Analisi di espressione genica da comunità microbiche marine utilizzando Trascrittomica Ambientale

Questa procedura inizia con l'acquisizione della biomassa microbica marina da campioni d'acqua mediante prefiltrazione attraverso filtri a cinque e tre micrometri, seguita dalla raccolta su un filtro da 0,22 micrometri. L'RNA totale viene quindi estratto dagli organismi trattenuti sul filtro da 0,22 micrometri. Il nostro RNA viene rimosso dall'RNA totale mediante degradazione enzimatica selettiva e ibridazione sottrattiva arricchita Il Mr.N viene amplificato linearmente tramite la coda poliA e la trascrizione in vitro.

L'RNA antisenso amplificato viene quindi convertito in CD NA a doppio filamento utilizzando un esamero casuale. Il CD NA risultante può essere clonato e sequenziato o direttamente pirosequenziato. Ciao, sono Rachel Persky del laboratorio della dottoressa Marianne Moran presso il Dipartimento di Scienze Marine dell'Università della Georgia.

Oggi vi mostreremo una procedura per osservare l'espressione genica da campioni ambientali. Utilizzo della metatrascrittomica ambientale. Scott Gifford vi mostrerà come elaborare campioni ambientali per la raccolta dell'RNA.

Ti mostrerò come estrarre l'RNA dai campioni e dai RIN di Johanna. AON dimostrerà la rimozione dell'RNA. Maria Kosta passerà quindi attraverso le fasi di amplificazione dell'RNA e sintesi del CD NA.

Quindi iniziamo. Per iniziare la raccolta dell'RNA ambientale, abbiamo impostato il sistema della linea di filtraggio posizionando un'estremità del tubo nell'acqua alla profondità desiderata per il campionamento e collegando l'estremità opposta a un filtro da tre micrometri ad alto volume posizionando la pompa tra le due estremità del tubo. Il filtro da tre micrometri viene quindi collegato alla torre del filtro da 0,22 micrometri e il deflusso viene diretto dalla torre da 0,22 micrometri in un carico graduato.

Far scorrere diversi litri d'acqua attraverso il sistema per risciacquare. Al termine, rimuovere il tubo dall'acqua mentre la pompa è in funzione per spurgare l'acqua rimanente dalla linea. Quindi, utilizzare un paio di pinze per posizionare un filtro da 0,22 micrometri sulla torre del filtro e chiuderlo.

Rimetti l'estremità del filo nell'acqua e accendi la pompa. Consentire lo spurgo dell'aria da entrambi i filtri e monitorare il volume dell'acqua filtrata con il pulsante sulla damigiana. Una volta filtrato il volume desiderato, rimuovere la linea dall'acqua e far uscire l'acqua rimanente dall'impianto.

Non appena il filtro è asciutto, rimuovere rapidamente la piastra filtrante superiore e piegare la carta da filtro. Posizionare il filtro in un vortice e congelare a scatto in azoto liquido. Prima di iniziare l'esperimento, è importante notare che, poiché gli RNA sono ubiquitari e gli mRNA si degradano rapidamente, è necessario seguire le precauzioni standard per lavorare in un ambiente privo di ribonucleasi, comprese le superfici di lavoro e le pipette.

Con questo in mente, è necessario indossare guanti puliti quando si maneggiano i materiali utilizzati in questa procedura. E i campioni dovrebbero essere elaborati nel più breve tempo possibile. Per iniziare l'estrazione dell'RNA totale dal filtro da 0,22 micrometri, prepariamo provette per beading aggiungendo otto millilitri di tampone RLT con beta meto etanolo aggiunto a una provetta conica da 50 millilitri.

Quindi vengono aggiunti uno o due millilitri di perle di RNA da un kit mobile di estrazione del suolo. Togliete rapidamente il filtro congelato dal freezer e conservatelo nella confezione del mondo. Frangilo con un martello.

