Name: Isolamento delle isole pancreatiche umane: Parte I: Digestione e Collezione di tessuto pancreatico (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2009-05-26T00:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 54 s
Description: Impara l'isolamento delle isole pancreatiche umane per la biologia del trapianto usando un metodo automatizzato con perfusione di collagenasi. Questa procedura migliora la qualità e la quantità delle isole per uso clinico.

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Supportato da un finanziamento della University of Illinois a Chicago, nonché delle cellule delle isole Resource Center NIH di sovvenzione (RFA-RR 05-003), la Fondazione Cristoforo, la Fondazione Efroymson, e la Fondazione Tellabs.

1. Programma di setup <ol><li> Isolamento isole umane è una procedura momento delicato che coinvolge il lavoro di squadra e, quindi, quattro individui sono necessarie per condurre questa procedura. Il team è guidato dal chirurgo, che analizza e cannulates il pancreas. </li><li> L&#39;isolamento delle isole inizia il minuto la squadra entra nel UIC di isolamento delle isole. I membri del team in modo che tutta la strumentazione necessaria, come la centrifuga, viene controllata e acceso. Inoltre assicuratevi di disinfettare tutte le cappe e superfici. </li><li> Due persone si impostare la tabella incannulazione, granitore, circuito digestione, unità di perfusione, macchina purificazione COBE, e tavoli operatori. </li><li> Contemporaneamente, due altri membri del team si preparano i mezzi di comunicazione che è necessario durante l&#39;isolamento. </li><li> Avanti, tubi batteriologia (bottiglie, tubi, la forma e la borsa), tubi di campionamento (pre-riempite con lavaggio), e tubi di valutazione e piatti sono preparati. </li><li> Preparate il tubo di purificazione impostata come segue: Il 1 ° tubo vuoto e segnato a 150 ml, tubi 2-12 riempito con 200 ml di M199 mezzi di comunicazione integrata con albumina umana (soluzione di lavaggio) e segnato a 230 ml, e infine un tubo da 50 ml riempito con 50 ml di soluzione di lavaggio. Una volta che questi passaggi di preparazione sono completi siamo pronti per iniziare la preparazione e la perfusione del pancreas. </li></ol> 2. Pancreas preparazione e perfusione <ol><li> Per iniziare la preparazione e la perfusione del pancreas, un operatore rimuove l&#39;organo dalla confezione utilizzando una tecnica sterile. Il chirurgo trasferirà il pancreas al tavolo di decontaminazione. </li><li> Il chirurgo riempire una siringa da 60 ml con la soluzione originale preservazione del pancreas e consegnarla ad un operatore, che lo utilizzano per riempire preparato &quot;Procurement&quot; bottiglie di batteriologia. </li><li> Dopo un controllo visivo per stabilire se l&#39;organo è adatto per l&#39;isolamento delle isole (Se il pancreas viene danneggiato durante il prelievo o anatomicamente anomali, che non possono essere utilizzati per l&#39;isolamento delle isole), il chirurgo dovrà chiedere a un operatore per preparare collagenasi. Ricorda che tale ri-sospensione del tempo varia tra i marchi di enzimi diversi e molto. </li><li> Quando il chirurgo è pronto, portare le soluzioni di decontaminazione (Betadine, Fungizone / Cefazolina e HBSS) alla tabella di decontaminazione e versarli in appositi contenitori. Chirurgo esegue decontaminazione pancreas lavaggio per un minuto il pancreas in ciascuna delle soluzioni di decontaminazione. Il pancreas viene quindi posto in un vasetto sterile in cui sarà pesato. Dopo che il peso è