Channelrhodopsin2 stimolazione mediata dei potenziali Synaptic a Drosophila Giunzioni neuromuscolari

Questa procedura inizia con la coltivazione di drosophila. Terzi larve in stadio di instar con il genotipo appropriato vengono allevati su cibo contenente retinolo tutto trans. Ogni larva viene fissata per testa e coda.

Quindi FLA piatto. Il cervello e i nervi posteriori vengono quindi recisi per interrompere l'attività motoria ritmica. Successivamente, la sorgente di luce LED blu con scatola di controllo viene regolata e focalizzata sul preparato.

Infine, utilizzare un elettrodo affilato per impalare il muscolo sei. Quindi erogare impulsi luminosi mediante una sorgente di tensione. Ciao, sono Nicholas Marstein del laboratorio della dottoressa Leslie Griffith, del Dipartimento di Biologia dell'Università di Brandeis.

Ciao, sono Stefan Pulver, anch'io del laboratorio Griffith. Oggi vi mostreremo la procedura per evocare potenziali sinaptici con channelrhodopsin-2 alla giunzione neuromuscolare della larva di drosophila. Utilizziamo questa procedura nel nostro laboratorio per studiare la fisiologia sinaptica e la drosophila.

Lo utilizziamo inoltre per insegnare la fisiologia sinaptica e per lezioni pratiche in laboratorio. Cominciamo dunque. Per iniziare questo protocollo, mantenere linee di moscerini UAS channel redsin due e okay, 3 7, 1 gal quattro in bottiglie separate contenenti un comune mezzo per moscerini.

Raccogliere esemplari vergini dalle linee di moscerini 3 7, 1 gal, quattro linee, e maschi dalla linea UAS channel redsin. Due linee. Successivamente, preparare un mezzo per moscerini mescolato con un millimolare di all-trans retinolo o a TR. Per fare ciò, sciogliere il mezzo standard per moscerini in un forno a microonde per circa un minuto.

Dopo che il mezzo è fuso, lasciarlo raffreddare per circa 30-60 secondi, quindi aggiungere 100 microlitri di TR 100 millimolare in etanolo al 100% per ogni 10 millilitri di mezzo per moscerini. Quando le provette contenenti il mezzo con TR sono pronte, inserire in ciascuna provetta i maschi e le femmine raccolti. Collocare le provette in un'area buia a una temperatura compresa tra 22 e 25 gradi Celsius, in modo che i moscerini si accoppino e depongano le uova; attendere quattro o cinque giorni fino a quando non saranno visibili larve di terzo stadio.

A questo punto, è possibile smaltire le mosche adulte. Ora siamo pronti per procedere con l'allestimento del sistema di elettrofisiologia. Collegare qualsiasi oculare del microscopio da dissezione a una sorgente di luce LED blu dotata di dissipatore di calore.

Utilizzare un supporto e una morsetto per fissare una base magnetica all'oculare e alla sorgente luminosa LED. Posizionare la base magnetica sulla tavola antivibrante del sistema di elettrofisiologia. Successivamente, collegare la sorgente luminosa a un circuito di controllo, quindi connettere il circuito di controllo a una sorgente di tensione esterna.

Utilizziamo l'uscita di tensione del sistema di acquisizione dati per elettrofisiologia PowerLab prodotto da AD Instruments. Una volta collegato alla sorgente di tensione, applicare impulsi di uno a cinque volt al circuito di controllo per attivare la luce blu, quindi regolare la base magnetica e la sorgente luminosa finché il fascio di luce blu non è focalizzato sull'area che ospiterà la dissezione della larva. Dopo aver effettuato le regolazioni appropriate, siamo pronti a procedere con la dissezione della larva.

Per iniziare la dissezione, inserire sei perni di 0,1 millimetri sul fondo di una capsula di Sögarh. Rimuovere una larva di terzo stadio dal mezzo di coltura e posizionarla in una qualsiasi capsula di Petri in plastica. Sciacquare le larve con soluzione fisiologica per rimuovere qualsiasi residuo di cibo aderente.

