Monitoraggio ad alta risoluzione video di locomozione per adulti in Drosophila melanogaster

Nel saggio di tracciamento video, le mosche devono essere caricate in una camera di osservazione quadrata senza l'uso di anestesia. Per fare ciò, un piccolo imbuto deve essere allineato con fori per le viti nella camera, in modo da far cadere le mosche nella camera. Utilizzando questo imbuto, le viti sigillano quindi i fori della camera e viene somministrato un impulso d'aria attraverso le prese d'aria per avviare la locomozione.

Una videocamera sospesa sopra la camera, cattura questa locomozione e la invia ad un computer dove vengono tracciati e analizzati i percorsi delle mosche. Ciao, sono Justin Slawson del Griffith Lab qui al Dipartimento di Biologia della Brandeis University. Oggi vi mostreremo una procedura per il tracciamento video ad alta risoluzione della locomozione.

Useremo questa procedura nel nostro laboratorio per studiare il comportamento delle locomotive nei moscerini adulti. Quindi iniziamo. Per iniziare l'esperimento, coltiva mosche e bottiglie contenenti terreni standard privi di lievito.

Questo protocollo richiede un gran numero di mosche, quindi gli incroci devono essere impostati di conseguenza. Le mosche dovrebbero essere coltivate in un ciclo di luce e buio di 12 ore a 25 gradi Celsius. Raccogli le mosche da uno a tre giorni dopo l'uso di un diffusore di anidride carbonica per smistare le mosche in provette contenenti terreni privi di lievito, seleziona 10 maschi per provetta.

Attendi almeno un giorno o due dopo l'uso di anidride carbonica prima di eseguire gli esperimenti comportamentali. Una volta che le mosche sono state raccolte e smistate, possono essere eseguite nel sistema di tracciamento video. Gli esperimenti di tracciamento video vengono eseguiti in una stanza d'ambiente, che mantiene una temperatura costante di 25 gradi Celsius con il 70% di umidità.

Per filmare le mosche in movimento, dovrai sospendere una videocamera digitale sopra l'area da registrare. Con la fotocamera rivolta verso il basso, sospendiamo la fotocamera su una scatola luminosa poiché il nostro software di tracciamento è basato sul contrasto. Quindi, utilizzando un cavo antincendio, collegare la fotocamera a un computer.

Utilizziamo il programma software, Windows Movie Maker per registrare il video direttamente sul computer. Poiché in questo protocollo verranno somministrati impulsi d'aria, nella stanza deve essere presente una fonte di flusso d'aria. Il tubo di gomma collega la fonte d'aria a un filtro a carbone per la filtrazione dell'aria.

Il tubo di gomma collega anche l'altro lato del filtro a carbone a un pallone di Erlenmeyer tramite un tappo di gomma cavo. Il pallone deve essere riempito con circa mezzo pollice d'acqua, che umidifica l'aria. Il pallone dovrebbe anche avere un piccolo braccio laterale, che dovrebbe essere collegato a una valvola a forma di Ys tramite un altro tubo di gomma.

Un ramo della valvola Y si collega a un flussometro mentre l'altro ramo si collega alla camera di locomozione quadrata. Questa camera di locomozione quadrata si basa sul design di Wolf Etal 2002 con l'aggiunta di piccoli vassoi di caduta per evitare che le mosche volino all'interno della camera prima di collegare la camera al sistema di tracciamento, ricordarsi di utilizzare il 70% di etanolo per sterilizzare tutti i componenti della camera. Lasciare che i componenti guidino prima dell'uso.

Ora che il sistema di tracciamento è pronto, possiamo consegnare le mosche alla camera di locomozione per consegnare le mosche nella camera. Rimuovere le viti che normalmente tengono al sicuro il piccolo piano in plexiglass della camera. Quindi posizionare la parte superiore in plexiglass in modo che il foro della vite si trovi direttamente sopra la camera interna.

Anestetizzare le mosche immediatamente prima di condurre. Un test comportamentale può potenzialmente compromettere le prestazioni. Per evitare l'anestesia, utilizzare un imbuto con una piccola uscita per far cadere delicatamente le mosche nella camera.

