Name: Microiniezione degli ovociti di Xenopus Laevis (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2009-02-23T00:00:00.000+00:00
Duration: 12 min 10 s
Description: Impara la microiniezione negli ovociti di Xenopus laevis per studiare il trasporto nucleocitoplasmatico. Questo metodo combina microscopia elettronica a sezioni sottili per visualizzare i substrati importati nel nucleo.

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Ringraziamo David Theilmann (Pacific Agri-Food Research Centre, Summerland, Columbia Britannica) per la fornitura del AcMNPV baculovirus e di discussione utile. Questo lavoro è stato supportato anche da finanziamenti della Fondazione canadese per l&#39;innovazione (CFI), il Canadian Institutes of Health Research (CIHR), la Michael Smith Fondazione per la Ricerca sulla Salute (MSFHR), e le scienze naturali e ingegneria Research Council del Canada (NSERC) .

Parte 1: Preparazione di ovociti di Xenopus per microiniezione <ol><li> Posizionare un piccolo pezzo (circa 2 cm) di ovaio Xenopus laevis in una da 50 ml tubo conico che contiene 20 ml di soluzione di collagenasi (5 mg / ml di collagenasi di calcio senza modifica di Barth salina: 88 mM NaCl, 1 mM KCl, 0,82 mM MgSO 4, 10 Hepes mM, pH 7,5). Collagenasi viene utilizzata per rimuovere le cellule del follicolo che circondano gli ovociti. </li><li> Posizionare il tubo su una piattaforma shaker e rock delicatamente (a 100 RPM) per un&#39;ora. Questa volta varia con diversi lotti di collagenasi. Così dopo un&#39;ora, prendere un piccolo campione di ovociti e di esaminare sotto un microscopio da dissezione. Correttamente de-folliculated ovociti devono essere ben separati gli uni dagli altri, e dovrebbe essere facile per inserire un ago di vetro nel citoplasma dell&#39;ovocita. Se gli ovociti non sono sufficientemente de-folliculated, sono lasciati nella soluzione di collagenasi e ricontrollato ogni cinque minuti. </li><li> Lavare gli ovociti tre volte con soluzione salina modificato Barth (MBS: 88 mM NaCl, 1 mM KCl, 0,82 mM MgSO 4, 0,33 mM Ca (NO 3) 2, 0,41 mM CaCl 2, 10 Hepes mM, pH 7,5), e trasferirli per un piatto del diametro di 100 mm Petri contenenti MBS più 1% di penicillina / streptomicina. Gli ovociti sono ora pronti per essere microiniettati. Se microiniezione verrà eseguita in un altro giorno, conservare gli ovociti a 4 ° C per un massimo di una settimana. </li><li> Utilizzando un microscopio da dissezione, selezionare gli ovociti maturi fase VI per microiniezione. Questi ovociti sono grandi, con un buon contrasto tra l&#39;emisfero animale nero e il color crema emisfero vegetali. </li><li> Trasferire il maturare ovociti VI tappa in una micropiastra (Nunc, 10 microlitri di volume bene). Questo dovrebbe essere fatto con cura, utilizzando una pipetta da 200 microlitri con un puntale che è stato tagliato alla fine di permettere undisrupted aspirazione degli ovociti. </li></ol> Parte 2: microiniezione degli ovociti di Xenopus <ol><li> Preparare il supporto all&#39;importazione da microiniettati con l&#39;aggiunta di una piccola quantità di 1% blu di bromofenolo, per facilitare la visualizzazione di microiniezione. Per esempio, si aggiunge 1 ml di blu bromofenolo a 10 ml di substrato. </li><li> Mettere una piccola striscia di Parafilm su un piatto di diametro 100 mm Petri, ed erogare un 5-microlitri goccia della soluzione da iniettare sulla striscia Parafilm. </li><li> Riempire un ago per iniezione precedentemente tarato (ottenuto tirando una 6,6 microlitri micropipetta Drummond con la Iniettare + Estrattore Matic) con la soluzione da iniettare. Per questo, il microinjector è impostato su modalità di aspirazione. Per calibrare l&#39;ago dell&#39;iniezione fare segni sul punto l&#39;ago ogni 0,5 mm, che corrispondono ad un volume di 50 nl. </li><li> Per l&#39;iniezione citoplasmatica, inserire la punta di un ago in un ovocita nell&#39;emisfero vegetali, molto vicino alla emisfero animale, con un angolo di circa 45 gradi. Girare l&#39;impostazione microinjector a microinject e microinject ogni ovocita con 50 nl di sottofondo importazione. I segni punto sul ferro sono usati per monitorare la quantità di substrato che è stato iniettato. </li><li> Trasferire gli ovociti iniettati di un piccolo (35-mm di diametro) Petri riempite con MBS, e incubare a temperatura ambiente per la quantità di tempo desiderato (punti di tempo sono scelti in modo da consentire l&#39;osservazione del substrato importazione associati con gli NPC, ciò si verifica tra 10 e 30 minuti per le proteine ​​e per i virus che sono attivamente trasportati verso la NPC, questo tempo dipende anche dal sito di iniezione e la dimensione della proteina / virus). </li><li> Quando l&#39;incubazione è completa, trasferire ovociti per un 4-ml, flaconcino di vetro contenente il 2% glutaraldeide in MBS, e fissare una notte a 4 ° C. </li></ol> Parte 3: dissezione di ovociti di Xenopus <ol><li> Il giorno dopo, lavare gli ovociti 3 volte con MBS. </li><li> Trasferimento ovociti ad una piccola scatola di Petri riempite con tampone iposodica (LSB: 1 mM KCl, 0,5 mM MgCl 2, 10 HEPES mM, pH 7,5). Utilizzando un microscopio da dissezione e dissezione pinzette, rimuovere il polo vegetale da ogni ovocita. E &#39;utile per stabilizzare l&#39;ovocita viene sezionato con un paio di pinzette, mentre