Name: Monitoraggio ad alta risoluzione video di locomozione per adulti in Drosophila melanogaster (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2009-02-20T00:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 8 s
Description: Impara a monitorare la locomozione in Drosophila melanogaster con un sistema di tracciamento video ad alta risoluzione senza anestesia. Questo metodo consente l'analisi dettagliata dei comportamenti locomotori.

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Questo lavoro è stato sostenuto dal National Institutes of Health di Grant R01 GM54408 assegnato a LC Griffith. Vorremmo ringraziare Fred Wolf per il suo aiuto nel progettare la nostra camera di piazza e la creazione di nostri test, Frank Mello alla macchina negozio Brandeis University per costruire la nostra camera, e Dan Valente e Tim Lebestky per le conversazioni utili per quanto riguarda questioni di analisi.

Parte 1: alimentazione e gestione delle mosche <ol><li> Vola deve essere coltivata in flaconi contenenti lievito senza supporti standard. Avrete bisogno di un gran numero di mosche, così croci bisogno di essere impostato di conseguenza. Vola deve essere coltivate in una 12-ore di luce: buio ciclo a 25 ° C. </li><li> Le mosche devono essere raccolti subito dopo eclosion (1-3 giorni). Le mosche possono essere lavorato in questa fase utilizzando un diffusore di anidride carbonica, e deve essere ordinato in provette contenenti i media autoclavati o senza lievito. Noi usiamo solo i maschi, 10 memorizzati in una provetta. </li><li> Attendere almeno un giorno o due dopo l&#39;uso di anidride carbonica prima di eseguire gli esperimenti comportamentali. Corriamo vola nei nostri test comportamentali 3-5 giorni dopo Eclosion. </li><li> Test deve essere sempre effettuata all&#39;interno della stessa finestra 2-3 ore di tempo ogni giorno per evitare problemi di ritmo circadiano. </li></ol> Parte 2: Installazione del sistema di tracciamento in un ambiente controllato <ol><li> Tutti gli esperimenti sono fatti in una stanza ambiente che mantiene una temperatura costante di 25 º C con il 70% di umidità. </li><li> Sospendere una videocamera digitale sopra l&#39;area da registrare (telecamera rivolta verso il basso). Poiché il nostro software di monitoraggio è invece basato, sospendiamo la fotocamera su un light box. La fotocamera registra video direttamente su un computer Dell tramite una connessione firewire. Noi usiamo una fotocamera Sharp video digitale, collegato ad un computer Dell con Windows Moviemaker (versione Vista) per l&#39;acquisizione video. </li><li> Impulsi di aria sarà somministrato in questo protocollo, quindi una fonte di flusso d&#39;aria deve essere presente nella stanza. Utilizzando un tubo in gomma, collegare la sorgente d&#39;aria per un filtro a carbone per la filtrazione dell&#39;aria. </li><li> Utilizzando un tubo in gomma di più, collegare l&#39;altro lato del filtro a carbone per una beuta attraverso un tappo di gomma vuota, e riempire il pallone con circa un centimetro e mezzo d&#39;acqua. Questo umidificare l&#39;aria. </li><li> Il pallone deve anche avere un arma da fianco, che si collegherà a forma di Y valvola tramite tubi in gomma. </li><li> Un ramo della Y-valvola deve essere collegato ad un misuratore di portata. L&#39;altro ramo deve fornire aria alla camera di locomozione piazza. </li></ol> Parte 3: dare vola alla camera di locomozione <ol><li> La camera di locomozione piazza è basato sul design di Wolf et al. 2002 1, con l&#39;aggiunta di vassoi piccola goccia per evitare che le mosche di volare all&#39;interno della camera. La camera deve essere smontato, e tutti i componenti devono essere accuratamente pulito con etanolo al 70% e asciugato prima dell&#39;uso. </li><li> Anestesia immediatamente prima di effettuare un test comportamentale può potenzialmente compromettere le prestazioni. Per evitare questo, le mosche sono delicatamente bussato nella camera usando un imbuto con una presa di piccole dimensioni. Per fare una presa della misura giusta, allegare una punta blu pipetta (per P1000) alla fine di un imbuto. Usare le forbici per tagliare la fine del puntale per rendere l&#39;apertura abbastanza grande per una mosca a passare attraverso. </li><li> La parte superiore della nostra camera è un piccolo pezzo di plexiglass avvitato intorno ai bordi. Quando le viti vengono rimosse, i fori possono essere usati per fornire vola nella camera. Posizionare la parte superiore in plexiglass in modo che il foro della vite si trova direttamente sopra la camera interna al posto di una vite in cui si trova normalmente. Prendere una provetta contenente le mosche e metterlo a testa in giù sopra l&#39;imbuto, che dovrebbe poi essere inserito