entrato nel batch record, il pancreas viene posizionato in padella con un po cannulazione soluzione di conservazione. </li><li> Il chirurgo esporre e parzialmente incidere il condotto principale e cannulate ogni metà del pancreas con una cannula. La cannula viene garantito da sutura. Per profumato il pancreas, prima spostare l&#39;unità perfusione e versare la soluzione enzimatica nel bacino. Perfusione tempo totale è di circa 10 minuti, a 80 mmHg per 5 minuti, poi a 180 mmHg per 5 minuti. Pancreas disteso dopo la perfusione. </li><li> Spostare il pancreas perfuso alla padella incannulazione, dove viene tagliato il tessuto adiposo dal pancreas con attenzione. Poi tagliare il pancreas in 10-12 pezzi e trasferimento a Ricordi Camera per la digestione. </li></ol> 3. Pancreas digestione <ol><li> Per iniziare la fase di digestione, il pancreas trasferimento alla Camera vuota Ricordi, aggiungere una fiala 2,5 ml di Pulmozyme, mettere sullo schermo (evitare grossa fetta del blocco tessuto della camera), chiudere la camera, e riempire il sistema. </li><li> Iniziare a pompare la soluzione per 5 minuti. Agitare delicatamente la camera a disperdersi uniformemente soluzione calda per tutto. Dopo cinque minuti, agitare delicatamente la camera per la fase di digestione intero. Mantenere la temperatura a 37 ˚ C. </li><li> Rock the camera delicatamente fino a quando la temperatura raggiunge i 37 °, poi scuotere la camera. Prelevare un campione ogni due minuti e rilevare se isolotti liberi si trovano nel campo d&#39;applicazione. Registrare le informazioni isolotto di valutazione nella tabella digestione dei batch record. Continuerà a monitorare la percentuale di isolotti finché non ci sono il 50% di loro flottante libero e isolato nella soluzione. </li></ol> 4. Raccolta dei tessuti <ol><li> Una volta che il 50% delle isole si trovano liberi nei campioni, la digestione viene interrotta con l&#39;aggiunta di freddo soluzione di diluizione RPMI nel circuito. Tessuto viene raccolto in 500 ml provette coniche pre-riempite con 30 ml di albumina umana. Una volta che i tubi sono filata, aspirazione fuori dal surnatante e lavare il pellet con la soluzione di lavaggio a freddo. Gira i tubi conici a 1100 RPM (rotazioni al minuto) per 1 minuto, 4 ˚ C. </li><li> Combina tutti i tubi di raccolta sospesa con tessuto pancreatico digeriti in un singolo da 500 ml. Quando un tubo è pieno di tessuto lavato, girare e ripetere il processo di lavaggio fino a tutto il tessuto è stato lavato più volte. Spin questo tubo e trasferire il tessuto in un unico tubetto da 250 ml. Portare il volume fino a 250 ml conM199 soluzione di lavaggio integrato con HA e prepararsi per il campionamento. </li><li> Prendete un campione di 1 ml con una pipetta e aggiungere in una provetta da 15 ml conica pre-riempita con 9 ml di soluzione di lavaggio. Quindi mescolare delicatamente invertendo il tubo da 15 ml e da questa, campione fuori 1ml direttamente in un piatto della griglia di conteggio. Contare le celle, e calcolare il numero di cellulare utilizzando un fattore di diluizione del 2500 (10x250). </li><li> Spin il tubetto da 250 ml conica e aggiungere 150 ml di UW (Università del Wisconsin), soluzione che di solito uso per la conservazione degli organi. Quando UW si aggiunge, mescolare la sospensione cellulare accuratamente con la pipetta. Registrare e comunicare all&#39;operatore purificazione l&#39;ora di inizio di UW. Lasciare il tubo (s) su ghiaccio e agitare di tanto in tanto. Ora le isole possono essere ulteriormente purificato. </li></ol>

