Microiniezione di mRNA e oligonucleotidi antisenso Morpholino in embrioni di zebrafish.

Questa procedura inizia con la preparazione di mRNA morpho e cap trascritto in vitro. Una micropipetta viene riempita travasando la soluzione contenente morpho e il volume di iniezione viene quindi calibrato utilizzando uno stadio micrometrico di una cellula. Gli embrioni di zebrafish vengono quindi raccolti e disposti in una camera di microiniezione per microiniezioni di tuorlo.

La soluzione di lavoro viene iniettata nel tuorlo appena sotto la cellula e i movimenti citoplasmatici vengono utilizzati per trasportare la soluzione per le microiniezioni cellulari. Iniettare la soluzione nel citoplasma cellulare dopo le iniezioni. Incubare gli embrioni a 28,5 gradi Celsius in E tre terreni e valutare i fenotipi di interesse nelle fasi successive.

Ciao, sono Shiloh Yuen del laboratorio, il figlio del Dr.Sasha e del Dipartimento di Genetica della Yale University School of Medicine. Oggi dimostreremo una robusta tecnica di microiniezione per eseguire studi di sovraespressione dell'mRNA e di knockdown genico del morfo oligonucleotide nel pesce zebra. Utilizziamo questa procedura nel nostro laboratorio per studiare il ruolo del cilio S nelle malattie renali cistiche.

Quindi iniziamo. Un approccio efficace per gli studi sulla funzione genica consiste nella microiniezione di RNA incappucciato trascritto in vitro in embrioni di pesce zebra. In questa dimostrazione, inietteremo una microiniezione di un trascritto etichettato EGFP e utilizzeremo l'espressione di GFP dell'intero embrione vivo come lettura visibile per un'iniezione di successo.

Innanzitutto, eseguiremo una reazione di trascrizione dell'RNA cap in vitro sul tuo trascritto di interesse. Nel nostro laboratorio, inseriamo abitualmente A-C-D-N-A di interesse in un vettore PC two plus ed eseguiamo una reazione di sintesi in vitro di grandi quantità di RNA incappucciato utilizzando il messaggio M M machine SP six kit. Successivamente, purificheremo il campione di RNA facendolo passare attraverso il mini kit RN easy o mediante estrazione con cloroformio fenolo e precipitazione con isopropanolo.

Determinare attentamente la concentrazione del preparato di RNA e conservarlo a meno 80 gradi Celsius fino al momento dell'uso il giorno dell'iniezione. Scongelare leggermente il vortice del campione di RNA e ruotare brevemente verso il basso. Ora prepara una soluzione di lavoro con acqua sterile e una concentrazione finale dallo 0,025 allo 0,05% di rosso fenolo, il rosso fenolo funge da marcatore visibile per l'iniezione della soluzione nell'embrione.

Qui prepareremo una soluzione di lavoro di 100 nanogrammi per microlitro di mRNA EGFP con lo 0,05% di rosso fenolo. Infine, mantieni il campione di lavoro sul ghiaccio e riporta lo stock di RNA a meno 80 gradi Celsius. Procedere alla preparazione del morpho quando si è pronti per iniettare questo campione.

Gli oligonucleotidi antisenso di Morino sono ampiamente utilizzati per modificare l'espressione genica bloccando la traduzione di una proteina bersaglio o modificando prem NA. Lo splicing morphos nel pesce zebra funge da potente strumento di genetica inversa abbattendo la funzione genica. Qui inietteremo un oligo morph mirato al sito di iniziazione traduzionale di pkd due. Utilizziamo abitualmente 300 M di un oligo morph, specificamente progettato per un gene di interesse ottenuto da gene tools LLC.

Aggiungiamo quindi 100 microlitri di acqua sterile per ottenere una soluzione madre da tre millimolari, quindi aliquotiamo la soluzione e conserviamo a meno 20 gradi Celsius fino al momento dell'uso il giorno dell'iniezione. Riscaldiamo la soluzione di morino a 65 gradi Celsius per cinque minuti. Quindi facciamo scattare immediatamente la soluzione sul ghiaccio e giriamo brevemente, questo passaggio denatura tutte le strutture secondarie nell'oligo e assicura che la soluzione sia completamente solubilizzata.

Successivamente, prepareremo una soluzione di lavoro diluendo la soluzione Morpho in acqua sterile e una concentrazione finale di 0,025-0,05% di rosso pinale. In questa dimostrazione, prepareremo una soluzione di lavoro di 0,5 millimolari PKD due morino con 0,05% di rosso fenolo. Mantenere la soluzione di lavoro a temperatura ambiente e procedere al riempimento con micropipetta quando si è pronti per iniettare questo campione.

Per iniziare, dovremo fabbricare micro pipette da utilizzare per le iniezioni. Questo viene fatto riscaldando ed estraendo i tubi capillari in vetro silicato BOS in un dispositivo polare per micropipette. Una volta che gli aghi sono stati tirati, vengono conservati in una capsula di Petri sopra una piccola quantità di argilla o nastro adesivo.

Successivamente, prepareremo le piastre della camera di microiniezione versando l'1,5% di aros in una XE tre piastre medie stampate con trogoli a forma di cuneo. Questo servirà come metodo semplice per trattenere gli embrioni durante l'iniezione. Le piastre della camera agricola vengono quindi lasciate solidificare e conservate a quattro gradi Celsius fino a quando non sono pronte per essere utilizzate.