nel foro della vite. </li><li> Non spostare l&#39;imbuto, in quanto ciò potrebbe ferire o danneggiare le mosche. Invece, dolcemente botto tutta la camera, imbuto e tutti, fino a che tutte le mosche sono all&#39;interno della camera. Questo bussare dovrebbe essere fatto su un tappetino mouse per assorbire lo shock di questa sbattere. Quando le mosche sono all&#39;interno, togliere l&#39;imbuto, e riposizionare la parte superiore in plexiglass sopra i letti vite. Poi ri-avvitare la parte superiore in plexiglass in posizione. </li></ol> Parte 4: Esecuzione del saggio locomotore <ol><li> Una volta che le mosche vengono caricati correttamente, far loro ambientarsi nella camera per 30 minuti. Questo periodo di acclimatazione deve avvenire in ambiente controllato (25 ° C, 70% di umidità), e la camera deve essere posto in cima al light box (che dovrebbe essere acceso). Accendere le luci stanza off. </li><li> Dopo il periodo di acclimatazione, passare la Y-valvola nel sistema di flusso d&#39;aria in modo che il flusso d&#39;aria solo per il misuratore di portata. Accendere l&#39;aria, l&#39;aria e la rampa fino alla velocità desiderata (4,0-6,0 L / min). Generalmente usiamo 5,0-5,5 L / min, ma qualsiasi velocità in tale intervallo funzionerà. </li><li> Una volta che la velocità desiderata è raggiunta, l&#39;interruttore Y-valvola in modo che l&#39;aria fluisce verso la camera di locomozione. Tempo questo impulso d&#39;aria per 15 secondi, e poi girare bruscamente l&#39;aria spenta. Come si accende l&#39;aria spenta, accendere la fotocamera per registrare modalità. (Questa parte vuole pratica di fare tutto in una volta). </li><li> Interrompere la registrazione dopo il tempo desiderato e SAVE. Registriamo 30 prove secondo a 10 fotogrammi al secondo (almeno 8 prove per genotipo). </li></ol> Parte 5: Analisi dei Video <ol><li> Usiamo ilAnalisi dinamica del sistema di immagine (DIAS) 3.2 per il software di motion tracking 2. Per poter utilizzare questo software, che prima convertire i nostri video in un formato di file AVI con QuickTime 7.5.5. </li><li> Per tracciare le mosche in base al contrasto, si usa il &quot;AutoTrace da Threshold&quot; funzione. Siamo quindi utilizzare il &quot;Crea tracciato da traccia&quot; funzione di digitalizzare queste tracce. </li><li> Per emettere la velocità istantanea di ogni volo, si usa il &quot;Compute Parametri&quot; funzione di produrre un file di database (DIAS-specifico). Con questa funzione, abbiamo anche liscia i dati utilizzando un &quot;5,15,60,15,5&quot; Tukey Finestra levigante. </li><li> Una volta che questa informazione è fornito come un file di database, può essere aperto in Microsoft Excel. Noi usiamo uno script Matlab per compilare la velocità istantanea all&#39;interno di eccellere e di calcolare i parametri aggiuntivi necessari per comprendere la dinamica del movimento e la struttura incontro. </li></ol> Rappresentante dei risultati: La figura 1 mostra tracce rappresentante di organismi selvatici tipo Canton S (Figura 1, pannello a sinistra) e vola nullo per il gene dCASK cui sono stati generati dall&#39;incrocio di due grandi delezioni sovrapposte (Df (3R) X307 e Df (3R) X313) (Figura 1 , a destra del pannello). mosche nullo dCASK precedentemente dimostrato di avere problemi locomotori con Paradigma di Buridano 3, e nel nostro paradigma, rispetto al Canton S, mostrano notevolmente ridotta locomozione. Abbiamo sempre gestito organismi wild-type prima per assicurarsi che le condizioni e il comportamento sono all&#39;interno del range di normalità in un dato giorno. Abbiamo osservato deviazioni dalle risposte standard in meno del 5% dei giorni di test. Queste differenze di solito possono essere attribuiti a problemi con i parametri del nostro ambiente controllato. <img src="/files/ftp_upload/1096/figure_1.png" alt="" width="600" height="298" /> Figura 1. DIAS generati tracce di entrambe le mosche Canton S wild-type (sopra, a sinistra) e Locomotore-deficienti Null dCASK vola generato da cancellature sovrapposte (sopra, a destra). Le tracce rappresentano ciò che si vede nel video registrati. Entrambe le tracce controindicazione immagini 8-10 vola per 30 secondi nel test di monitoraggio video che segue un impulso d&#39;aria. <img src="/files/ftp_upload/1096/figure_2.png" alt="" width="600" height="438" /> Figura 2. Vola tipo selvaggio sono stati eseguiti nel test locomotore (sopra) in seguito ad un impulso di aria (barre viola) e senza un impulso d&#39;aria (blu). In tutti i parametri calcolati dal programma di analisi, non vi erano differenze significative tra le due condizioni (determinato con due code studenti t-test). Questo dimostra che in seguito ad un impulso di aria, vola locomote normalmente nel nostro setup.