Per realizzare un imbuto con una piccola uscita, collegare un puntale per pipetta blu P 1000 all'estremità dell'imbuto. Usa le forbici per tagliare l'estremità della punta della pipetta in modo che l'apertura sia abbastanza grande da consentire il passaggio di una mosca. Quindi, prendi una provetta contenente le mosche e posizionala capovolta sopra l'imbuto.

Quindi posizionare l'estremità dell'imbuto nel foro della vite. Non spostare l'imbuto in quanto ciò potrebbe ferire o danneggiare le mosche. Invece, sbatti delicatamente l'intero imbuto della camera e tutto fino a quando tutte le mosche sono all'interno della camera.

Usa un tappetino per mouse per assorbire lo shock di questo colpo. Quando le mosche sono all'interno, rimuovere l'imbuto e riposizionare la parte superiore in plexiglass sopra i letti delle viti, quindi screpolare la parte superiore in plexiglass in posizione. Una volta che le mosche sono caricate correttamente, posiziona la camera sopra una scatola luminosa.

Spegni le altre luci nella stanza dell'ambiente e lascia che le mosche si acclimatino nella camera per 30 minuti. Dopo il periodo di acclimatazione di 30 minuti, procedere con il test locomotore per iniziare il test. Commutare la valvola Y nel sistema di flusso d'aria in modo che l'aria fluisca solo verso il flussometro, accendere l'aria e ramp l'aria fino alla velocità desiderata.

Funzionerà qualsiasi velocità compresa tra quattro e sei litri al minuto. In genere usiamo da cinque a cinque litri e mezzo al minuto. Una volta raggiunta la velocità dell'aria desiderata, commutare la valvola Y in modo che l'aria fluisca verso la camera di locomozione.

Cronometra questo impulso d'aria per 15 secondi, quindi spegni bruscamente l'aria mentre spegni l'aria. Imposta la fotocamera in modalità di registrazione. Questo passaggio richiede pratica per essere eseguito tutto in una volta.

Registriamo 32 prove a 10 fotogrammi al secondo e almeno otto prove per genotipo. Interrompi la registrazione al termine del periodo di prova e assicurati di salvare il filmato al termine dei periodi di prova. Possiamo procedere con l'analisi video per eseguire il tracciamento del movimento dei video del saggio locomotore.

Per utilizzare questo software utilizziamo il sistema di analisi dinamica delle immagini. Converti i video in un formato di file A VI con QuickTime 7.5 0.5. Quindi, usa la funzione di tracciamento automatico per soglia per tracciare le mosche in base al contrasto, seguita dalla funzione di creazione del percorso da traccia per digitalizzare.

Queste tracce applicano quindi la funzione dei parametri di calcolo per generare le velocità istantanee di ogni mosca in un file di database. Questa funzione consente anche il livellamento dei dati. Usiamo una finestra di levigatura 5 15 60 15 5.

Una volta che queste informazioni vengono emesse come file di database, apriamo e salviamo i file in Microsoft Excel. I file Excel vengono elaborati utilizzando uno script MATLAB per compilare le velocità istantanee e calcolare i parametri aggiuntivi necessari per comprendere le dinamiche del movimento. E la struttura dell'incontro.

Ecco un risultato rappresentativo di questo test. La figura a sinistra mostra tracce di organismi selvatici di Canton, mentre la figura a destra mostra mosche nulle per il gene dask, che sono state generate dall'incrocio di due grandi delezioni sovrapposte. Come si può vedere nel nostro paradigma, le mosche nulle di Dask mostrano una locomozione notevolmente diminuita rispetto al Cantone S, che è già stato riportato in letteratura utilizzando un diverso tipo di test locomotore.

Ti abbiamo appena mostrato come impostare ed eseguire un test di tracciamento video locomotore. Quando si esegue questa procedura, è importante ricordare di eseguire i test entro la stessa finestra temporale di due o tre ore ogni giorno per evitare problemi di ritmo circadiano e di eseguire sempre prima gli organismi di tipo selvatico per assicurarsi che le risposte comportamentali rientrino nell'intervallo normale in un determinato giorno. Quindi questo è tutto.

Grazie per aver guardato e buona fortuna con i tuoi esperimenti.