Amplificazione rapida delle estremità del cDNA

1. Configurazione dell'esperimento per 3' RACE

1. Progettare un primer specifico da 5' per un gene di interesse (gene specific primer 1, GSP-1). Deve essere altamente specifico, in quanto è l'unico primer che introduce specificità. Pertanto, sarebbe preferibile un primer relativamente lungo (lunghezza tipica intorno a 24 nucleotidi, Tm che va da 55-65 ° C).
2. Progettare un secondo primer nidificato (GSP-2), ovvero il primer dovrebbe trovarsi a 3' di GSP-1. Questo passaggio è facoltativo, ma l'esecuzione di una seconda PCR con un primer nidificato aumenterà la resa e la specificità della PCR per il gene di interesse. I primer utilizzati per amplificare i cDNA dSmad2 sono elencati nella Tabella 2.

2. Sintesi del cDNA

1. Estrarre l'RNA dai campioni, utilizzando un metodo di estrazione dell'RNA o un kit seguendo il protocollo del produttore. Trattare i campioni con DNasi per evitare l'amplificazione del DNA genomico. Nel nostro esempio, abbiamo estratto l'RNA da 10 mosche adulte intere.
2. Misurare la concentrazione di RNA utilizzando uno spettrofotometro a microvolume e regolare con acqua priva di RNasi fino a un massimo di 100 ng/μl, se necessario.
3. Preparare il cDNA in una reazione di trascrizione inversa (RT), utilizzando un kit consigliato per RACE. Preparare una miscela principale, con i seguenti reagenti per campione:
   - 4 μl Buffer di trascrizione inversa (5x)
   - 2 μl Oligo(dT)₂₀ primer (un oligo costituito da 20 desossitimidine)
   - 10 μl RNA (max. 1 μg)
   - 3 μl ddH₂O
   - 1 μl di trascrittasi inversa
   - TOTALE: 20 μl
4. Incubare la reazione per 90 minuti a 42ºC. Includere un controllo negativo omettendo la trascrittasi inversa.
5. Inattivare la trascrittasi inversa incubando a 85ºC per 5 min.
6. Al fine di diluire i livelli di DNA per una PCR efficiente, aggiungere un tampone TE da 80 μl per portare il volume totale a 100 μl.

3. Amplificazione di frammenti di cDNA

1. Preparare la miscela PCR di amplificazione del primo turno utilizzando una Taq polimerasi ad alta fedeltà (HF):
   - Tampone 4 μl 5x HF Taq polimerasi
   - 0,4 μl di miscela dNTP (10 mM ciascuno)
   - 1 μl di primer GSP1 (10 μM)
   - 1 μl di primer Oligo(dT)20 (10 μM)
   - Modello cDNA da 1 μl
   - 0,2 μl HF Taq DNA polimerasi
   - 12,4 μl ddH2O
   - Totale: 20 μl
2. Eseguire la PCR utilizzando il programma PCR1 (Tabella 1). Includere un controllo negativo utilizzando come modello il prodotto RNA originale senza RT. Inoltre, può essere incluso un controllo "no primer".
3. Opzionale: PCR nidificata per aumentare la specificità e la quantità di prodotti a cDNA. Diluire 1 μl dei prodotti PCR e controllo negativo 1:20 nel tampone TE. Usali come modello per le seconde reazioni PCR:
   - Tampone 4 μl 5x HF Taq polimerasi
   - 0,4 μl di miscela dNTP (10 mM ciascuno)
   - 1 μl di primer GSP2 (10 μM)
   - 1 μl Oligo(dT)₂₀ primer (10 μM)
   - Modello di prodotto PCR da 1 μl
   - 0,2 μl HF Taq DNA polimerasi
   - 12,4 μl ddH2O
   - Totale: 20 μl
4. Eseguire la seconda PCR utilizzando il programma PCR2 (Tabella 1)

4. Isolamento di frammenti di cDNA

1. Preparare un gel di agarose all'1-2% con tampone TAE, usando bromuro di etidio o una colorazione di DNA alternativa.
2. Miscelare 5 μl di campione con 1 μl di 6x tampone di carico del gel.
3. Caricare i campioni e la scala del DNA da 1kb come marcatore ed eseguire il gel a 120 V per circa 45 minuti o fino a quando il fronte del colorante è ~ 75% della strada lungo il gel. Assicurarsi che i campioni non si esauriscano dal gel.
4. Controllare le bande di gel sotto una lampada UV. Per l'ulteriore lavorazione dei prodotti, utilizzare UV a bassa intensità, individuare le bande amplificate e tagliarle dal gel usando un bisturi.
5. Purificare il DNA dal gel utilizzando un metodo come il congelamento o un kit.
6. Conservare i frammenti di cDNA purificati a -20ºC o utilizzarli immediatamente per ulteriori applicazioni, come il sequenziamento o la clonazione.