l&#39;altra coppia è usato come forbici per rimuovere il palo vegetale. A questo punto è possibile valutare il successo della microiniezione dalla presenza di una sfumatura blu nel citosol. Il protocollo è continuata solo per gli ovociti che sono stati microiniettati successo. Inoltre, se i campioni devono essere preparati per EM, questo passo dissezione rende molto più facile trovare il nucleo durante il taglio e sezionamento dei campioni. </li><li> Fissare gli ovociti sezionato di nuovo con il 2% glutaraldeide in LSB per un&#39;ora a temperatura ambiente. </li><li> Dopo la fissazione, lavare gli ovociti sezionato tre volte con LSB. </li></ol> Parte 4: Preparazione di ovociti iniettati per incorporamento e EM sottile sezionamento <ol><li> Trasferire gli ovociti sezionato a una diapositiva depressione. Aspirare la maggior quantità di liquido possibile, e poi rapidamente (in modo che non si seccano) coprono gli ovociti sezionato con il 2% agarosio a basso punto di fusione. Mentre l&#39;agarosio è ancora morbido, l&#39;uso di un puntale per separare gli ovociti gli uni dagli altri, e per assicurare che ogni ovocita è rivolto verso l&#39;alto o verso il basso (non lateralmente). </li><li> Lasciare che il agarosio solidificare per circa 10 minuti. Una volta che l&#39;agarosio si solidifica, usare una lama di rasoio per tagliare l&#39;agarosio in piccoli pezzi, ciascuno dei quali contiene un ovocita sezionato. </li><li> Posizionare il agarosio-embedded ovociti in un 4-ml flacone di vetro, e li post-fix con l&#39;1% OsO 4 in LSB per un&#39;ora a temperatura ambiente. </li><li> Lavare il campione tre volte in LSB. Se necessario, conservare il campione a 4 ° C durante la notte e proseguire il protocollo il giorno successivo. </li><li> Sequenziale disidratano i campioni in una serie ascendente di alcool (50, 70, e 90% di etanolo per 20 minuti ciascuno). Questo è seguito da due cambiamenti in 100% etanolo per 15 minuti ciascuno. Infine disidratano campioni con 100% di acetone per 15 min. </li><li> Infiltrati campioni con una miscela 1:1 di Epon (Fluka) e acetone per un&#39;ora, seguita da infiltrazione con una miscela 02:01 di Epon e acetone per due ore e, infine, in puro Epon per almeno sei ore. </li><li> I campioni in formelle piatto pieno di fresca pura Epon. Gli ovociti sono orientate in modo tale che il lato del nucleo più vicino al sito di iniezione - in questo caso la parte degli ovociti che è stato sezionato - sarà sezionato per primo. Questo passo ottimizza la possibilità di visualizzare l&#39;importazione del substrato scelto. </li><li> Infine, polimerizzare il Epon per due giorni a 60 ° C. </li><li> Per visualizzare i campioni, i blocchi sono tagliati e poi sezionato con un ultramicrotomo. Le sezioni sono trasferiti su griglie di EM, macchiato con procedura standard, e visualizzati con un microscopio elettronico a trasmissione. Non mostrare questa parte del protocollo in quanto è procedura standard di EM. </li></ol> Parte 5: Risultati Rappresentante: Se il protocollo ha avuto successo, poi l&#39;involucro nucleare (NE) e NPC dovrebbe essere chiaramente visibile in EM micrografie. A seconda del substrato e iniettato la quantità di tempo che intercorre tra l&#39;iniezione e la fissazione, il substrato deve essere visibile la faccia citoplasmatica della NPC, nel NPC, o il volto nucleare della NPC. La figura 1 mostra una sezione trasversale NE con citoplasma adiacente (c) e nucleo (n) da un oocita di Xenopus che è stato iniettato con capsidi del baculovirus AcMNPV, incubate a 4 ° C per quattro ore, e trattati per l&#39;inclusione e la sezione sottile EM come descritto. Frecce indicano i PNG. Una docking capside la faccia citoplasmatica di un NPC è indicata da una freccia bianca. Al contrario, la figura 2 mostra una sezione trasversale NE con citoplasma adiacente (c) e nucleo (n) da un oocita di Xenopus che è stato iniettato il virus parvovirus Minuto di topi (MVM), incubate a temperatura ambiente per quattro ore, e elaborati per l&#39;integrazione e la sezione sottile EM come descritto. Utilizzando questa tecnica, abbiamo scoperto che MVM induce interruzioni del NE (Cohen e Pante, 2005). Parentesi indicano interruzioni nella NE. Frecce indicano i PNG. Capsidi MVM putativo associati alla NE sono indicati da frecce bianche. <img src="/files/ftp_upload/1106/1106_fig1.png" alt="Figura 1" width="600" height="459" /> Figura 1: al microscopio elettronico a NE sezione trasversale con citoplasma adiacente (c) e nucleo (n) da un oocita di Xenopus che è stato iniettato con capsidi del baculovirus MNPV Ac, incubate a 4 ° C per quattro ore, e trattati per inclusione e sezione sottile EM come descritto. Frecce indicano i PNG. Capsidi sono indicati da frecce bianche. Scala grafica: 100 nm. <img src="/files/ftp_upload/1106/figure2.png" alt="Figura 2" width="600" height="264" /> Figura 2: al microscopio elettronico a NE sezione trasversale con citoplasma adiacente (c) e nucleo (n) da un oocita di Xenopus che è stato iniettato il virus parvovirus Minuto di topi (MVM), incubate a temperatura ambiente per quattro ore, e elaborati per l&#39;integrazione e la sezione sottile EM come descritto. Frecce indicano i PNG. Parentesi indicano interruzioni nella NE. Capsidi MVM putativo associati alla NE sono indicati da frecce bianche. Scala grafica: 100 nm.

