circa 24 nucleotidi e avere una Tm compresa tra 55 e 65 gradi Celsius. Successivamente, progetta un secondo primer nidificato situato a tre numeri primi del primo primer, anch'esso specifico per la sequenza target.
Per iniziare, estrai l'RNA da 10 mosche adulte intere con un kit di estrazione dell'RNA disponibile in commercio. Una volta estratto l'RNA, risospendere il pellet in 20 microlitri di acqua priva di nucleasi. Per una reazione da 50 microlitri, aggiungere 5 microlitri del tampone di reazione a ciascuna provetta del campione e aumentare il volume della reazione aggiungendo 24 microlitri di acqua priva di nucleasi. Quindi, aggiungere 1 microlitro di DNasi I per prevenire l'amplificazione del DNA genomico. Infine, incubare i campioni a 37 gradi Celsius per 15 minuti.
Dopo il trattamento con DNasi, inattivare l'enzima con 1 microlitro di EDTA da 25 millimolari in ciascuna delle provette. Aggiungere il campione a una colonna di rotazione per purificare l'RNA. Successivamente, utilizzare uno spettrofotometro a microvolumi per misurare la concentrazione di RNA. Regolare la concentrazione a 100 nanogrammi per microlitro aggiungendo acqua priva di nucleasi.
Ora, prepara una miscela master per la reazione di trascrizione inversa. Oltre ai campioni di DNA del test, includere un controllo negativo omettendo la trascrittasi inversa dalla provetta appropriata. Incubare le reazioni per 90 minuti a 42 gradi Celsius. Quindi, inattivare la trascrittasi inversa incubando le provette a 85 gradi Celsius per cinque minuti. Successivamente, diluire i livelli di DNA aggiungendo 80 microlitri di tampone TE a ciascuna provetta per portare il totale della reazione a 100 microlitri.
Ora che il cDNA è sintetizzato, amplificare il gene di interesse tramite PCR. Per fare ciò, preparare prima la miscela PCR di amplificazione del primo ciclo. Oltre al modello di cDNA, includere una reazione di controllo negativo che utilizza il modello del prodotto non trascritto inversamente, nonché una reazione che non ha il primer specifico del gene come controllo senza primer.
Una volta preparate le reazioni, eseguire le amplificazioni PCR in un termociclatore dotato di coperchio riscaldato. Successivamente, diluire i prodotti da 1 a 20 aggiungendo 1 microlitro di prodotti PCR a 19 microlitri di tampone TE. Utilizzando questi prodotti diluiti, preparare la miscela di PCR di amplificazione del secondo ciclo. Quindi, utilizzare un termociclatore per eseguire la seconda PCR.
Per isolare i frammenti della PCR, preparare un gel di agarosio all'1% aggiungendo 1 grammo di agarosio per 100 millilitri di tampone TAE. Sciogliere il composto per due minuti nel microonde, quindi aggiungere la macchia SYBR Safe o il bromuro di etidio. Versare il composto fuso in una vaschetta di gel e lasciarlo solidificare.
Mentre il gel si solidifica, pipettare 1 microlitro di goccioline di colorante di caricamento 6X su un pezzo di parafilm corrispondente al numero di campioni. Aggiungere 5 microlitri di campione a ciascuna gocciolina. Ora, caricare i campioni, insieme a una scala di DNA da 1 kilobase, sul gel. Far scorrere il gel a 120 volt per circa 45 minuti o fino a quando il fronte del colorante non è al 75% del gel.
Quando il gel ha terminato di funzionare, controllare le bande di gel sotto un transilluminatore UV. Individua le bande e ritagliale usando un bisturi. Purificare i frammenti di cDNA utilizzando un kit di colonne di spin disponibile in commercio. Una volta purificati, i frammenti di cDNA possono essere conservati a meno 20 gradi Celsius o utilizzati immediatamente per ulteriori analisi.
Prima di questo esperimento, due trascritti per Drosophila dSmad2 sono stati annotati nel database genomico di Drosophila, FlyBase. Sulla base dello splicing previsto di questo gene, due prodotti dovrebbero essere identificati dal protocollo RACE a tre prime.
I risultati di questo esperimento, tuttavia, rivelano tre diverse trascrizioni per dSmad2. Tra i prodotti previsti, una trascrizione è predominante e l'altra è espressa a un livello inferiore. Inoltre, è stato rilevato un prodotto più piccolo precedentemente non descritto, visibile a 750 coppie di basi.