<ol><li>Shapiro, A. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Islet+transplantation+in+seven+patients+with+type+1+diabetes+mellitus+using+a+glucocorticoid-free+immunosuppressive+regimen%5BTitle%5D)+AND+%22N+Engl+J+Med%22%5BJournal%5D)">Islet transplantation in seven patients with type 1 diabetes mellitus using a glucocorticoid-free immunosuppressive regimen.</a> N Engl J Med. 343, 230-238 (2000).</li>
<li>Nano, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Islet+isolation+for+allotransplantation%3A+variables+associated+with+successful+islet+yield+and+graft+function%5BTitle%5D)+AND+%22Diabetologia%22%5BJournal%5D)">Islet isolation for allotransplantation: variables associated with successful islet yield and graft function.</a> Diabetologia. 48, 906-912 (2005).</li>
<li>Barbaro, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Improved+human+pancreatic+islet+purification+with+the+refined+UIC-UB+density+gradient%5BTitle%5D)+AND+%22Transplantation%22%5BJournal%5D)">Improved human pancreatic islet purification with the refined UIC-UB density gradient.</a> Transplantation. 84, 1200-1203 (2007).</li>
<li>Lakey, J. R., Rajotte, R. V., Warnock, G. L., Kneteman, N. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+pancreas+preservation+prior+to+islet+isolation.+Cold+ischemic+tolerance%5BTitle%5D)+AND+%22Transplantation%22%5BJournal%5D)">Human pancreas preservation prior to islet isolation. Cold ischemic tolerance.</a> Transplantation. 59, 689-694 (1995).</li>
<li>Fridell, J. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparison+of+histidine-tryptophan-ketoglutarate+solution+and+University+of+Wisconsin+solution+for+organ+preservation+in+clinical+pancreas+transplantation%5BTitle%5D)+AND+%22Transplantation%22%5BJournal%5D)">Comparison of histidine-tryptophan-ketoglutarate solution and University of Wisconsin solution for organ preservation in clinical pancreas transplantation.</a> Transplantation. 77, 1304-1306 (2004).</li>
<li>Potdar, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Initial+experience+using+histidine-tryptophan-ketoglutarate+solution+in+clinical+pancreas+transplantation%5BTitle%5D)+AND+%22Clin+Transplant%22%5BJournal%5D)">Initial experience using histidine-tryptophan-ketoglutarate solution in clinical pancreas transplantation.</a> Clin Transplant. 18, 661-665 (2004).</li>
<li>Salehi, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+islet+isolation+outcomes+from+pancreata+preserved+with+Histidine-Tryptophan+Ketoglutarate+versus+University+of+Wisconsin+solution%5BTitle%5D)+AND+%22Transplantation%22%5BJournal%5D)">Human islet isolation outcomes from pancreata preserved with Histidine-Tryptophan Ketoglutarate versus University of Wisconsin solution.</a> Transplantation. 82, 983-985 (2006).</li>
<li>Ricordi, C., Lacy, P. E., Scharp, D. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Automated+islet+isolation+from+human+pancreas%5BTitle%5D)+AND+%22Diabetes%22%5BJournal%5D)">Automated islet isolation from human pancreas.</a> Diabetes. 38, Suppl 1 140-142 (1989).</li>
<li>Hanley, S. C., Paraskevas, S., Rosenberg, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Donor+and+isolation+variables+predicting+human+islet+isolation+success%5BTitle%5D)+AND+%22Transplantation%22%5BJournal%5D)">Donor and isolation variables predicting human islet isolation success.</a> Transplantation. 85, 950-955 (2008).</li>
<li>Toso, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Factors+affecting+human+islet+of+Langerhans+isolation+yields%5BTitle%5D)+AND+%22Transplant+Proc%22%5BJournal%5D)">Factors affecting human islet of Langerhans isolation yields.</a> Transplant Proc. 34, 826-827 (2002).</li>
</ol>