<ol><li>Panté, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Use+of+intact+Xenopus+oocytes+in+nucleocytoplasmic+transport+studies%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol.+Biol%22%5BJournal%5D)">Use of intact Xenopus oocytes in nucleocytoplasmic transport studies.</a> Methods Mol. Biol. 322, 301-314 (2006).</li>
<li>Panté, N., Kann, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nuclear+pore+complex+is+able+to+transport+macromolecules+with+diameters+of+about+39+nm%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Biol.+Cell%22%5BJournal%5D)">Nuclear pore complex is able to transport macromolecules with diameters of about 39 nm.</a> Mol. Biol. Cell. 13 (2), 425-434 (2002).</li>
<li>Rabe, B., Vlachou, A., Panté, N., Helenius, N., Kann, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nuclear+import+of+hepatitis+B+virus+capsids+and+release+of+the+viral+genome%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">Nuclear import of hepatitis B virus capsids and release of the viral genome.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 100 (17), 9849-9854 (2003).</li>
<li>Cohen, S., Panté, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pushing+the+Envelope%3A+Microinjection+of+MVM+into+Xenopus+oocytes+causes+damage+to+the+nuclear+envelope%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Gen.+Virol%22%5BJournal%5D)">Pushing the Envelope: Microinjection of MVM into Xenopus oocytes causes damage to the nuclear envelope.</a> J. Gen. Virol. 86 (12), 3243-3252 (2005).</li>
<li>Panté, N., Jarmolowski, A., Izaurralde, E., Sauder, U., Baschong, W., Mattaj, I. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Visualizing+nuclear+export+of+different+classes+of+RNA+by+electron+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22RNA%22%5BJournal%5D)">Visualizing nuclear export of different classes of RNA by electron microscopy.</a> RNA. 3, 498-513 (1997).</li>
</ol>

