Name: Homing delle cellule ematopoietiche del midollo osseo (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2009-03-18T00:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 40 s
Description: Impara un protocollo per studiare l'omigrazione delle cellule ematopoietiche nel midollo osseo. Questo metodo consente di isolare, colorare e tracciare le cellule per confrontare l'efficienza di omigrazione tra animali geneticamente distinti.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

Questo protocollo è stato testato e ottimizzato nel laboratorio del Dr. David Scadden. Il finanziamento è fornito dal Dana Farber Cancer Institute / Massachusetts General Hospital di Ematologia e Oncologia Clinica Fellowship Program.

<ol><li> Iniziamo l&#39;esperimento homing con l&#39;estrazione di cellule da utilizzare per l&#39;esperimento. Per questo esperimento in corso siamo interessati a scoprire se l&#39;homing di midollo osseo intero le nicchie nelle ossa lunghe degli animali beneficiari è differente per le cellule del midollo osseo viene quindi prelevato da animali WT come C57BL/6J (WT) e quelli che sono transgenici fori per il recettore Lysophosphatidic 1 (LPAR1) (KO). </li><li> Prima di iniziare l&#39;esperimento, che raccoglierà i materiali di cui abbiamo bisogno per questo esperimento. Nel nostro laboratorio tutte le dissezioni del mouse sono svolte in una cappa flusso laminare cultura dei tessuti, soprattutto se le cellule stanno per essere trapiantate in un animale destinatario, invece di essere utilizzato per l&#39;analisi ex-vivo. Si comincia mettendo un foglio blu all&#39;interno della cappa. Altri oggetti sono necessari un paio di pinze e un paio di forbici affilate che sono stati sterilizzati in autoclave, un tampone sterile monouso bisturi e alcol. Avremo bisogno modificato PBS e una sterile 6 pozzetti, un mortaio, pestello, blu 50cc superato tubo conico e un filtro 70uM usa e getta. </li><li> Iniziamo prendendo una WT e un mouse KO. </li><li> Questi topi sono eutanasia da CO 2 inalazione e poi immersi nel 70% isopropranolol per 5 secondi. Questo passaggio impedisce la contaminazione delle cellule di interesse con il mouse e la pelliccia nelle nostre mani, non ha portato ad alcun compromesso della resa di cellule o risultati sperimentali. </li><li> I topi sono poi sezionati a sua volta, usando un paio di pinze e forbici affilate. Di solito inizia con il mouse WT come una questione di routine. Un snip piccola è realizzata in pelle ventrale del mouse sovrastante l&#39;addome e la pelle è poi allungato con le mani. La pelle si stacca con facilità gli arti posteriori. Il femore e la tibia vengono poi estratte facendo attenzione a non spostare la testa del femore come questa contiene una grande quantità di midollo osseo. Gli arti superiori sono staccata dal busto dell&#39;animale semplicemente applicando una trazione a loro, mantenendo il busto immobile. Ciò elimina gli arti superiori come un pezzo. Gli omeri vengono poi estratti dalle arti superiori. </li><li> Le ossa rimosse sono posti in PBS modificato che è stato aggiunto a 6 piastre. Modificato PBS è fatta con l&#39;aggiunta di 2 ml di calore inattivato siero fetale bovino e 2 cc di EDTA 0,5 M pH8. Questa soluzione viene poi filtrata attraverso un 0,45 Nalgene uM filtro e può essere conservato a 4 ° C per almeno un mese. </li><li> E &#39;essenziale per etichettare i pozzi nella piastra in modo da essere in grado di identificare WT e ossa KO correttamente. </li><li> Le carcasse di topo sono stati rimossi e smaltiti. </li><li> Un nuovo foglio si trova nel cofano e le ossa sono puliti con un bisturi monouso. </li><li> Le ossa pulite sono posti un mouse in un momento nel mortaio. Due ml di PBS modificato viene aggiunta alla malta e le ossa sono schiacciati con un pestello. E &#39;importante primo frammento delle ossa con 10 movimenti avanti e indietro del pestello e poi polverizzare con movimenti rotatori circolari. Di solito lo faccio 50 in senso orario, poi 50 movimenti in senso antiorario e così via fino a quando