Quindi posizionare i larve nella piastra per dissezione vicino ai perni estratti e riempire la piastra fino a metà con soluzione fisiologica. Ora orientare le larve in modo da poter vedere due tubicini argentati che corrono lungo la superficie dorsale dell'animale. Questi tubicini argentati sono la trachea.

Inserire un grosso spillo direttamente nella coda, tra i tubi tracheali. Tenere ferma la larva e inserire un secondo grosso spillo nella testa. Assicurarsi di allungare il corpo longitudinalmente durante l'inserimento dello spillo.

Usare le forbici per praticare una piccola incisione vicino alla coda. Continuare l'incisione lungo tutta la lunghezza del corpo. Assicurarsi che le punte delle forbici siano sollevate per evitare di tagliare i nervi ventrali e/o i muscoli della parete corporea.

Posizionare quattro spilli sugli angoli del campione animale. Ora aprire la regione mediana. Inserire gli spilli nella bacinella per dissezione in modo da filettare l'animale.

Fissare anche il preparato in modo che sia tenuto con pinzette e forbici. Rimuovere gli organi digestivi, la trachea e i corpi adiposi dell'animale. Sciacquare il preparato con soluzione salina.

Dopo il risciacquo, individuare i lobi frontali e il ganglio ventrale del preparato utilizzando forbici microchirurgiche. Tagliare con attenzione attraverso il ganglio ventrale appena dietro i lobi frontali. Una volta completata la dissezione, procedere con la stimolazione alla luce blu e la registrazione dell'attività muscolare.

Per eseguire la registrazione muscolare, preparare un elettrodo con una resistenza compresa tra 10 e 20 megaohm. Utilizzando un estrattore elettronico di elettrodi, riempire l'elettrodo estratto con cloruro di potassio 3 molare. Posizionare l'elettrodo riempito nel portaelettrodo.

Ora posizionare il preparato larvale sotto un microscopio stereoscopico sul dispositivo. Regolare la luce blu in modo che il preparato dissezionato sia centrato nel fascio luminoso. Identificare il muscolo sei o M sei in qualsiasi segmento della parete corporea della larva utilizzando un micromanipolatore, inserire con attenzione l'elettrodo nel muscolo M sei e osservare un'eventuale rapida iperpolarizzazione del muscolo.

I potenziali di membrana a riposo devono essere compresi tra -30 millivolt e -70 millivolt. Una volta inserito correttamente l'elettrodo, applicare impulsi di tensione della durata di 20-100 millisecondi al circuito di controllo. Aumentare progressivamente la tensione fornita al circuito di controllo.

Osservare i potenziali di giunzione eccitatori nella cellula muscolare. Di seguito è riportato un risultato rappresentativo che mostra un potenziale di giunzione eccitatorio evocato da brevi impulsi luminosi. L'ampiezza del potenziale di giunzione eccitatorio mostrata qui è l'ampiezza sommata di due neuroni motori che sono entrambi noti per attivarsi.

M sei. Intensità più basse o durate più brevi della luce possono rivelare il potenziale giunzionale eccitatorio di minore ampiezza proveniente da un singolo neurone motore. Vi abbiamo appena mostrato come eseguire la stimolazione mediata da canale stradale assente due dei potenziali sinaptici alla giunzione neuromuscolare oph.

Quando si esegue questa procedura, è importante ricordare di non danneggiare la parete corporea del preparato durante la dissezione. È inoltre importante ricordare che, sebbene un preparato possa risultare eccessivamente eccitato subito dopo la dissezione, con il tempo si calmerà permettendo registrazioni di buona qualità. Quando si infilano i muscoli, prestare attenzione a non andare al di sotto del primo strato muscolare entrando nella parete corporea.

Quando l'elettrodo è inserito nella parete corporea, a volte è possibile ottenere potenziali iperpolarizzati senza tuttavia trovarsi effettivamente all'interno di una cellula muscolare. Ecco tutto.

Grazie per aver guardato e buona fortuna con i vostri esperimenti.