Monitoraggio ormoni vegetali Durante risposte allo stress

Questa procedura inizia con l'omogeneizzazione del materiale vegetale mediante sfere di ceramica ed estrazione successiva con metano diclorato per ottenere la fase organica. Dopo la centrifugazione, i campioni vengono essiccati sotto flusso d'aria e preparati per l'estrazione in fase vapore. Dopo l'elusione dai filtri dell'estrazione in fase vapore, si può procedere all'analisi degli ormoni vegetali mediante spettrometria di massa e cromatografia gassosa.

Ciao, sono Marie Engelberg del JU Engelberg Lab del Dipartimento di Biologia dell'Università del Texas qui a San Antonio, e io sono Ju Engelberg. Oggi vi mostreremo un semplice procedimento per la quantificazione simultanea di importanti ormoni vegetali. Utilizziamo regolarmente questo metodo per monitorare le variazioni di questi ormoni nelle piante in risposta alla tecnica di ricompensa insetti.

È inoltre possibile monitorare le variazioni nella composizione degli acidi grassi. Cominciamo dunque. Per l'estrazione, è necessario preparare dapprima delle provette con tappo a vite da due millilitri.

Per fare ciò, aggiungere 400 microlitri di soluzione di estrazione e 10 microlitri dello standard interno corrispondente a 10 nanogrammi per microlitro in un vial. Successivamente, congelare i vial in azoto liquido. Dopo il congelamento, aggiungere le sfere di ceramica nei vial.

Mentre le provette sono ancora posizionate nell'azoto liquido, aggiungere il materiale vegetale compreso tra 50 e 200 milligrammi. Tenere presente che il peso del materiale vegetale aggiunto deve essere stimato prima di ulteriori elaborazioni, al fine di consentire una quantificazione esatta successiva, basata sul peso fresco. Assicurarsi che tutto l'azoto liquido sia evaporato prima di chiudere ermeticamente la provetta con un tappo.

Assicurarsi che il cappuccio disponga di una guarnizione di gomma per prevenire fuoriuscite di solventi e composti estratti durante l'omogeneizzazione. Omogeneizzare il tessuto in un omogeneizzatore rapido o in un macinino a sfere PSUs. Utilizzare l'omogeneizzatore a una velocità di 6.000 per i PSUs per 30 secondi.

Dopo aver omogeneizzato, rimuovere singolarmente le provette dall'omogeneizzatore e aprire con attenzione il tappo per aggiungere un millilitro di diclorometano a ciascun campione, richiudere nuovamente le provette ermeticamente e omogeneizzare per 10-15 secondi a 6.000; dopo l'omogeneizzazione, trasferire le provette in una centrifuga da banco e separare la fase organica da quella acquosa a 10.000 ×g per 60 secondi. Dopo la separazione delle fasi, trasferire lo strato verde inferiore dalle singole provette in una provetta di vetro pulita da quattro millilitri.

Questa è la fase organica contenente gli ormoni e gli standard interni. Evitare il trasferimento dell'acqua o della fase superiore; rimuovere il solvente con aria attraverso un manifold per circa da 10 a 25 minuti. La durata dipenderà dal campione.

Verificare con una singola punta per il flusso d'aria per osservare attentamente se i campioni sono secchi. Assicurarsi di non eccessivamente essiccare i campioni poiché ciò potrebbe causare la perdita di composti. Una volta che i campioni sono asciutti, possiamo iniziare la metilazione dei composti contenenti acidi carbossilici nei nostri campioni.

Per prima cosa, aggiungere 100 microlitri di una miscela di etere dietilico e metanolo in rapporto 9:1 (v/v) in ogni provetta. Successivamente, aggiungere 4 microlitri di una soluzione di diazometano trimetil-sililato 2 M in esano. Chiudere immediatamente le provette con un tappo a vite senza chiusura ermetica, dotato di setto in silicone rivestito in teflon, agitare delicatamente le provette e incubare a temperatura ambiente per 25-30 minuti.

Accendere un blocco riscaldante e impostarlo alla temperatura desiderata per la raccolta. La volatilità dei composti metilati varierà in base alla loro dimensione e al numero di gruppi polari. Le temperature possono variare tra 80 e 200 gradi; dopo un'incubazione di 30 minuti, arrestare la reazione di metilazione aggiungendo quattro microlitri di una soluzione due molare di acido acetico in esano a ciascun vial.

Questo viene fatto per evitare reazioni secondarie indesiderate. I filtri utilizzati per l'estrazione in fase vapore sono artigianali e realizzati con tubi in teflon.