il materiale lasciato nel mortaio è di colore bianco e la PBS modificato aggiunti al materiale rimane bianca o trasparente. </li><li> Dopo ogni serie di 50 movimenti circolari frantumazione, abbiamo trasferire il liquido dalla malta per il 70 uM filtro collocato su un tubo da 50 ml. Non dimenticate di aggiungere 2 ml di PBS alla malta dopo ogni trasferimento il filtro. Non si vuole cercare di polverizzare ossa secche o lasciarli a secco per un certo periodo di tempo come questo porterà ad apoptosi delle cellule. </li><li> Una volta che il materiale nel mortaio diventa bianco, il materiale nel filtro viene trasferita la malta e la frantumazione è di nuovo eseguita. Questo assicura che le cellule del filtro non sono sprecati. Di solito ci vogliono uno o due serie di movimenti rotatori circolari per rendere di nuovo il materiale in bianco malta di colore in quel momento l&#39;estrazione delle cellule è completa. </li><li> La soluzione nel tubo conico è ora centrifugato (ricordatevi di conservare le cellule dal WT e KO mouse separato. Quindi si avranno due tubi diversi (uno con celle di WT, l&#39;altro con cellule KO). Centrifugare a 1200 rpm per 10 minuti. </li><li> Aspirare il sopranatante con pipette aspirazione separate per ogni provetta. Aggiungere 2 cc di tampone di lisi ACK ad ogni pellet. Questo tampone di lisi devono essere sterili. Incubare in ghiaccio per 5 minuti. </li><li> Aggiungere 8 cc di PBS modificato ad ogni provetta. Prendete 10 ul da ciascuna provetta e pipettare in due pozzetti separati in una piastra da 96 pozzetti. Collocare le provette nella centrifuga e spin loro a 1200 rpm per 10 minuti. </li><li> Mentre i tubi girano, aggiungere 30 ul di tryphan colorante blu e 60 ul di PBS modificato in ciascun pozzetto della piastra 96 ​​pozzetti che porta le cellule di interesse. </li><li> Aggiungere 10 ul di questa miscela (si prega di mescolare bene pipettando su e giù) ad un emocitometro e contare le cellule nelle quattro piazze esterne. </li><li> La conta delle cellule in ogni campione per ml è il numero di cellule contate così diviso per 4 e multiplied di 100 000. </li><li> Una volta che la centrifugazione, rimuovere i tubi dalla centrifuga e risospendere le cellule in PBS senza calcio, magnesio o glutammina L ad una concentrazione di 20 milioni di cellule per ml. Molto probabilmente non avrete circa 5 ml di volume per il WT e 5 ml di volume per l&#39;animale KO. Da questo punto in poi useremo PBS, non modificato PBS per il protocollo. </li><li> Per ogni tubo aggiungere Dii, un colorante colorazione delle cellule, per ottenere una concentrazione finale di 5um. Agitare immediatamente al Vortex per 10 secondi. Incubare a 37 gradi per 10 minuti ed evitare l&#39;esposizione alla luce. </li><li> Riempire i tubi con PBS e girare per 10 minuti a 1200 giri al minuto. </li><li> Dopo la centrifugazione, aspirare il supernatante e risospendere le cellule in PBS a 40 milioni di cellule per ml. </li><li> Carico 500 ul in siringhe da 1 cc con un ago 27G (5 siringhe per il mouse WT e 5 siringhe per i topi KO). Può essere prudente per preparare 6 siringhe per ogni coorte. Avendo in più si può aiutare le iniezioni vena della coda, che ci accingiamo a fare dopo può essere difficile. </li><li> Coprire le siringhe con un foglio in modo da mantenere il DII di disintegrazione. </li><li> Iniettare 500 ul della miscela in ogni cellula animale destinatario; (5 per ogni coorte). </li><li> Questi animali devono essere irradiati con 9 Gy di irradiazione 4-24 ore prima dell&#39;iniezione. </li><li> 48 ore dopo l&#39;iniezione, midollo osseo raccolta dal arti posteriori di ogni animale destinatario. </li><li> Processo come descritto sopra per i donatori. Risospendere le cellule di ogni animale in 1 cc di PBS. Ottenere una conta delle cellule utilizzando un emocitometro. </li><li> Leggere sul citometro a flusso LSR II da BD o un atto equivalente. Il risultato può essere espresso come numero assoluto o percentuale di cellule nel midollo osseo analizzato quali sono DII positivi. </li></ol>