Ci sono una varietà di fattori che influenzano il risultato dell&#39;isolamento 9,10. Tra questi, la digestione del tessuto pancreatico gioca un ruolo di primo piano. Sulla base della nostra esperienza umana isolamento delle isole, abbiamo riassunto i seguenti punti critici, che potrebbe potenzialmente influenzare il rendimento delle isole e la qualità. <ol><li> Il tempo di digestione è diversa quando i diversi tipi di enzimi sono utilizzati. </li><li> Non appena il 40-50% delle isole completamente separate dal tess...

<table><tbody><tr><td>Macchina per Slush di Ghiaccio</td><td>attrezzatura</td><td>Taylor Company</td><td>K4036546</td><td>produrre ghiaccio sterile</td></tr><tr><td>Centrifuga</td><td>attrezzatura</td><td>Beckman Coulter Inc.</td><td>424803</td><td></td></tr><tr><td>Microscopio Invertito MZ6 TLBD4.1</td><td>attrezzatura</td><td>Leica Microsystems</td><td>4103</td><td></td></tr><tr><td>Piatto per Coltura Cellulare con Griglia da 2 mm</td><td>attrezzatura</td><td>Nalge Nunc international</td><td>174926</td><td>conteggio degli isolotti</td></tr><tr><td>Bagno Termoregolato Digitale EX7</td><td>attrezzatura</td><td>NesLab</td><td>105361058</td><td></td></tr><tr><td>Termometro</td><td>attrezzatura</td><td>IBI:IR</td><td>60444</td><td></td></tr><tr><td>Bilancia MonoBloc AB 104-S</td><td>attrezzatura</td><td>Mettler Toledo</td><td>1119430864</td><td>misurare il peso del pancreas</td></tr><tr><td>Regolatore di Velocità MasterFlex II</td><td>attrezzatura</td><td>Cole-Parmer</td><td>J00006445</td><td>regolare la velocità di flusso durante la digestione</td></tr><tr><td>Digital Sight DS L1</td><td>attrezzatura</td><td>Nikon Instruments</td><td>217267</td><td></td></tr><tr><td>Unità di Perfusion</td><td>attrezzatura</td><td>Prodotto su Misura</td><td>n/a</td><td></td></tr><tr><td>Refrigeratore per unità di perfusione</td><td>attrezzatura</td><td>Fisher Scientific</td><td>3013P</td><td></td></tr><tr><td>Camera di Ricordi</td><td>attrezzatura</td><td>University of Miami</td><td>n/a</td><td></td></tr><tr><td>Soluzione di Diluizione RPMI</td><td>reagente</td><td>Mediatech, Inc.</td><td>99783024</td><td></td></tr><tr><td>Soluzione dell'Università del Wisconsin (UW)</td><td>reagente</td><td>DURAMED</td><td>1000-46-06</td><td></td></tr><tr><td>Soluzione Salina Tamponata di Hank&amp;rsquo;s (HBSS)</td><td>reagente</td><td>Mediatech, Inc.</td><td>99-597-CM</td><td></td></tr><tr><td>Albumina Umana al 25%</td><td>reagente</td><td>GRIFOLS</td><td>NDC 61953-0002-2</td><td></td></tr><tr><td>Mezzo M199 (soluzione di lavaggio)</td><td>reagente</td><td>Mediatech, Inc.</td><td>99-784-CM</td><td></td></tr><tr><td>Collagenasi NB1 di grado GMP</td><td>reagente</td><td>SERVA Electrophoresis</td><td>N0002937</td><td></td></tr><tr><td>Proteasi Neutra NB1 di grado GMP</td><td>reagente</td><td>SERVA Electrophoresis</td><td>N0002936</td><td></td></tr><tr><td>Betadine</td><td>reagente</td><td>Cardinal Health</td><td>29906-004</td><td></td></tr><tr><td>Cefazolina</td><td>reagente</td><td>West-Ward Pharmaceutical</td><td>NDC 0143-9924-90</td><td></td></tr><tr><td>Ditizone</td><td>reagente</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D5130</td><td></td></tr></tbody></table>

isolamento delle isole pancreatiche umane: parte i: digestione e collezione di tessuto pancreatico

Human Pancreatic Islet Isolation: Part I: Digestion and Collection of Pancreatic Tissue