<ol><li>Wolf, F. W., Rodan, A. R., Tsai, L. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-Resolution+Analysis+of+Ethanol-Induced+Locomotor+Stimulation+in+Drosophila%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">High-Resolution Analysis of Ethanol-Induced Locomotor Stimulation in Drosophila.</a> J Neurosci. 22 (24), 11035-11044 (2002).</li>
<li>Soll, D. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+use+of+computers+in+understanding+how+animal+cells+crawl%5BTitle%5D)+AND+%22International+review+of+cytology%22%5BJournal%5D)">The use of computers in understanding how animal cells crawl.</a> International review of cytology. 163, 43-104 (1995).</li>
<li>Martin, J. R., Ollo, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+new+Drosophila+Ca2%2B%2Fcalmodulin-dependent+protein+kinase+%28Caki%29+is+localized+in+the+central+nervous+system+and+implicated+in+walking+speed%5BTitle%5D)+AND+%22The+EMBO+journal%22%5BJournal%5D)">A new Drosophila Ca2+/calmodulin-dependent protein kinase (Caki) is localized in the central nervous system and implicated in walking speed.</a> The EMBO journal. 15 (8), 1865-1876 (1996).</li>
<li>Levine, J. D., Funes, P., Dowse, H. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Resetting+the+Circadian+Clock+by+Social+Experience+in+Drosophila+melanogaster%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Resetting the Circadian Clock by Social Experience in Drosophila melanogaster.</a> Science. 298, 2010-2012 (2002).</li>
</ol>

Nella nostra impostazione, un impulso di aria moderatamente forte movimento si arresta temporaneamente volare. Quando l&#39;aria pulsata termina, le mosche vengono rilasciati da questo stato stazionario e locomote normalmente, come mostrato in figura 2. Perché questo impulso di aria sincronizza in modo efficace locomozione della popolazione, lo usiamo per cominciare il processo in modo da poter anche studiare l&#39;insorgenza del movimento a seguito di un momento di rottura stimolo. Il test può comunque essere fatto sen...

