Microiniezione di embrioni di zebrafish per analizzare la funzione del gene
9 marzo 2009
Questo video mostra come morfolino o mRNA possono essere iniettati in embrioni di pesce zebra alla unicellulare stadio per diminuire o aumentare il livello di prodotti specifico gene durante lo sviluppo successivo.
I pesci zebra maschi e femmine vengono accoppiati in una gabbia per la riproduzione in cui le uova fecondate cadono sul fondo, dove possono essere facilmente raccolte. Le uova vengono quindi allineate lungo una lamella di microscopio in una piastra di Petri. Successivamente, l'ago di iniezione caricato viene tagliato e le impostazioni di iniezione vengono regolate in modo che il volume dell'iniezione sia della dimensione desiderata quando misurato con un micrometro.
Infine, le uova vengono iniettate una alla volta in successione. Ciao, sono Jonathan Rosen del laboratorio di John MA del Dipartimento di Cardiologia del Children's Hospital di Boston. E io sono Michael Sweeney, anch'io del laboratorio VY.
Oggi dimostreremo come l'mRNA o il morpholino può essere iniettato negli embrioni di pesce zebra. Utilizziamo questa procedura nel nostro laboratorio per studiare gli effetti dell'abbassamento o della sovraespressione di particolari prodotti genici. Cominciamo dunque.
Per iniziare, è necessario preparare i pesci e i serbatoi di riproduzione con le partizioni inserite la notte precedente l'iniezione, al fine di aumentare la produzione totale di uova. Se lo si desidera, i pesci possono essere allestiti in un rapporto di due femmine per un maschio. La mattina successiva, dopo l'accensione delle luci della stanza, rimuovere le partizioni da diversi serbatoi e consentire circa 20 minuti di accoppiamento indisturbato. Utilizzando un colino, raccogliere le uova dalle gabbie di riproduzione e risciacquarle con acqua per uova prima di versarle in una capsula di Petri.
Con l'acqua per uova, i pesci possono essere raggruppati in vasche più grandi per produrre ulteriori cicli di uova da iniettare. Regolare il momento del prelievo delle uova in modo da ottenere il numero massimo di uova possibili senza farle superare lo stadio a singola cellula. Infine, posizionare un vetrino nel coperchio capovolto di una piastra di Petri da 100 millimetri.
Utilizzare una pipetta Pasteur per allineare le uova lungo il bordo del vetrino formando una singola colonna, quindi rimuovere l'eccesso di acqua per uova dal vetrino premendo un fazzoletto Kim contro il lato opposto rispetto alle uova. Successivamente, prepareremo gli aghi per microiniezione utilizzando un polarizzatore per micropipette. Estraremo una capillare di vetro con diametro esterno di un millimetro in due aghi e conservaremo questi aghi in una piastra di Petri da 150 millimetri posizionandoli su supporti di silly putty; gli aghi possono essere preparati in anticipo.
Utilizziamo le seguenti impostazioni: riscaldamento 6, polo 45, velocità 60, velocità 80. Caricare l'estremità larga dell'ago con tre microlitri di materiale per l'iniezione utilizzando una pipetta micro loader.
Agitare il bolo verso la punta dell'ago fino a quando rimangono poche o nessuna bolla. Successivamente, accendere la sorgente d'aria e la microsiringa. Inserire l'ago nella microsiringa e assicurarsi che vi sia una chiusura ermetica all'interno dell'alloggiamento.
Verificare che il micromanipolatore sia in una posizione corretta per consentire un'ampia gamma di movimenti e regolazioni. Portare la punta dell'ago nel piano di vista del microscopio. Sollevarlo molto rispetto al piano del palco e mettere a fuoco sulla regione più sottile della punta.
Utilizzare una pinzetta affilata per staccare l'ago in un punto tale da lasciarlo abbastanza sottile da perforare la corion e il tuorlo, ma comunque in grado di erogare una goccia di dimensione costante. Per calcolare il volume di ciascuna iniezione, si utilizzerà una goccia di olio minerale su un micrometro, inserendo l'ago nell'olio e premendo il pedale per iniettare una goccia di soluzione nell'olio. Monitorare le dimensioni della goccia mentre si accorcia l'ago e si regola la pressione di iniezione, se necessario, quando si inietta nell'olio.
Un microperla con un diametro di 0,1 millimetri contiene 500 picolitri di materiale da iniezione. Di solito si utilizzano volumi di iniezione di 500 picolitri o un nanolitro. I volumi di iniezione ideali devono riempire circa il 10% del volume dell'uovo.
La qualità della punta dell'ago è fondamentale sia per la facilità di iniezione sia per la qualità e la coerenza dei risultati. È ora di iniettare per iniziare la procedura di iniezione. Assicurarsi che gli embrioni non abbiano superato lo stadio a quattro cellule.
In condizioni ideali, l'embrione dovrebbe trovarsi allo stadio a una singola cellula. Successivamente, abbassare l'ago verso la colonna di uova, perforare la superficie del corione ed entrare nel tuorlo con un unico movimento fluido, osservando attentamente. In caso di schiacciamento o lacerazione del sacco vitellino, iniettare il materiale di iniezione direttamente nel tuorlo.