Da un lato, viene inserito un tubo di vetro ben aderente di circa quattro centimetri di lunghezza. Si possono vedere i due dischi in rete di acciaio inossidabile, che contengono circa da 20 a 30 milligrammi di materiale assorbente. Lavare i filtri che verranno utilizzati per la raccolta degli ormoni vegetali metilati e volatili usando 200 microlitri di metanolo.

Successivamente, lavare i filtri due volte con 200 microlitri di cloroformio. Lasciare asciugare all'aria per rimuovere il solvente residuo dai filtri. I filtri possono ora essere utilizzati per l'accumulo di ormoni volatili mediante estrazione in fase vapore.

Dopo 30 minuti di incubazione dei campioni, i setti di gomma dei tappi dei vial da quattro millilitri vengono tagliati con un bisturi. Ora il materiale estratto è pronto per essere raccolto al fine di isolare gli ormoni vegetali mediante estrazione in fase vapore. I filtri puliti vengono collegati a linee di vuoto singole con una portata di circa 800 millilitri al minuto.

I filtri vengono quindi inseriti nel vial attraverso le settazioni tagliate. Viene anche inserita una piccola punta di pipetta per fungere da ingresso dell'aria. Durante questa fase iniziale della procedura, i vial con i filtri inseriti devono essere mantenuti in posizione verticale per evitare che il liquido presente all'interno del vial venga a contatto con la punta del filtro, il che comporterebbe la contaminazione del filtro.

Successivamente, il GCMS trattiene manualmente le provette fino a quando tutto il liquido è evaporato attraverso il filtro. Quindi, le provette con i filtri applicati vengono posizionate sul blocco riscaldante e i composti evaporati termicamente vengono raccolti per tre minuti. Dopo questo passaggio finale di estrazione in fase vapore, posizionare le provette con i filtri ancora applicati su un supporto e lasciarle raffreddare.

Preparare viali GC da 1,5 millilitri dotati di inserti quando i filtri hanno raggiunto la temperatura ambiente. Inserire nuovamente un loop da 150 microlitri di diclorometano nei viali. Dopo aver espulso il solvente residuo dal filtro, i viali vengono chiusi con tappo e possono essere analizzati mediante cromatografia gassosa spettrometria di massa.

Per l'analisi, utilizzare un cromatografo a gas dotato di un'iniettore split-splitless collegato a uno spettrometro di massa funzionante in modalità di ionizzazione chimica; dopo l'iniezione, i composti vengono separati su una colonna HP-1 MS mantenuta a 40 gradi Celsius per un minuto. La temperatura è programmata con un incremento di 15 gradi Celsius al minuto fino a 250 gradi Celsius, mantenuta per 10 minuti, usando elio come gas trasportatore a un flusso costante di 0,7 millilitri al minuto. Per l'analisi basata su spettrometria di massa, sia uno spettrometro di massa a quadrupolo sia uno a trappola ionica possono essere utilizzati come fonte CI.

È possibile utilizzare sia l'isobutano che il metanolo. Tuttavia, in ogni caso, è necessario verificare i frammenti della reazione di ionizzazione prima di creare i programmi di conteggio degli ioni selezionati. Utilizziamo un sistema gascromatografico GC 3,900 accoppiato a uno spettrometro di massa Saturn MS 2200, impiegando il metanolo come reagente per l'ionizzazione chimica.

Consultare il nostro protocollo scritto per una descrizione del programma. Assicurarsi che tutti i composti siano identificati mediante confronto con standard autentici disponibili in commercio. La quantificazione di JA SA e A BA viene effettuata correlando l'area del picco degli ioni estratti con l'area del picco degli ioni estratti dello standard interno corrispondente ed è inoltre basata sul peso fresco del materiale vegetale utilizzato.

Dopo l'estrazione dei dati dai file GCM S ed alcuni calcoli, abbiamo riscontrato che l'ethin ha indotto accumuli considerevoli di acido salicilico, acido monico e anche acido abscissico rispetto ai controlli non trattati. I dati per ciascun ormone singolo sono stati ottenuti da un'unica corsa cromatografica e dimostrano la capacità di questo metodo nell'analisi multiplex degli ormoni. Vi abbiamo appena mostrato una procedura semplice ma al contempo efficace per estrarre e quantificare importanti ormoni vegetali e altri composti di segnalazione.

È facile da eseguire e la maggior parte degli strumenti mostrati può essere realizzata facilmente con materiali di laboratorio standard. È tutto. Grazie per aver guardato e buona fortuna con i vostri esperimenti.