Gestione del diabete di tipo 1 è onerosa, sia per l&#39;individuo e la società, che costano oltre 100 miliardi di dollari all&#39;anno. Nonostante l&#39;uso diffuso di monitoraggio della glicemia e insulina formulazioni nuove, molte persone ancora sviluppare devastanti complicanze secondarie. Trapianto di isole pancreatiche in grado di ripristinare nei pressi di controllo normale del glucosio in pazienti diabetici<sup&gt; 1</sup&gt;, Senza il rischio di gravi episodi di ipoglicemia che sono associati con la terapia insulinica intensiva. Fornire sufficiente massa isolotto è importante per il trapianto di isole pancreatiche di successo. Tuttavia, caratteristica dei donatori, reperimento di organi e la conservazione influenzare l&#39;esito isolamento<sup&gt; 2</sup&gt;. Presso l&#39;Università dell&#39;Illinois a Chicago (UIC), abbiamo sviluppato un protocollo di successo isolamento con pendenza purificazione migliorato<sup&gt; 3</sup&gt;. Il programma è iniziato nel gennaio 2004, e più di 300 isolamenti sono stati effettuati fino a novembre 2008. Il pancreas sono stati inviati nelle soluzioni di conservazione a freddo (UW, University of Wisconsin o HTK, Istidina, Triptofano chetoglutarato)<sup&gt; 4-7</sup&gt; Al Laboratorio cella d&#39;isolamento a UIC per l&#39;isolamento delle isole. Isole pancreatiche sono stati isolati con il metodo UIC, che è una versione modificata del metodo originariamente descritto da Ricordi<em&gt; Et al</em&gt;<sup&gt; 8</sup&gt;. In breve, dopo aver pulito il pancreas dal tessuto circostante, è stato perfuso con soluzione enzimatica (Serva Collagenasi + Neutro Sigma enzima proteasi o V). Il pancreas è stato dilatato poi trasferito nella camera di digestione Ricordi, collegato ad una modifica, sistema chiuso tubi circolazione, e riscaldato a 37 ° C. Durante la digestione, la camera era scosso dolcemente. I campioni sono stati presi costantemente per monitorare il processo di digestione. Una volta libero isolette sono state rilevate al microscopio, la digestione è stato fermato da lavaggio a freddo (4 ° C) RPMI soluzione di diluizione (Mediatech, Herndon, VA) nel sistema di circolazione per diluire l&#39;enzima. Dopo essere raccolte e lavate in M199 mezzi di comunicazione integrato con albumina umana, il tessuto è stato campionato per la pre-purificazione contare e incubati con soluzione UW prima purificazione. Processo di purificazione saranno descritti nella Parte II: La purificazione e la cultura di isole umane.

Il raggiungimento di alta qualità e la quantità appropriata di isole umane è uno dei presupposti importanti per il trapianto di isole pancreatiche di successo. In questo video, si descrive passo dopo passo le procedure per l&#39;isolamento delle isole pancreatiche umane (I parte: la digestione e la raccolta di tessuto pancreatico) utilizzando un metodo modificato automatizzato.

Isolamento delle isole pancreatiche umane: Parte I: Digestione e Collezione di tessuto pancreatico

La gestione del diabete di tipo 1 è onerosa, sia per l'individuo che per la società, con costi che superano i 100 miliardi di dollari all'anno. Nonostante l'ampio utilizzo di...