Microiniezione degli ovociti di Xenopus combinato con sottili sezionamento EM è uno strumento altamente efficace per studiare il trasporto nucleocytoplasmic. Questo sistema è stato utilizzato per mappare fasi distinte di importazione attraverso la NPC, per esempio l&#39;interazione di un substrato di importazione nucleare con componenti strutturali della NPC, come i filamenti citoplasmatici e basket nucleare (recensito da Pante, 2006). E &#39;stato anche utilizzato per studiare il nucleare di importazione nucle...

microiniezione degli ovociti di xenopus laevis

Microinjection of Xenopus Laevis Oocytes

Microiniezione degli ovociti di Xenopus laevis seguita da sottile sezionamento microscopia elettronica (EM) è un sistema eccellente per studiare il trasporto nucleocytoplasmic. A causa del suo nucleo di grandi dimensioni e ad alta densità di complessi poro nucleare (NPC), il trasporto nucleare può essere facilmente visibili nel ovociti di Xenopus. Di conoscere molto dei meccanismi di importazione ed esportazione nucleare è stata acquisita attraverso l&#39;utilizzo di questo sistema (recensito da Pante, 2006). Inoltre, abbiamo utilizzato microiniezione degli ovociti di Xenopus di sezionare le vie importazione nucleare di diversi virus che si replicano nel nucleo ospitante. Qui mostriamo la microiniezione citoplasmatica degli ovociti di Xenopus con un substrato importazione nucleare. Mostriamo anche la preparazione degli ovociti iniettati per la visualizzazione da parte sottile sezionamento EM, tra cui la dissezione, disidratazione e inclusione degli ovociti in una resina epossidica embedding. Infine, mettiamo a disposizione dei risultati rappresentativi per ovociti che sono stati microiniettati con il capside del nucleopolyhedrovirus baculovirus Autographa californica (AcMNPV) o il virus Minuto parvovirus del Mouse (MVM), e discutere le potenziali applicazioni di questa tecnica.

Qui mostriamo microiniezione citoplasmatica di<em&gt; Xenopus laevis</em&gt; Ovociti con un substrato di importazione nucleare, così come la preparazione degli ovociti iniettati per la visualizzazione da parte sottile sezionamento microscopia elettronica.

Microiniezione degli ovociti di Xenopus Laevis

La microiniezione in ovociti di Xenopus laevis seguita da microscopia elettronica (EM) a sezioni sottili rappresenta un sistema eccellente per studiare il nucleocitoplasma...