Aggiungere il filtro frantumato al tubo conico da 50 millilitri preparato e sigillare il coperchio del tubo con profumo o nastro adesivo da laboratorio a vortice per 10 minuti. Quindi centrifugare la provetta da 50 millilitri a 5.000 giri/min per un minuto. A temperatura ambiente, rimuovere quanto più lisato possibile e trasferirlo in una provetta da 15 millilitri prima di centrifugare nuovamente per cinque minuti.

A 5.000 volte G, il surnatante viene quindi trasferito in una nuova provetta da 50 millilitri e un volume di etanolo al 100% viene aggiunto al lisato. Usando una siringa da 10 millilitri, aspirare il lisato attraverso un ago da 18 a 21 gauge e passarlo di nuovo circa cinque volte. Nelle successive fasi di estrazione, utilizzare il KaiGen R e easy mini kit seguendo le istruzioni del produttore, applicando il lisato sulla colonna in dotazione con il collettore a vuoto o con centrifugazione ripetuta.

Quantificare fotometricamente lo spettro dell'RNA totale. Dopo aver determinato la resa totale dell'RNA, utilizziamo il kit Ambien turbo DNA free secondo le istruzioni del produttore per rimuovere eventuali contaminazioni del DNA. Ora che le estrazioni dell'RNA sono state completate, consegnerò l'RNA totale a Johanna, che eseguirà il primo e il secondo passaggio di rimozione dell'RRNA.

Grazie Rachel. Per iniziare la rimozione dell'RRNA, mescolare delicatamente e centrifugare brevemente l'mRNA solo 10 volte il tampone di reazione prima dell'uso in una provetta sterile da 0,5 millilitri priva di RNA, combinare i volumi appropriati di inibitore dell'RNA tampone di reazione 10 volte, campione di RNA totale ed esonucleasi terminatore. Secondo il protocollo dell'epicentro, incubare la reazione a 30 gradi Celsius per 60 minuti in un termociclatore con coperchio riscaldato o bagnomaria.

Successivamente, terminare la reazione con una precipitazione di etanolo fenolico aggiungendo prima acqua libera di RNA a un volume totale di 200 microlitri e quindi aggiungendo un volume di una soluzione di cloroformio fenolico uno-a-uno alla centrifuga di mRNA. Raccogliere la fase acquosa e poi precipitare con etanolo al cento per cento e assalire. Questo è un potenziale punto di arresto.

L'RNA può essere conservato a una temperatura negativa di 80 gradi Celsius fino a quando non si è pronti per utilizzare il campione nelle applicazioni a valle. Una volta completato il primo arricchimento di mRNA, utilizzeremo i kit Ambien microbe enrich e microbe express secondo le istruzioni del produttore per rimuovere qualsiasi residuo di RRNA dal nostro campione. Per facilitare la rimozione dell'RRNA eucariotico, utilizzeremo il kit di arricchimento dei microbi.

Tutti i volumi sono determinati leggendo le istruzioni del produttore. Per iniziare la pipetta, 300 microlitri di tampone legante in una provetta da 1,5 millilitri. Aggiungere da cinque a 100 microgrammi di RNA totale in un volume massimo di 30 microlitri e vortice.

Aggiungere delicatamente due microlitri di miscela di oligo di cattura per cinque microgrammi di RNA nel tampone di legame e picchiettare delicatamente la provetta. Centrifugare brevemente il composto. Denaturare la miscela a 70 gradi Celsius per 10 minuti prima di mettere in ginocchio la miscela a 37 gradi Celsius per un'ora.

Durante questa incubazione, preparare le microsfere oligo mag lavandole una volta in acqua priva di nucleasi e una volta in tampone legante e catturando le perle su un supporto magnetico tra un lavaggio e l'altro. Conservate le perline sul ghiaccio e scaldatele a temperatura ambiente. Cinque minuti prima dell'uso, riscaldare la soluzione di lavaggio a 37 gradi Celsius in un blocco termico.