<table><tbody><tr><td>Camera Quadrata</td><td>Strumento</td><td>Officina Meccanica</td><td>N/D</td><td>Progettazione da Wolf &lt;em&gt;et al.&lt;/em&gt; 2002&lt;sup&gt;1&lt;/sup&gt;</td></tr><tr><td>Fotocamera Digitale</td><td>Fotocamera</td><td>Sharp</td><td>ViewcamZ VL-23</td><td></td></tr><tr><td>Flussimetro</td><td>Strumento</td><td>Cole-Parmer</td><td>SY-32003-12</td><td></td></tr><tr><td>Scatola Luminosa</td><td>Strumento</td><td>DNASTAR</td><td>Seq-Easy</td><td></td></tr><tr><td>Filtro al Carbone Attivo</td><td>Strumento</td><td>Fisher Scientific</td><td>09-744-37</td><td></td></tr><tr><td>DIAS 3.2</td><td>Software</td><td>Soll technologies</td><td>N/D</td><td>www.solltechnologies.com</td></tr></tbody></table>

monitoraggio ad alta risoluzione video di locomozione per adulti in drosophila melanogaster

High-Resolution Video Tracking of Locomotion in Adult Drosophila Melanogaster

Vola fornire un importante modello per lo studio del comportamento complesso a causa della pletora di strumenti genetici a disposizione dei ricercatori in questo campo. Studiare il comportamento motorio in<em&gt; Drosophila melanogaster</em&gt; Si basa sulla capacità di essere in grado di quantificare i cambiamenti in atto durante o in risposta a un determinato compito. Per questo motivo, ad alta risoluzione sistema di monitoraggio video, come quello descritto in questo articolo, è un valido strumento per la misurazione locomozione in tempo reale. Il nostro protocollo prevede l&#39;utilizzo di un impulso d&#39;aria iniziale per rompere il momento vola, seguito da un periodo di trenta riprese secondo in una camera quadrata. Un programma di monitoraggio viene poi utilizzato per calcolare la velocità istantanea di ogni volo all&#39;interno della camera con incrementi di 10 msec. Il software di analisi compila questi dati, e le uscite una serie di parametri quali la velocità media, velocità massima, il tempo trascorso in movimento, accelerazione, ecc Questo protocollo discuterà corretta alimentazione e gestione delle mosche per le attività comportamentale, la gestione vola senza anestesia o immobilizzazione , la creazione di un ambiente controllato e l&#39;esecuzione del test, dall&#39;inizio alla fine.

Lo studio del comportamento motorio complesso in<em&gt; Drosophila melanogaster</em&gt; Dipende dalla capacità di quantificare i cambiamenti in movimento una mosca dato. Questo articolo viene illustrato come eseguire questa operazione utilizzando ad alta risoluzione sistema di tracciamento.

Monitoraggio ad alta risoluzione video di locomozione per adulti in Drosophila melanogaster

Le mosche rappresentano un modello importante per lo studio di comportamenti complessi grazie alla pletora di strumenti genetici a disposizione dei ricercatori in questo campo. Studiare...