La microiniezione di Opus Lavu Cytes, seguita da microscopia elettronica a sezioni sottili, è un eccellente sistema per lo studio del trasporto nucleo-citoplasmatico. In questo esperimento, gli oociti vengono defogliati con collagenasi e vengono selezionati i citi di stadio sei, che vengono quindi posizionati in una piastra multi-pozzetto. I citi vengono poi microiniettati con un substrato per l'importo nucleare, dopo un'incubazione dei citi a temperatura ambiente per consentire al substrato di entrare nel nucleo.I citi vengono fissati e dissezionati. I citi dissezionati sono inclusi in agarosio a basso punto di fusione, fissati nuovamente con tetrossido di osmio, disidratati e inclusi in una resina epossidica. I campioni inclusi in resina epossidica sono sezionati mediante ultramicrotomo e le sezioni sono posizionate su una griglia per campioni in rame.Dopo la colorazione, le sezioni vengono visualizzate al microscopio elettronico a trasmissione. Ciao, sono Sarah Cohen del laboratorio della dottoressa Nellie Pane del Dipartimento di Zoologia dell'Università della British Columbia. Sono Shelly Ow, anch'io del laboratorio Panta.Oggi vi mostreremo una procedura per la microiniezione di cellule Zenap Lavis. Utilizziamo questa procedura nel nostro laboratorio per studiare l'importazione nucleare di carichi come i virus. Cominciamo dunque.Per iniziare l'esperimento, posizionare un piccolo pezzo di circa due centimetri dell'ovaio di Zenap Lavis in un tubo conico da 50 millilitri contenente 20 millilitri di soluzione di collagenasi. La collagenasi rimuove le cellule follicolari che circondano gli oociti; quindi, posizionare il tubo sulla piattaforma agitatrice e agitare delicatamente a 100 RPM per 30 minuti. Questo tempo può variare a seconda dei diversi lotti di collagenasi.Dopo un'ora, prelevare un piccolo campione di citi ed esaminarli al microscopio stereoscopico. I citi correttamente defogliati dovrebbero essere ben separati l'uno dall'altro. Inserire un ago di vetro in un citi per verificare che entri facilmente.Se le cellule non sono sufficientemente defoliate, lasciarle nella soluzione di collaghenasi e controllare ogni cinque minuti. Una volta che le cellule sono sufficientemente deregolate, lavarle tre volte con soluzione salina bar modificata e trasferirle in una piastra di Petri da 100 millimetri contenente MBS più 1% penicillina-streptomicina. Utilizzando un microscopio stereoscopico, selezionare le cellule allo stadio maturo sei per la microiniezione.Queste cellule sono di grandi dimensioni e presentano un buon contrasto tra l'emisfero animale nero e l'emisfero vegetale di colore crema. Trasferire le cellule mature allo stadio sei in una piastra multi-pozzetto. Per fare ciò, utilizzare una pipetta da 200 microlitri con un puntale la cui estremità è stata tagliata in modo da consentire un'aspirazione indisturbata degli ovociti e trasferire con attenzione gli ovociti nella piastra multi-pozzetto.Utilizziamo una piastra senza pozzetti con un volume del pozzetto di 10 microlitri; i siti EO sono ora pronti per essere microiniettati. Preparare il substrato da microiniettare aggiungendo un microlitro di blu di bromofenolo al 1% a 10 microlitri di substrato. Il colorante blu di bromofenolo consente la visualizzazione della microiniezione.Quindi, posizionare una piccola striscia di paraform su una piastra di Petri di 100 millimetri di diametro ed applicare una goccia di cinque microlitri della soluzione di iniezione sulla striscia di paraform. Successivamente, ottenere un ago per iniezione tirando una micropipetta Drummond da 6,6 microlitri con l'apposito tiratore Inject Plus Matt. Calibrare l'ago per iniezione tracciando dei punti sull'ago ogni 0,5 millimetri, corrispondenti a un volume di 50 nanolitri. Impostare il micromanipolatore sulla modalità aspirazione e riempire l'ago con la soluzione di iniezione per l'iniezione citoplasmatica.Inserire la punta dell'ago in una cellula nell'emisfero vegetale, molto vicino all'emisfero animale, con un angolo di circa 45 gradi. Successivamente, impostare il microinjector su microiniezione e microiniettare ogni cellula con 50 nanolitri di substrato per l'importazione. Controllare attentamente i puntini segnati sull'ago per monitorare la quantità di substrato iniettata al termine delle iniezioni.Trasferire i citi in una piastra di Petri da 35 millimetri riempita con MBS. Incubare i citi a temperatura ambiente per il tempo desiderato. Scegliere i punti temporali che permettono l'osservazione del substrato di importazione associato ai complessi nucleari poveri o ai NPC.Utilizziamo tipicamente intervalli temporali compresi tra 10 e 30 minuti per le proteine e i virus che vengono trasportati attivamente verso il complesso del poro nucleare. Questi intervalli dipendono anche dal sito di iniezione e dalle dimensioni della proteina o del virus. Al termine dell'incubazione, trasferire le cellule in un vial di vetro da quattro millilitri contenente glutaraldeide al 2% in MBS e fissare durante la notte a quattro gradi Celsius. Il giorno successivo, lavare le cellule tre volte con MBS; a questo punto siamo pronti per dissezionare le cellule.Trasferire i citi in una piccola capsula di Petri riempita con tampone a basso contenuto salino. Utilizzando