Per iniziare a riempire la micropipetta. Taglia la punta distale con una pinza o una lama di rasoio chirurgico per creare un'apertura appena visibile sotto un microscopio da dissezione con un ingrandimento di 50x. Quindi, posiziona due microlitri della tua soluzione di lavoro.

Come goccia su un vetrino coprioggetti, collegare il retro di una micropipetta a una siringa da cinque millilitri dotata di tubo su un ago ipodermico e immergere leggermente la punta distale della micropipetta nella goccia di soluzione di lavoro. Fare attenzione a non rompere la punta della micropipetta. Aspirare la soluzione di lavoro attraverso l'estremità distale della micropipetta tirando lo stantuffo della siringa.

Successivamente, calibreremo il volume di iniezione della micropipetta. Posizionare una goccia di olio minerale su un vetrino micrometrico e accendere l'alimentazione e l'alimentazione dell'aria all'apparecchio per microiniettori a impulsi di pressione. Quindi, collegare la micropipetta al supporto della micropipetta dell'apparecchio per microiniettori.

Il micro iniettore è regolato dalla pressione e le scariche vengono attivate premendo il pedale sotto il microscopio di dissezione. Testare il volume di iniezione utilizzando il microiniettore per posizionare una goccia della soluzione di lavoro sull'olio micrometrico. Misura il diametro della goccia mentre galleggia come una sfera sopra l'olio.

Regolare la durata e la pressione dell'iniezione per calibrare attentamente il volume di iniezione. Questo passaggio aiuta nella riproducibilità dell'esperimento di microiniezione. In questa dimostrazione, tutte le micro iniezioni saranno eseguite con un diametro della goccia di 0,15 millimetri.

Infine, una volta calibrato il volume di iniezione, utilizzare la manopola di mantenimento sul micro iniettore per evitare il riempimento e la fuoriuscita della micropipetta. Ora è il momento di preparare gli embrioni di pesce zebra. Il pesce zebra si accoppia casualmente, nelle prime ore di ogni mattina per iniziare la preparazione, raccoglie gli embrioni allo stadio di una cellula e li mette in un terreno XE tre.

Utilizzando una pipetta di trasferimento da tre millilitri, disporre gli embrioni lungo le depressioni a forma di cuneo nelle piastre della camera di microiniezione. Rimuovere il terreno in modo che gli embrioni siano poco profondi, sommersi e non allagati. Questa fase aiuta a sistemare gli embrioni sul fondo delle mangiatoie e a penetrare il corion da parte della micropipetta.

Ora inizieremo le iniezioni. Per prima cosa, manipoleremo gli embrioni con la micropipetta in modo che il citoplasma dell'embrione in uno stadio cellulare sia visibile al microscopio da dissezione. Fare attenzione a non rompere la punta della micropipetta, penetrare nel corion e poi nel tuorlo con la micropipetta per iniettare nell'embrione.

In questa dimostrazione, per prima cosa faremo una microiniezione nel tuorlo direttamente sotto la cellula e consentiremo al citoplasmatico e alla diffusione di portare la soluzione di lavoro nella cellula. Questo flusso è visibile a causa del rosso fenolo aggiunto alla soluzione di lavoro. Trattandosi di un embrione unicellulare, può essere iniettato a mano libera o con un manipolatore.

Dimostreremo anche l'iniezione diretta nel citoplasma cellulare. La microiniezione diretta nella cellula è più robusta, ma richiede molto tempo poiché sono necessari un corretto orientamento dell'embrione e una tecnica di microiniezione. Poiché la membrana cellulare è più rigorosa di quella del tuorlo, spesso è più veloce entrare nella micropipetta attraverso il tuorlo per raggiungere la cellula.

Il citoplasma orientando il palo dell'animale verso il fondo della mangiatoia e lavorando con le mani ferme può aiutare in questo metodo di iniezione. Dopo la microiniezione, posizionare gli embrioni in una capsula di Petri con terreno E tre e incubarli a 28,5 gradi Celsius per uno sviluppo normale. Nelle prossime ore e giorni di sviluppo embrionale, osserva gli embrioni per i tuoi fenotipi di interesse.

Per verificare il successo della microiniezione, monitoreremo l'espressione della GFP negli embrioni in via di sviluppo a partire dalla fase di scudo mediante microscopia a fluorescenza dell'intero embrione in vivo. L'espressione del costrutto è più forte durante i primi eventi dello sviluppo embrionale e spesso diminuisce durante lo sviluppo. Quando l'RNA incappucciato iniettato viene gradualmente degradato e dipende dalla stabilità della proteina espressa. Sulla base dei risultati precedentemente pubblicati, ci aspettiamo che la morfina PKD due imiti la curvatura dell'asse del corpo dorsale come trovato in PKD due pesci zebra mutanti e presenti cisti renali a circa due o tre giorni dopo la fecondazione.

Vi abbiamo appena mostrato una robusta tecnica di microiniezione per eseguire studi di sovraespressione dell'mRNA e di knockdown del gene dell'oligonucleotide morfo nel pesce zebra quando si esegue questa procedura, ricordate che è importante. Iniettare con mano ferma. Quindi questo è tutto.

Grazie per aver guardato e buona fortuna con i tuoi esperimenti.