Nel saggio di tracciamento video, le mosche devono essere caricate in una camera di osservazione quadrata senza l'uso di anestesia. Per farlo, un piccolo imbuto deve essere allineato con i fori delle viti nella camera, in modo da far cadere le mosche all'interno. Utilizzando questo imbuto, le viti sigillano quindi i fori della camera e viene somministrata una scarica d'aria attraverso le prese d'aria per avviare la locomozione.Una videocamera sospesa sopra la camera registra questo movimento e invia le immagini a un computer, dove vengono tracciati e analizzati i percorsi delle mosche. Ciao, sono Justin Slawson del Laboratorio Griffith del Dipartimento di Biologia della Brandeis University. Oggi vi mostreremo un procedimento per il tracciamento video ad alta risoluzione del movimento.Utilizzeremo questa procedura nel nostro laboratorio per studiare il comportamento locomotorio nelle mosche adulte. Cominciamo dunque. Per iniziare l'esperimento, allevare le mosche in bottiglie contenenti un mezzo standard privo di lievito.Questo protocollo richiede un elevato numero di moscerini, pertanto gli incroci devono essere organizzati di conseguenza. I moscerini devono essere allevati in un ciclo luce/buio di 12 ore a 25 gradi Celsius. Raccogliere i moscerini da uno a tre giorni dopo l'eclosioni, utilizzare un diffusore di anidride carbonica per separare i moscerini in provette contenenti terreno privo di lievito, suddividendo 10 maschi per provetta.Attendere almeno un giorno o due dopo l'uso di anidride carbonica prima di eseguire gli esperimenti comportamentali. Una volta che le mosche sono state raccolte e separate, possono essere sottoposte al sistema di tracciamento video. Gli esperimenti di tracciamento video vengono effettuati in una stanza ambientale, che mantiene una temperatura costante di 25 gradi Celsius con un'umidità del 70%.Per registrare video di moscerini in movimento, è necessario posizionare una videocamera digitale sopra l'area da riprendere. Con la videocamera rivolta verso il basso, la posizioniamo sopra una teca luminosa poiché il nostro software di tracciamento si basa sul contrasto. Successivamente, utilizzando un cavo fire wire, collegare la videocamera a un computer.Utilizziamo il programma software Windows Movie Maker per registrare direttamente il video sul computer. Poiché in questo protocollo verranno somministrati impulsi d'aria, è necessaria la presenza di una fonte di flusso d'aria nella stanza. Un tubo di gomma collega la fonte d'aria a un filtro al carbonio per la filtrazione dell'aria.Un tubo di gomma collega anche l'altro lato del filtro al carbone a un pallone erlenmeyer tramite un tappo di gomma cavo. Il pallone deve essere riempito con circa mezzo pollice di acqua, che umidificherà l'aria. Il pallone deve inoltre avere un piccolo braccio laterale, che deve essere collegato a una valvola a forma di Y mediante ulteriore tubo di gomma.Un ramo della valvola a Y è collegato a un misuratore di flusso, mentre l'altro ramo è collegato alla camera quadrata di locomozione. Questa camera quadrata di locomozione si basa sul design di Wolf et al. 2002, con l'aggiunta di piccoli vassoi per impedire alle mosche di volare all'interno della camera prima di collegarla al sistema di tracciamento; ricordarsi di utilizzare etanolo al 70% per sterilizzare tutti i componenti della camera. Lasciare asciugare i componenti prima dell'uso.Ora che il sistema di tracciamento è pronto, possiamo consegnare le mosche alla camera di locomozione per inserirle nella camera. Rimuovere le viti che normalmente mantengono fissato il piccolo coperchio in plexiglass. Quindi posizionare il coperchio in plexiglass in modo che il foro per la vite si trovi esattamente sopra la camera interna.Anestetizzare le mosche immediatamente prima di eseguire un saggio comportamentale può potenzialmente comprometterne l'esecuzione. Per evitare l'anestesia, utilizzare un imbuto con un'apertura piccola per far cadere delicatamente le mosche nella camera.Per creare un imbuto con un'uscita piccola, attaccare la punta di una pipetta P 1000 blu all'estremità dell'imbuto. Utilizzare le forbici per tagliare l'estremità finale