Evitare l'ingresso di bolle d'aria e fare attenzione agli embrioni visibilmente danneggiati durante l'iniezione procedendo lungo la fila. Regolare la pressione se necessario per mantenere una dimensione costante della goccia e, utilizzando la punta di una pipetta, rimuovere le uova che appaiono non fecondate o che vengono distrutte durante il processo di iniezione. Dopo aver completato una colonna di uova, utilizzare un flusso delicato di acqua per uova per trasferire le uova iniettate in una nuova capsula di Petri pulita e ripetere l'operazione se necessario.
Conservare alcuni embrioni non iniettati come controllo. Successivamente, durante la prima giornata, rimuovere gli embrioni morti e registrare il numero di embrioni iniettati. Sostituire periodicamente l'acqua delle uova nella piastra per ridurre il rischio di infezione.
Si noti che, a seconda del materiale iniettato, gli embrioni possono sopravvivere a un tasso inferiore rispetto ai loro fratelli non iniettati. Fortunatamente, è facile iniettare un numero elevato di embrioni, pertanto ciò raramente rappresenta un problema. Ora mostreremo alcuni risultati rappresentativi sia dell'iniezione di morpholino sia di mRNA.
L'embrione controllo non iniettato a 48 ore dalla fecondazione appare normale, come previsto. Tuttavia, gli embrioni iniettati con il morpholino HG E tre i tre eeg FFR uno, che inibisce le isoforme di HG contenenti la prima delle due ripetizioni simili a eeg f, mostrano edema cerebrale e iniezione di heart glass. L'mr.NA ha prodotto anche un fenotipo evidente a 24 ore dalla fecondazione.
Le teste dei controlli non iniettati apparivano normali. Al contrario, alcuni degli embrioni iniettati con l'MNNA mostrano opia. Vi abbiamo appena mostrato come l'iniezione di morpholino o mRNA durante lo stadio a una cellula possa aumentare o diminuire l'espressione di geni specifici durante lo sviluppo successivo. Quando si esegue questa procedura, è importante ricordare anche questo.
Un'elevata concentrazione sia di mRNA che di morpholino può causare letalità non specifica negli embrioni trattati con il morpholino. Ognuno di questi deve essere testato empiricamente, ma tipicamente concentrazioni comprese tra 200 e 500 micromolari riducono specificamente l'attività genica senza provocare letalità generale. Questo è tutto.
Grazie per aver guardato e buona fortuna con i vostri esperimenti.
Panoramica
In questo video viene mostrata l'iniezione di morpholino o mRNA in embrioni di pesce zebra allo stadio a una cellula per manipolare l'espressione genica durante lo sviluppo.
Componenti Chiave dello Studio
Area della Scienza
- Neuroscienze
- Biologia dello sviluppo
- Manipolazione genetica
Sfondo
- Il pesce zebra è comunemente utilizzato come organismo modello nella biologia dello sviluppo.
- Le tecniche di iniezione permettono lo studio della funzione e della regolazione genica.
- La manipolazione dell'espressione genica può fornire informazioni sui processi di sviluppo.
- Una manipolazione accurata degli embrioni è fondamentale per esperimenti di successo.
Scopo dello studio
- Dimostrare la tecnica di iniezione di mRNA o morpholino in embrioni di pesce zebra.
- Osservare gli effetti dell'abbassamento dell'espressione genica o della sovraespressione sullo sviluppo.
- Fornire un protocollo per ricercatori interessati alla manipolazione genetica.
Metodi Utilizzati
- Allevamento di zebrafish e raccolta di uova fecondate.
- Preparazione di aghi per microiniezione e caricamento con il materiale da iniettare.
- Iniezione di embrioni allo stadio a una cellula con precisione.
- Monitoraggio dello sviluppo degli embrioni e registrazione dei risultati.
Risultati principali
- Gli embrioni iniettati hanno mostrato fenotipi specifici in base al materiale utilizzato.
- Gli embrioni di controllo si sono sviluppati normalmente, mentre quelli iniettati hanno mostrato risultati variabili.
- L'iniezione di morpholino ha portato a un evidente edema cerebrale in alcuni casi.
- Le iniezioni di mRNA hanno determinato cambiamenti nello sviluppo distinti.
Conclusioni
- La tecnica modifica efficacemente l'espressione genica negli embrioni di zebrafish.
- Un'attenta ottimizzazione dei parametri di iniezione è essenziale per il successo.
- I risultati evidenziano il potenziale di questo metodo nello studio della funzione genica.
Domande frequenti
Rilevanza Industriale del Progetto
L'iniezione microscopica nell'embrione di pesce zebra consente una modulazione rapida e scalabile dell'espressione genica per la validazione precoce di bersagli nella scoperta di farmaci. La tecnica supporta lo screening fenotipico ad alto rendimento permettendo un knockdown o un'overespressione precisi di geni specifici per valutarne le conseguenze funzionali in un sistema vertebrato. Questo approccio offre un valore meccanicistico di riduzione del rischio collegando la perturbazione genetica a fenotipi dello sviluppo osservabili, fornendo informazioni sulla fiducia nel bersaglio e sulle decisioni di triage del portafoglio.
