Microiniezione di embrioni di zebrafish per analizzare la funzione del gene

I pesci zebra maschio e femmina vengono accoppiati in una gabbia di riproduzione in cui le uova fecondate cadono sul fondo dove possono essere facilmente raccolte. Le uova vengono quindi allineate contro un vetrino da microscopio in una capsula di Petri. Successivamente, l'ago di iniezione caricato viene agganciato e le impostazioni di iniezione vengono manipolate, in modo tale che il bolo di iniezione sia della dimensione desiderata se misurato con un micrometro.

Infine, gli ovuli vengono iniettati uno alla volta lungo la linea. Ciao, sono Jonathan Rosen del John MA's Laboratory nel Dipartimento di Cardiologia del Children's Hospital di Boston. E io sono Michael Sweeney, anche lui nel laboratorio VY.

Oggi dimostreremo come l'mRNA o morph Fello può essere iniettato negli embrioni di zebrafish. Utilizziamo questa procedura nel nostro laboratorio per studiare gli effetti del knockdown o della sovraespressione di particolari prodotti genici. Quindi iniziamo.

Per iniziare, dovremo allestire le vasche per pesci e per l'allevamento con divisori in posizione la notte prima dell'iniezione per aumentare la produzione totale di uova. I pesci possono essere allevati in un rapporto di due femmine per un maschio, se lo si desidera. La mattina successiva, dopo l'accensione delle luci della stanza, estrarre i divisori da diverse vasche e attendere circa 20 minuti di accoppiamento indisturbato Utilizzando un colino, raccogliere le uova dalle gabbie di riproduzione e sciacquarle con acqua d'uovo prima di versarle in una capsula di Petri.

Con l'acqua d'uovo, i pesci possono essere raggruppati in vasche più grandi per produrre ulteriori giri di uova per l'iniezione. Regolare i tempi di raccolta delle uova per consentire la produzione del numero massimo di uova senza farle passare allo stadio di cella singola. Infine, posizionare un vetrino da microscopio nel coperchio capovolto di una capsula di Petri da 100 millimetri.

Utilizzare una pipetta di trasferimento per allineare le uova contro il lato del vetrino formando un'unica colonna, quindi rimuovere l'acqua in eccesso dal vetrino premendo una salvietta Kim contro il lato opposto alle uova. Successivamente, prepareremo gli aghi per microiniezione utilizzando una micro pipetta polare. Tireremo un capillare di vetro del diametro esterno di un millimetro in due aghi e conserveremo questi aghi in una piastra di Petri da 150 millimetri Posandoli su stupide rampe di mastice, gli aghi possono essere tirati in anticipo.

Utilizziamo le seguenti impostazioni. Calore 6 45 palo 60 velocità 80. Caricare l'estremità larga dell'ago con tre microlitri di materiale per iniezione utilizzando una pipetta con caricatore micro.

Agitare il bolo verso la punta dell'ago fino a quando non rimangono alcune bolle o nessuna. Successivamente, accenderemo la fonte d'aria e il micro iniettore. Inserire l'ago nel microiniettore e assicurarsi che la tenuta sia ermetica all'interno dell'alloggiamento.

Verificare che il micromanipolatore sia in una posizione corretta per consentire un'ampia gamma di movimenti e regolazioni. Portare la punta dell'ago nel piano visivo del microscopio. Salta fuori dal palco e concentrati sulla regione più sottile della punta.

Utilizzare un paio di pinze affilate per pizzicare l'ago in un punto che lasci l'ago abbastanza stretto da perforare il corry e il tuorlo, ma comunque in grado di fornire una dimensione costante delle perline. Per calcolare il volume di ogni iniezione, utilizzeremo una goccia di olio minerale su un micrometro, inseriremo l'ago nell'olio e premeremo il pedale per iniettare una goccia di soluzione nell'olio. Monitorare la dimensione del cordone durante il taglio dell'ago e regolare la pressione di iniezione quando viene iniettato nell'olio.

Una perlina con un diametro di 0,1 millimetri contiene 500 picolitri di materiale per iniezione. In genere vengono utilizzati volumi di iniezione di 500 picolitri o un nanolitro. I volumi ideali di iniezione riempiranno circa il 10% del volume dell'uovo.

La qualità della punta dell'ago è fondamentale sia per la facilità di iniezione che per la qualità e la coerenza dei risultati. Ora è il momento di iniettare per iniziare la procedura di iniezione. Assicurarsi che gli embrioni non si siano sviluppati oltre lo stadio di quattro cellule.

Idealmente, l'embrione dovrebbe essere allo stadio di una cellula. Quindi, abbassa l'ago verso la colonna di uova, perfora la superficie del corion ed entra nel tuorlo con un colpo regolare mentre guardi. In caso di schiacciamento o strappo del sacco vitellino, iniettare il materiale di iniezione nel tuorlo.

Evita di iniettare bolle d'aria e fai attenzione agli embrioni che sono visibilmente danneggiati dall'iniezione che funziona lungo la linea. Regolare la pressione è necessaria per mantenere una dimensione costante del cordone e, utilizzando un puntale per pipetta, rimuovere gli ovuli che sembrano non fecondati o che vengono distrutti durante il processo di iniezione. Dopo aver completato una colonna di uova, utilizzare un getto delicato di acqua d'uovo per spostare le uova iniettate in una capsula di Petri pulita e ripetere se necessario.

Tenere diversi embrioni non iniettati come controllo. Più tardi, durante il primo giorno, rimuovere gli embrioni morti e registrare il numero di embrioni iniettati. Sostituisci periodicamente l'acqua dell'uovo nel piatto per ridurre la possibilità di infezione.

Si noti che, a seconda di ciò che viene iniettato, gli embrioni possono sopravvivere a un tasso inferiore rispetto ai loro fratelli non iniettati. Fortunatamente, è facile iniettarne un numero enorme, quindi questo è raramente un problema. Ora mostreremo alcuni risultati rappresentativi sia dell'iniezione di morfo che dell'mRNA.

Il controllo non iniettato a 48 ore dopo la fecondazione sembra normale come previsto. Tuttavia, gli embrioni iniettati con il morfo HG E tre i tre eeg FFR uno, che abbatte le isoforme HG contenenti la prima delle due ripetizioni EEG flike esibiscono, edema cerebrale, iniezione di vetro cardiaco. Mr.NA ha anche prodotto un fenotipo evidente a 24 ore dopo la fecondazione.

Le testine dei controlli a iniezione irregolare sembravano normali. Al contrario, alcuni degli embrioni iniettati con l'NNA M presentano opia, vi abbiamo appena mostrato come l'iniezione di morphos o mRNA durante lo stadio di una cellula può aumentare o diminuire l'espressione di geni specifici durante lo sviluppo successivo. Quando si esegue questa procedura, è importante ricordare anche questo.

Un'alta concentrazione di mRNA o morfo può causare letalità aspecifica negli embrioni con il morfo. Ognuno di essi deve essere testato empiricamente, ma in genere concentrazioni comprese tra 200 e 500 micromolari di attività genica knockdown specificamente senza causare letalità complessiva. Quindi questo è tutto.

Grazie per aver guardato e buona fortuna con i tuoi esperimenti.