Questa procedura inizia con il prelievo di tessuto pancreatico da donatore normale. Dopo una breve fase di taglio, il pancreas disteso viene diviso in pezzi uniformi e trasferito nella camera di digestione. Il pancreas viene cannullato e una soluzione di collaghenasi viene infusa attraverso la cannula mediante una macchina di perfusione automatica.Infine, il tessuto pancreatico viene raccolto in provette coniche di grande volume e successivamente purificato ulteriormente per il trapianto di isolotti, come verrà mostrato in un video successivo. Ciao, sono American Chief del Laboratorio del Programma Isolotti Umani del Dipartimento di Survey presso l'Università dell'Illinois a Chicago. Ciao, mi chiamo Barbara Barbero e anch'io faccio parte del Programma Isolotti Umani.Oggi vi mostreremo un procedimento per l'isolamento di isolotti pancreatici umani. Utilizziamo questo procedimento nel nostro laboratorio per raccogliere isolotti umani di alta qualità destinati all'uso clinico. Cominciamo.L'isolamento degli occhielli umani è una procedura dipendente dal tempo che richiede lavoro di squadra e pertanto sono necessarie quattro persone per eseguirla. La squadra è guidata dal chirurgo che disseca e cannulla il pancreas. L'isolamento degli occhielli inizia al minuto in cui la squadra entra nella struttura di isolamento degli occhielli presso l'UIC.I membri del team si assicurano che tutti gli strumenti necessari, come la centrifuga, siano controllati e accesi. Inoltre, provvedono a sanificare tutte le cappe e le superfici. Due persone prepareranno il tavolo per la cannulazione, la macchina per la digestione con bagno di ghiaccio, il circuito di perfusione, la macchina per la purificazione dell'unità COPE e i tavoli chirurgici.Contemporaneamente, altri due membri del team prepareranno i mezzi necessari durante l'isolamento. Successivamente, vengono preparati i tubi per batteriologia, i tubi per il campionamento e i tubi e le piastre per la valutazione. Preparare il set di tubi per la purificazione come segue: il primo tubo vuoto e contrassegnato a 150 millilitri.I tubi dal due al dodici riempiti con 200 millilitri di mezzo M1 99, integrato con albumina umana o soluzione di lavaggio e contrassegnati a 230 millilitri. E infine, un tubo conico da 50 millilitri riempito con 50 millilitri di soluzione di lavaggio.Una volta completati questi passaggi preparatori, siamo pronti per iniziare la preparazione e la perfusione del pancreas. Per iniziare la preparazione e la perfusione del pancreas, un operatore rimuove l'organo dall'imballaggio. Utilizzando una tecnica sterile, il chirurgo trasferirà il pancreas al tavolo di decontaminazione.Il chirurgo riempirà una siringa da 60 cc con la soluzione originale di conservazione del pancreas e la consegnerà a un operatore, che la utilizzerà per riempire le provette batteriologiche per il prelievo già preparate. Dopo un'ispezione visiva per determinare se l'organo è adatto all'isolamento degli isolotti, il chirurgo chiederà a un operatore di preparare il collaghenasi oggi. Preparare è un atto completo.Se il pancreas è danneggiato durante il reperimento o presenta un'anatomia anomala, non può essere utilizzato per l'isolamento delle isole. Ricordare che il tempo di sospensione in Resus varia a seconda del marchio e del lotto dell'enzima. Quando il chirurgo è pronto, portare le soluzioni di decontaminazione al tavolo di decontaminazione e versarle nei contenitori appropriati.Il chirurgo disinfetterà il pancreas lavandolo per un minuto. Successivamente, in ciascuna delle soluzioni di decontaminazione, il pancreas viene posto in un piccolo barattolo sterile nel quale verrà pesato. Dopo aver inserito il peso nel registro del lotto, il pancreas viene collocato nel vassoio per la cannuolatura.Con alcune soluzioni di conservazione, il chirurgo espone e incide parzialmente il dotto principale e canula ciascuna metà del pancreas con una cannula fissata mediante sutura per perfondere il pancreas. In primo luogo, spostarlo sull'unità di perfusione e versare la soluzione enzimatica nel bacino. Il tempo totale di perfusione è di circa 10 minuti a 80 millimetri di mercurio per cinque minuti.Quindi, a 