<ol><li>Adams, G. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stem+cell+engraftment+at+the+endosteal+niche+is+specified+by+the+calcium-sensing+receptor%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Stem cell engraftment at the endosteal niche is specified by the calcium-sensing receptor.</a> Nature. 439 (7076), 599-603 (2006).</li>
<li>Broxmeyer, H. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chemokines+in+hematopoiesis%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Opin+Hematol%22%5BJournal%5D)">Chemokines in hematopoiesis.</a> Curr Opin Hematol. 15 (1), 49-58 (2008).</li>
</ol>

Homing è il processo attraverso il quale le cellule del midollo osseo comprese le cellule staminali, le cellule staminali e differenziate, la loro strada nel midollo osseo dopo essere stata iniettata nel flusso del sangue o del midollo osseo di topi cavità. Come è evidente dalla definizione, uno scienziato può scegliere di studiare l&#39;homing delle cellule staminali ematopoietiche, cellule progenitrici o cellule differenziate da immunofenotipizzazione identificato e isolato dalla separazione delle cellule. Di solito g...

<table><tbody><tr><td>DPBS (Dulbecco&amp;rsquo;s Phosphate Buffered Saline)</td><td>Mediatech, Inc.</td><td>21-031-CV</td><td></td></tr><tr><td>Serum bovino fetale sterile</td><td>Valley Biomedical, Inc.</td><td>BS3033</td><td></td></tr><tr><td>EDTA 0,5 M (pH 8,0)</td><td>Boston BioProducts</td><td>BM-150</td><td></td></tr><tr><td>Soluzione di Blu di Tripano</td><td>Mediatech, Inc.</td><td>25-900-CI</td><td></td></tr><tr><td>Tampone lisante ACK</td><td>Lonza Inc.</td><td>10-548E</td><td></td></tr><tr><td>Isoproprolol U.S.P.</td><td>Denison Pharmaceuticals, Inc</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Soluzione colorante per cellule Vybrant DiD</td><td>Invitrogen</td><td>V22887</td><td></td></tr><tr><td>Soluzione colorante per cellule Vybrant DiI</td><td>Invitrogen</td><td>V22885</td><td></td></tr></tbody></table>

homing delle cellule ematopoietiche del midollo osseo

Homing of Hematopoietic Cells to the Bone Marrow

Homing è il fenomeno per cui trapiantato cellule ematopoietiche sono in grado di viaggiare da e per innestare o stabilire la residenza nel midollo osseo. Chemomkines vari recettori sono coinvolti nella homing delle cellule staminali ematopoietiche. [1, 2] Questo documento descrive il protocollo classico homing utilizzati negli studi di cellule staminali ematopoietiche. In generale si tratta di isolare la popolazione di cellule il cui homing ha bisogno di essere indagato, colorazione questa popolazione con un colorante di interesse e iniettando queste cellule nel sangue di un animale destinatario. L&#39;animale destinatario è poi sacrificata a un pre-determinato tempo dopo l&#39;iniezione e il midollo osseo per valutare la percentuale o il numero assoluto di cellule che sono positivi per la tintura di interesse. In uno degli schemi più comuni sperimentale, l&#39;efficienza di homing delle cellule ematopoietiche da due animali geneticamente distinte (un tipo di animale selvatico e il corrispondente knock-out) è confrontato. Questo articolo descrive il protocollo di homing delle cellule ematopoietiche nel quadro di come esperimento.

Questo articolo descrive un protocollo utilizzato per studiare l&#39;homing delle cellule ematopoietiche alla loro nicchie nel midollo osseo.

Homing delle cellule ematopoietiche del midollo osseo

L'homing è il fenomeno per il quale le cellule ematopoietiche trapiantate sono in grado di dirigersi e attecchire, ovvero stabilire la propria residenza, nel midollo osseo. Diversi...

L'omotassi è il fenomeno attraverso il quale le cellule ematopoietiche trapiantate raggiungono il midollo osseo del ricevente. Questo articolo descrive un protocollo per lo studio dell'omotassi delle cellule ematopoietiche verso specifiche aree del midollo osseo. Isolando la popolazione cellulare di interesse, colorando tale popolazione con un colorante e iniettandola nel circolo sanguigno di un animale ricevente.Il percentuale di cellule positive per il colorante nell'animale viene quindi determinata dopo un certo periodo di tempo. Con questo metodo, è possibile confrontare l'efficienza di homing di queste cellule provenienti da due animali geneticamente distinti. Ciao, mi chiamo RHI Reen Yusef e sono un ricercatore postdottorato nel laboratorio del Dott. David Skadden presso il Center for Regenerative Medicine del Massachusetts General Hospital e presso l'Harrow Stem Cell Institute.Oggi vi mostreremo un procedimento per studiare l'omming delle cellule staminali ematopoietiche al midollo osseo, dove normalmente risiedono. Utilizziamo questo protocollo nel nostro laboratorio per analizzare le differenze nell'omming delle cellule staminali ematopoietiche provenienti da diversi topi

homing-of-hematopoietic-cells-to-the-bone-marrow

Research

Ricerca

JoVE Journal

Biology

Biologia

Un metodo per analizzare la distribuzione di progenitori midollari ematopoietiche citometria di flusso e per isolare in modo efficiente altamente purificate cellule staminali ematopoietiche (CSE) è descritto. La procedura di isolamento è essenzialmente basata su un arricchimento magnetico di c-kit + e le cellule di separazione delle cellule per purificare CSE per studi cellulari e molecolari.