un microscopio stereoscopico e pinzette da dissezione, rimuovere il polo vegetale da ciascun oocita. È utile stabilizzare l'oocita con una coppia di pinzette mentre l'altra coppia viene usata come forbici per rimuovere il polo vegetale; questo passaggio di dissezione rende molto più semplice individuare il nucleo durante la sagomatura e la sezione dei campioni per la microscopia elettronica.A questo punto, la presenza di una tinta bluastra nel citosol indica un'efficace microiniezione; scartare i citi che non sono stati microiniettati con successo. Successivamente, fissare nuovamente i citi dissecati con glutaraldeide al 2% in LSB per un'ora a temperatura ambiente; dopo la fissazione, lavare i citi dissecati tre volte con LSB. Una volta lavati i citi, siamo pronti a preparare gli ovociti iniettati per l'inclusione e la sezione sottile em.Trasferire gli oociti dissecati su un vetrino a depressione, aspirare la maggior quantità possibile di liquido e agire rapidamente per evitare che si secchino. Coprire gli oociti dissecati con agarosio al 2% a basso punto di fusione mentre l'agarosio è ancora morbido. Utilizzare la punta di una pipetta per separare gli oociti l'uno dall'altro e per assicurarsi che ciascun oocita sia posizionato con la faccia verso l'alto o verso il basso, mai di lato.Lasciare solidificare l'agarosio per circa 10 minuti. Una volta che l'agarosio si è solidificato, utilizzare una lametta per tagliare l'agarosio in piccoli pezzi, ciascuno contenente un citoplasma dissezionato. Quindi posizionare i citi inclusi nell'agarosio in un vial di vetro da quattro millilitri e, utilizzando un agitatore rotatorio, fissarli con tetroxido di osmio al 1% in LSB per un'ora a temperatura ambiente.Dopo la fissazione per un'ora, lavare il campione tre volte in LSB se necessario. Conservare il campione a quattro gradi Celsius per tutta la notte e proseguire il protocollo il giorno successivo. Disidratare i campioni in modo sequenziale in etanolo al 50%, 70% e 90% per 20 minuti ciascuno, quindi disidratare due volte in etanolo al 100% per 15 minuti ciascuno.Infine disidratare i campioni con acetone al 100% per 15 minuti al termine dei passaggi di disidratazione. Infiltrare i campioni con una miscela uno a uno di epon, flua e acetone per un'ora, seguita dall'infiltrazione con una miscela due a uno di epon e acetone per due ore e, infine, con epon puro per almeno sei ore. Al termine dell'ultimo passaggio di infiltrazione, posizionare i campioni in stampi piatti per inclusione riempiti con epon fresco e puro.Orientare le cellule in modo che il lato del nucleo più vicino al sito di iniezione venga sezionato per primo. In questo caso, verrà sezionato il lato delle cellule che è stato dissezionato. Innanzitutto, questo passaggio ottimizza la probabilità di visualizzare l'importazione del substrato scelto.Una volta che le cellule sono correttamente orientate, polimerizzare l’epon per due giorni a 60 gradi Celsius. Dopo il passaggio di polimerizzazione, ottenere sezioni dello spessore di 50 nanometri dai campioni inclusi nell’epossidica utilizzando un ultramicrotomo. Raccogliere le sezioni su una griglia per microscopia elettronica in rame, colorare i campioni e visualizzarli al microscopio elettronico a trasmissione.Se il protocollo è stato eseguito con successo, l'involucro nucleare e i pori nucleari dovrebbero essere chiaramente visibili nelle microfotografie al microscopio elettronico. A seconda del substrato iniettato e del tempo trascorso tra l'iniezione e la fissazione, il substrato dovrebbe risultare visibile sulla faccia citoplasmatica del poro nucleare, all'interno del poro nucleare o sulla faccia nucleare del poro nucleare. Questo risultato rappresentativo mostra una sezione trasversale dell'involucro nucleare con citoplasma e nucleo adiacenti, ottenuta da una cellula zenap iniettata con capside del virus vao.I punti freccia A-C-M-N-P-V indicano i pori nucleari e una capsid in attracco sulla faccia citoplasmatica di un poro nucleare &egrave; indicata da una freccia bianca. Al contrario, questa figura mostra una sezione trasversale dell'involucro nucleare con citoplasma e nucleo adiacenti di un'ovocita zenap iniettata con il parvovirus del topo. Utilizzando questa tecnica, abbiamo scoperto che il MVM induce alterazioni dell'involucro nucleare.Le parentesi quadre indicano interruzioni nell'involucro nucleare. Le frecce indicano i NPC e i capside MVM putativi associati all'involucro nucleare sono indicati da frecce bianche. Vi abbiamo appena mostrato come eseguire microiniezioni e dissezioni di cellule xap levu.Quando si esegue questa procedura, è importante ricordare che diversi lotti di collagenasi possono variare. Pertanto, testare attentamente il proprio collagenasi per determinare il tempo ottimale di defoliazione. Inoltre, dopo la defoliazione e il lavaggio con MBS, i citi possono essere conservati a quattro gradi Celsius per un periodo massimo di una settimana prima della microiniezione.Infine, conservare sempre il gluteo completamente immerso nel ghiaccio e non far mai asciugare l'osis. Deve rimanere completamente sommerso durante tutti i passaggi di disidratazione e infiltrazione. Ecco tutto.Grazie per aver guardato e buona fortuna con i vostri esperimenti.