180 millimetri di mercurio per cinque minuti, il pancreas apparirà disteso. Dopo la perfusione, spostare il pancreas perfuso nel vassoio per la cannuolatura, dove il tessuto adiposo viene accuratamente rimosso dal pancreas. Successivamente, tagliare il pancreas in 10-12 pezzi e trasferirlo nella camera di registrazione per la digestione.Per iniziare la fase di digestione, trasferire il pancreas nella camera di registrazione vuota. Aggiungere una fiala da un millilitro e mezzo di pulmozima posizionata sullo schermo avendo cura di non ostruire la camera, chiudere la camera e riempire il sistema. Avviare la pompa della soluzione per cinque minuti.Muovere delicatamente la camera per distribuire uniformemente la soluzione calda al suo interno. Dopo cinque minuti, agitare delicatamente la camera per tutta la fase di digestione. Mantenere la temperatura a 37 gradi Celsius.Prelevare un campione ogni due minuti e verificare, mediante microscopio, la presenza di anelli liberi; registrare le informazioni di valutazione degli anelli nella tabella della digestione del registro del lotto. Continuare a monitorare la percentuale di anelli fino a quando il 50% di essi risulterà galleggiante, libero e isolato in soluzione. Una volta raggiunto il 50% di anelli liberi nei campioni, arrestare la digestione aggiungendo la soluzione diluente RPMI fredda.Il tessuto circuito viene raccolto in provette coniche da 500 millilitri pre-riempite con 30 millilitri di albumina umana. Centrifugare le provette coniche a 1100 giri al minuto per un minuto a quattro gradi Celsius.Dopo aver centrifugato i tubi, aspirare il soprannatante e lavare il pellet. Con la soluzione di lavaggio fredda, unire tutti i tubi di raccolta sospesi con tessuto pancreatico digerito in un singolo conico da 500 millilitri. Quando un tubo è pieno di tessuto lavato, centrifugare e ripetere il processo di lavaggio fino a quando tutto il tessuto è stato lavato più volte.Centrifugare questa provetta e trasferire il tessuto in un singolo tubo conico da 250 millilitri. Portare il volume a 250 millilitri con soluzione lavante M1 99, integrata con albumina umana, e preparare per il campionamento. Prelevare un campione di un millilitro con una pipetta e aggiungerlo a un tubo conico da 15 millilitri precedentemente riempito con nove millilitri di soluzione lavante.Quindi, mescolare delicatamente capovolgendo il tubo conico da 15 millilitri. Prelevare da questo campione un millilitro direttamente in una camera di conta a griglia. Contare le cellule e calcolare il numero di cellule.Utilizzando un fattore di diluizione di 2, centrifugare il tubo conico da 250 millilitri e aggiungere 150 millilitri di soluzione UW (University of Wisconsin). Dopo l'aggiunta dell'UW, emulsionare accuratamente la sospensione cellulare mediante pipetta, registrare l'operazione e comunicarla all'operatore della purificazione.Il tempo di inizio in uw. Lasciare le provette sul ghiaccio e agitare occasionalmente. A questo punto gli occhielli possono essere ulteriormente purificati; viene prelevato un campione di tessuto pancreatico non purificato per il conteggio.Quando la soluzione di dione viene aggiunta al campione, solo la popolazione di isolotti pancreatici verrà colorata di rosso. Successivamente, la loro qualità e quantità possono essere valutate. Abbiamo appena dimostrato una procedura per isolare un elevato numero di isolotti pancreatici umani di alta qualità, elemento fondamentale per un trapianto di isolotti riuscito.In base alla nostra esperienza, non appena il 40-50% degli occhielli umani è libero dai tessuti circostanti, è necessario interrompere immediatamente la digestione diluendo e raffreddando la miscela di digestione. È inoltre fondamentale manipolare delicatamente il tessuto durante il prelievo, il lavaggio e il mescolamento. Raccomandiamo di utilizzare il metodo di purificazione U University really nice Chicago, che consente un recupero superiore di occhielli umani altamente puri.Questo metodo ha inoltre notevolmente ridotto il tempo di isolamento, il che minimizzerà il danno associato all'ischemia nel capezzolo. È tutto. Grazie per aver guardato e buona fortuna con i vostri esperimenti.