L&#39;analisi fenotipica e l&#39;isolamento di murini cellule staminali ematopoietiche e Lineage-committed progenitori

Combinatorie 5 proteine ​​fluorescenti marcatura di cellule staminali e progenitrici ematopoietiche consente il monitoraggio in vivo clonale tramite confocale e microscopia a due fotoni, fornendo approfondimenti midollo osseo emopoietico architettura durante la rigenerazione. Questo metodo permette di mappatura destino non invasiva di cellule HSPCs derivate spettralmente-codificati nei tessuti intatti per lunghi periodi di tempo dopo il trapianto.

In vivo clonale Monitoraggio di staminali ematopoietiche e cellule progenitrici Contrassegnato da cinque proteine ​​fluorescenti che utilizzano confocale e microscopia Multiphoton

I monociti sono regolatori chiave dell'immunità innata e svolgono un ruolo critico nel rinnovamento del sistema fagocitario mononucleare periferico e in caso di infiammazione. Questo manoscritto descrive la procedura di imaging in tempo reale del midollo osseo calvaria di topo per studiare il meccanismo di mobilizzazione dei monociti.

Monitoraggio midollo osseo di topo monociti<em&gt; In Vivo</em

Viene presentata una strategia per analizzare quantitativamente i dati istologici nel midollo osseo. La microscopia confocale di cellule marcate in fluorescenza in sezioni di tessuto produce immagini bidimensionali, che vengono analizzate automaticamente. Le analisi di co-localizzazione di diversi tipi di cellule vengono confrontate con i dati provenienti da immagini simulate, fornendo informazioni quantitative sulle interazioni cellulari.

Automated quantificazione di cellule ematopoietiche - Interazioni cellule stromali in istologici Immagini di Undecalcified Bone

Microscopia di fluorescenza intravital (IVFM) del calvarium è applicata in combinazione con i modelli genetici animali per studiare l'homing e l'attecchimento di cellule ematopoietiche in nicchie del midollo osseo (BM).

La combinazione di microscopia di fluorescenza Intravital (IVFM) con modelli genetici per studiare la dinamica di attecchimento delle cellule ematopoietiche per nicchie di midollo osseo

Viene presentato un metodo per creare e vivere immagini diverse nicchie di midollo osseo umanizzato nei topi. Sulla base della nicchia di supporto creata da cellule mesenchimali umane, l'aggiunta di cellule endoteliali umane induce la formazione di vasi umani, mentre l'aggiunta di rhBMP-2 induce la formazione di tessuto osseo chimerico maturo umano-mouse.

Bioingegneria dei microrganismi del midollo osseo umano nel mouse e la loro visualizzazione mediante imaging live

Qui, descriviamo un semplice protocollo per l'isolamento e la colorazione delle cellule del midollo osseo murino al fenotipo delle cellule staminali emopoietiche e progenitrici insieme alle cellule staminali endoteliali e mesenchimali di nicchia di supporto. È incluso anche un metodo per arricchire le cellule situate nelle aree endostali e centrali del midollo osseo.

Analisi citometrica a flusso di cellule staminali e progenitrici ematopoietiche del midollo osseo murino e cellule di nicchia stromale

Qui, descriviamo un sistema microfisiologico standardizzato e facile da implementare che riflette la complessità della struttura in vivo del midollo osseo umano, fornendo un modello pertinente per studiare con precisione una vasta gamma di eventi normali e patologici.

Un modello 3D di midollo osseo umano per studiare le dinamiche e le interazioni tra cellule residenti in contesti fisiologici o tumorali

Abbiamo identificato la placenta come organo principale ematopoietiche durante lo sviluppo. Abbiamo trovato che le cellule staminali ematopoietiche (HSC) sono entrambi generati e ampliato nella placenta in unica nicchie microambientali. Qui, descriviamo le tecniche sperimentali necessari per l'isolamento e la visualizzazione di cellule staminali nella placenta del mouse.

Isolamento e analisi delle cellule staminali ematopoietiche dalla placenta

Questo video mostra la procedura per la differenziazione delle cellule dendritiche mieloidi dal midollo osseo dei topi. Isolamento di tibia e femore del mouse, e la lavorazione del midollo osseo sono dimostrati. Immagini che dimostrano morfologia cellulare prima e dopo la differenziazione, e le figure raffiguranti fenotipo delle cellule e IL-12 maturazione di produzione utilizzando i seguenti CpG sono mostrati.

Cultura di cellule dendritiche mieloidi dai precursori del midollo osseo

Impara un protocollo per studiare l'omigrazione delle cellule ematopoietiche nel midollo osseo. Questo metodo consente di isolare, colorare e tracciare le cellule per confrontare l'efficienza di omigrazione tra animali geneticamente distinti.

Homing delle cellule ematopoietiche del midollo osseo

Esplora altri video