della punta della pipetta in modo da rendere l'apertura sufficientemente grande per consentire il passaggio di una mosca. Successivamente, prendere un tubo a saggio contenente le mosche e posizionarlo capovolto sopra l'imbuto.Quindi inserire l'estremit&agrave; del imbuto nel foro filettato. Non muovere l'imbuto poich&eacute; ci&ograve; potrebbe ferire o danneggiare le mosche. Invece, battere delicatamente su tutta la camera, imbuto incluso, finch&eacute; tutte le mosche non siano all'interno della camera.Utilizzare un tappetino per mouse per assorbire l'urto di questo colpo. Quando i moscerini sono all'interno, rimuovere il imbuto e riposizionare il coperchio in plexiglass sopra i letti delle viti, quindi avvitare il coperchio in plexiglass al suo posto. Una volta che i moscerini sono stati caricati correttamente, posizionare la camera sopra una scatola luminosa.Spegnere le altre luci nella stanza ambientale e lasciare che le mosche si ambientino nella camera per 30 minuti. Trascorso il periodo di ambientamento di 30 minuti, procedere con il saggio locomotorio per iniziare il test. Ruotare la valvola a Y nel sistema di flusso d'aria in modo che l'aria fluisca soltanto verso il misuratore di flusso, accendere l'aria e aumentare gradualmente la velocità fino al valore desiderato.Ogni velocità compresa tra quattro e sei litri al minuto è adeguata. In genere utilizziamo da cinque a cinque litri e mezzo al minuto. Una volta raggiunta la velocità dell'aria desiderata, commutare la valvola a Y in modo che l'aria fluisca verso la camera di locomozione.Regolare questo impulso d'aria per 15 secondi, quindi spegnere bruscamente l'aria mentre si spegne l'aria. Passare la telecamera alla modalità di registrazione. Questo passaggio richiede pratica per essere eseguito contemporaneamente.Registriamo 32 prove a 10 fotogrammi al secondo e almeno otto prove per genotipo. Interrompere la registrazione al termine della prova e assicurarsi di salvare il filmato al termine delle prove. Possiamo procedere con l'analisi video per eseguire il tracciamento del movimento nei video del saggio locomotorio.Utilizziamo il sistema di analisi dinamica delle immagini per utilizzare questo software. Convertire i video in un formato di file A VI con QuickTime 7.5 0.5. Successivamente, utilizzare la funzione di tracciamento automatico per soglia per seguire i movimenti delle mosche in base al contrasto, seguita dalla funzione crea percorso dal tracciato per la digitalizzazione.Questi tracciati applicano quindi la funzione di calcolo dei parametri per produrre nel file di database le velocità istantanee di ciascun moscerino. Questa funzione consente anche la smoothing dei dati. Utilizziamo una finestra di smoothing 5 15 60 15 5.Dopo aver esportato queste informazioni come file di database, apriamo e salviamo i file in Microsoft Excel. I file di Excel vengono elaborati mediante uno script MATLAB per compilare le velocità istantanee e calcolare ulteriori parametri necessari per comprendere la dinamica del movimento e la struttura delle fasi attive.Di seguito è riportato un risultato rappresentativo di questo saggio. La figura a sinistra mostra i tracciati ottenuti da organismi di tipo selvatico Canton s, mentre la figura a destra mostra moscerini nulli per il gene dask, ottenuti incrociando due grandi delezioni sovrapposte. Come si può osservare nel nostro paradigma, i moscerini nulli per Dask mostrano una locomozione notevolmente ridotta rispetto al Canton S, fenomeno già riportato in letteratura mediante un diverso tipo di saggio locomotore.Abbiamo appena mostrato come impostare ed eseguire un saggio di tracciamento video della locomozione. Quando si esegue questa procedura, è importante ricordare di effettuare i saggi entro la stessa finestra temporale di due o tre ore ogni giorno, per evitare problemi legati ai ritmi circadiani, e di eseguire sempre prima gli organismi di tipo selvatico per assicurarsi che le risposte comportamentali rientrino nell'intervallo normale in un determinato giorno. Questo è tutto.Grazie per aver guardato e buona fortuna con i vostri esperimenti.

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