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Il raggiungimento di alta qualità e la quantità appropriata di isole umane è uno dei presupposti importanti per il trapianto di isole pancreatiche di successo. In questo video, si descrive passo dopo passo le procedure per l'isolamento delle isole pancreatiche umane (parte II: la purificazione e la cultura di isole umane) utilizzando un metodo modificato automatizzato.

Isolamento del pancreas umano Islet: Parte II: La purificazione e la cultura di isole umane

La fornitura di diabete di tipo 2 isolotti per la ricerca è insufficiente. Qui condividiamo il nostro protocollo per isolare isolotti da pazienti sottoposti a pancreatectomia parziale. Questo approccio rappresenta un luogo unico per l'ottenimento di isolotti da diabete di tipo 2 e clinicamente abbinati soggetti non diabetici ed in numero sufficiente per gli studi di base e clinica.

Isolamento di isole umane da pazienti parzialmente Pancreatectomized

Le isole pancreatiche, chiamate anche isole di Langerhans, sono un gruppo di cellule endocrine che producono ormoni per la regolazione del glucosio e altre importanti funzioni biologiche. Questo protocollo spiega un metodo per isolare le isole pancreatiche mediante prima perfusione di collagenasi tramite l'ampolla di Vater per digerire il tessuto pancreatico esocrino e una centrifugazione semplificata in gradiente di densità per purificare le isole dai topi.

Isolamento delle isole pancreatiche attraverso la perfusione di collagenasi: un metodo enzimatico per isolare le cellule delle isole pancreatiche

sfide critiche per il campo di ricerca sul diabete sono di comprendere i meccanismi molecolari che regolano la replicazione isolotto β-cellule e di sviluppare metodi per stimolando la rigenerazione delle cellule β-. Qui un metodo ad alto contenuto di screening per identificare e valutare l'attività di replica di promozione β-cellule di piccole molecole è presentato.

A High-contenuti<em&gt; In Vitro</em&gt; La replica della piattaforma Discovery isole pancreatiche β-cellule

Descriviamo qui un protocollo per isolare isolotti intatti da topi neonati. Pancreas sono stati parzialmente digerito con collagenasi, seguita da lavaggio e raccolta manuale. 20 - 80 clusters insule possono essere ottenuti per pancreas da topi appena nati, che sono adatti per diversi studi insulari.

Efficace isolamento di isole funzionali da neonatali mouse Pancreas

Questo protocollo di isolamento dell'isolotto ha descritto una nuova via di iniezione di collagenasi per digerire il tessuto esocrino e una procedura di gradiente semplificata per purificare le isole dai topi. Si tratta di digestione ezimatica, separazione/purificazione del gradiente e raccolta a mano dell'isolotto. Il successo dell'isolamento può produrre 250-350 isolotti di alta qualità e completamente funzionali per mouse.

Un semplice protocollo ad alta efficienza per l'isolamento delle isolozioni pancreatiche dai topi

Qui, presentiamo un protocollo per generare dati trascrittomi su larga scala di alta qualità e su larga scala di singole cellule da isole pancreatiche umane isolate utilizzando una tecnologia di sequenziamento di RNA microfluidico a celle a goccia.

Sequenziamento dell'RNA a singola cellula e analisi delle isole pancreatiche umane

Le cellule metaplastiche pancreatiche sono precursori di cellule maligne che danno origine ai tumori pancreatici. Tuttavia, isolare le cellule pancreatiche vitali intatte è difficile. Qui presentiamo un metodo efficiente per la dissociazione del tessuto pancreatico. Le cellule possono quindi essere utilizzate per il sequenziamento di RNA a singola cellula (scRNA-seq) o per la co-coltura bi- o tridimensionale.

Dissezione del tessuto pancreatico per isolare singole cellule vitali

Questo studio ha sviluppato un metodo semplificato per estrarre in modo efficiente isolotti primari funzionali e cellule acinar dal pancreas del topo, offrendo uno strumento prezioso per studiare la comunicazione intercellulare nella patogenesi del diabete indotto da pancreatite acuta.

Un metodo semplice e rapido per l'isolamento simultaneo degli isolotti primari e delle cellule acinari pancreatiche primarie da topi

Questo protocollo descrive un metodo standardizzato per il prelievo chirurgico, la digestione enzimatica e la purificazione con gradiente di densità degli isolotti pancreatici del ratto Lewis, consentendo preparazioni ad alta resa e alta purezza per l'uso diretto in studi di trapianto o in vitro .

Isolamento e purificazione degli isoli pancreatici da ratti Lewis tramite digestione enzimatica e separazione tra densità e gradiente

Impara l'isolamento delle isole pancreatiche umane per la biologia del trapianto usando un metodo automatizzato con perfusione di collagenasi. Questa procedura migliora la qualità e la quantità delle isole per uso clinico.

Isolamento delle isole pancreatiche umane: Parte I: Digestione e Collezione di tessuto pancreatico

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