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Fluorescenza a tensione di serraggio in<em&gt; Xenopus</em&gt; Oociti che utilizzano aminoacidi innaturali fluorescenti

Questo protocollo ha lo scopo di dimostrare come microiniettare una miscela DNA/DOTAP in boccioli di occhiali di embrioni di Xenopus laevis di un giorno, e come immaginare e ricostruire singole proteine fluorescenti verdi (GFP) che esprimono arbori assonali ottici nei midbrain intatti, vivono girini Xenopus.

Microiniezione di DNA in boccioli di occhiali in embrioni di Xenopus lavis e imaging di GFP Expressing Optic Aboral Arbors in Intact, Living Xenopus Tadpoles

Qui presentiamo un protocollo per esprimere le proteine gap junction negli ovociti Xenopus e registrare la corrente giunzionale tra due ovociti apposti utilizzando un amplificatore commerciale progettato per registrazioni a doppio morsetto di tensione degli ovociti in una modalità di misurazione della corrente laterale elevata.

Registrazione della corrente di giunzione gap dagli ovociti xenopus

Impara la microiniezione negli ovociti di Xenopus laevis per studiare il trasporto nucleocitoplasmatico. Questo metodo combina microscopia elettronica a sezioni sottili per visualizzare i substrati importati nel nucleo.

Microiniezione degli ovociti di Xenopus Laevis

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