Applicazioni Strategiche nella Ricerca e Sviluppo in Biopharma
Scoperta Precoce e Validazione del Target
- Valore scientifico: Consente l'analisi di ipotesi terapeutiche mediante silenziamento genico mirato o sovraespressione per chiarire il coinvolgimento delle vie metaboliche.
- Valore operativo: Favorisce la rapida generazione di modelli di perdita di funzione e di guadagno di funzione per ridurre i rischi associati ai bersagli prima dello sviluppo dei saggi.
- Valore predittivo: Facilita la riduzione del rischio biologico collegando la modulazione genetica a risultati fenotipici in un sistema vertebrale rilevante per la malattia.
Sviluppo di screening e saggi
- Valore scientifico: Produce embrioni standardizzati e modulati geneticamente, adatti a letture fenotipiche successive in campagne di screening.
- Valore operativo: Consente la preparazione di centinaia di embrioni iniettati all'ora, supportando formati saggistici scalabili e riproducibili.
- Valore traslazionale: Genera fenotipi quantitativi e osservabili (ad esempio, cambiamenti morfologici) che fungono da punti finali robusti per lo screening di composti.
Ricerca Translazionale e Preclinica
- Valore scientifico: Fornisce continuità dalla scoperta della funzione genica alla validazione preclinica, modellando varianti geniche umane in un contesto vertebrale.
- Valore operativo: Supporta decisioni di avanzamento con valutazione del rischio identificando fenotipi correlati all'efficacia o alla tossicità della modulazione del bersaglio.
- Conferma predittiva: Aiuta a prioritizzare i bersagli in base alla gravità e specificità fenotipica osservate dopo l'iniezione, riducendo i falsi positivi nell'identificazione dei candidati.
Integrazione di Pipeline e Flusso di Lavoro
Il metodo si inserisce nel percorso iniziale della scoperta, supportando la validazione del bersaglio attraverso la perturbazione genetica e consentendo il passaggio allo screening fenotipico e all'identificazione di composti promettenti quando sostenuto da esiti osservabili e dipendenti dalla dose.
- Biologia della scoperta: Facilita la verifica di ipotesi consentendo una modulazione precisa dell'espressione genica per valutare la necessità e la sufficienza del bersaglio nelle vie di sviluppo.
- Screening: Genera sistemi biologici pronti per i saggi con background genetici standardizzati per una valutazione coerente dei composti.
- Analisi: Permette una valutazione fenotipica quantitativa (ad esempio, frequenza di difetti morfologici) per confrontare condizioni e valutare effetti genetici o farmacologici.
- Ricerca traslazionale: Collega la manipolazione genetica a fenotipi dello sviluppo che modellano i meccanismi delle malattie umane, supportando una validazione allineata ai biomarcatori.
- Riutilizzo aziendale: Stabilisce una piattaforma riutilizzabile per l'interrogazione iterativa di bersagli su più geni e vie in progetti di portafoglio.
Impatto Operativo ed Aziendale
- Valore scientifico: Aumenta la fiducia nella validazione dell'obiettivo riducendo l'ambiguità meccanicistica attraverso una perturbazione genetica diretta in un modello vertebrale.
- Valore operativo: Offre un'elevata riproducibilità e scalabilità, con la capacità di iniettare centinaia di embrioni all'ora utilizzando protocolli standardizzati di microiniezione.
- Valore strategico: Migliora il processo decisionale di avanzamento o abbandono del progetto fornendo precoci evidenze fenotipiche della modulazione dell'obiettivo, riducendo gli investimenti in target non praticabili.
- Impatto sul portafoglio: Permette una priorizzazione adeguata al rischio collegando fenotipi specifici del gene agli esiti dello sviluppo, orientando l'allocazione del capitale nella selezione degli obiettivi.
Considerazioni sull'implementazione
- Richiede competenze nell'allevamento di zebrafish, nella manipolazione degli embrioni e nella tecnica di microiniezione per garantire vitalità e coerenza.
- Richiede strumentazione specializzata, tra cui microiniettori, fonti d'aria, micrometri e strumenti per la trazione di aghi, per un controllo preciso del volume.
- Necessita della standardizzazione del volume di iniezione, della qualità degli aghi e dello stadio degli embrioni tra diversi operatori e sedi per ottenere risultati riproducibili.
- Comporta considerazioni di adattamento nell'applicare il metodo su diversi background genetici o modelli di malattia, al fine di mantenere la rilevanza fenotipica.
- Presenta limitazioni pratiche, come la sensibilità degli embrioni al trauma da iniezione e effetti fuori bersaglio dipendenti dalla concentrazione, richiedendo un'ottimizzazione empirica per ogni bersaglio.