Aggiungere la miscela di oligo cattura dell'RNA alle perle oligo mag lavate, seppellire delicatamente, mescolare il tubo e centrifugare. Incubare brevemente la miscela a 37 gradi Celsius per 15 minuti. Posizionare la provetta nel supporto magnetico e attendere circa tre minuti prima di aspirare l'mRNA contenente surnatante e poi trasferirlo in una provetta di raccolta su ghiaccio.

Quindi, aggiungere 100 microlitri di soluzione di lavaggio preriscaldata alle perle catturate. E delicatamente il vortice cattura le perline e recupera lo sciocco surnatante. Questo surnatante con Mr.NA nella provetta di raccolta su ghiaccio.

Posizionare una provetta di raccolta sul ghiaccio mentre ci si prepara a rimuovere l'RRNA procariotico utilizzando il kit ambi microbe express, che utilizzeremo per rimuovere i residui di RRNA. Utilizzare il bioanalizzatore o Experion per verificare la presenza di contaminazione da RRNA e MR. Qualità NA. Questo è un potenziale punto di arresto.

L'RNA può essere immagazzinato a una temperatura negativa di 80 gradi Celsius. Una volta rimosso l'RRNA, utilizzeremo il kit di due batteri Ambien message AMP secondo le istruzioni del produttore per amplificare il nostro mRNA. Quindi, ora che abbiamo un campione puro di mRNA, passerò l'esperimento a Maria, che vi guiderà attraverso l'amplificazione dell'mRNA e la sintesi del CDNA.

Grazie, Hannah. Prima di iniziare l'amplificazione dell'mRNA, calcolare i volumi di ciascun componente del messaggio Ambien AMP two bacteria kit master mixes online, iniziamo la poliadenilazione dell'RNA stampo inserendo fino a 1000 nanogrammi di RNA totale in un tubo micro fuge sterile privo di RNA. Utilizzare 6,5 microlitri di campione e l'assenza di acqua priva di RNA nel primo tampone per sintetizzare un RNA attraverso la trascrizione in vitro.

Si consiglia di utilizzare un forno di ibridazione o un'incubatrice a causa della loro temperatura uniforme. E poiché è estremamente importante che non si formi condensa all'interno delle provette, si consiglia vivamente un'incubazione della reazione di trascrizione in vitro di 14 ore. Per massimizzare la resa dell'RNA per la massima resa dell'RNA A, condurre l'IBT in un volume di reazione finale di 40 microlitri, immagazzinare l'RNA A a una temperatura negativa di 80 gradi Celsius in quat di circa 10 microlitri.

Una volta che l'RNA è amplificato, è il momento di sintetizzare il complementare o CDNA. Il clone universale di Ribot Promega. Il kit del sistema di sintesi CDNA viene utilizzato per sintetizzare CD NA da un NA. Il kit fornisce le istruzioni per convertire due microgrammi, da un NA a un CD NA. Si consiglia di inserire da sei a 10 microgrammi a NA e di scalare le reazioni di conseguenza.

Pulire il CD NA utilizzando una precipitazione di etanolo o il sistema di pulizia del DNA promega wizard. Secondo le istruzioni del produttore, conservare campioni a 80 gradi Celsius negativi CDNA a doppio filamento può essere sequenziato direttamente a questo punto da 10 litri di acqua di mare, abbiamo estratto circa 10 microgrammi di RNA ambientale e amplificato a 20 volte attraverso la conversione del MR amplificato. Da NA a CDNA a doppio filamento sono state generate quantità sufficienti di materiale per il sequenziamento e l'analisi dei trascritti ambientali. Vi abbiamo appena mostrato come valutare l'espressione genica delle comunità microbiche marine utilizzando la metatrascrittomica ambientale.

Ricorda sempre che quando si esegue questa procedura, l'mRNA si degrada rapidamente e gli RNA sono onnipresenti. Pertanto, adottare le precauzioni standard per lavorare in un ambiente privo di nuclei costali ed elaborare i campioni il più rapidamente possibile. Quindi questo è tutto.

Grazie per aver guardato e buona fortuna con i tuoi esperimenti.