Channelrhodopsin2 stimolazione mediata dei potenziali Synaptic a Drosophila Giunzioni neuromuscolari

Questa procedura inizia con la coltivazione della drosofila. In terzo luogo, instar i vermi con il genotipo appropriato su alimenti contenenti tutto il retinolo trans. Ogni verme è appuntato con la testa e la coda.

Poi FLA flat. Il cervello e i nervi posteriori vengono quindi tagliati per interrompere l'attività motoria ritmica. Successivamente, la sorgente luminosa a LED blu con scatola di controllo viene regolata e focalizzata sulla preparazione.

Infine, usa un elettrodo affilato per impalare il muscolo sei. Quindi erogare impulsi luminosi con una sorgente di tensione. Ciao, sono Nicholas Marstein del laboratorio del Dr.Leslie Griffith, il Dipartimento di Biologia della Brandeis University.

Ciao, sono Stefan Pulver, anche lui del Griffith Lab. Oggi vi mostreremo la procedura per evocare i potenziali sinaptici con la radice del canale assente due alla giunzione neuromuscolare della larva di Drosophila. Usiamo questa procedura nel nostro laboratorio per studiare la fisiologia sinaptica e la drosofila.

Lo usiamo anche per insegnare agli studenti la fisiologia sinaptica e i laboratori didattici. Quindi iniziamo. Per iniziare con questo protocollo, mantenere il canale UAS redsin due e ok, 3 7, 1 gallone quattro linee di mosca in bottiglie separate contenenti terreni di mosca standard.

Raccogli vergini dal, ok, 3 7, 1 gallone, quattro lenze da mosca e maschi dal canale UAS redsin. Due righe. Quindi, prepara un terreno di coltura per mosche che viene mescolato con un millimolare, tutto il retinolo trans o un TR.To fare questo sciogliere il normale mezzo di trasmissione in un forno a microonde per circa un minuto.

Una volta sciolto, lasciare raffreddare il terreno per circa 30-60 secondi, quindi aggiungere 100 microlitri di 100 millimolari a TR in etanolo al 100% per ogni 10 millilitri di terreno di coltura per mosche. Quando i flaconcini contenenti un terreno TR sono pronti, inserire i maschi e le femmine raccolti in ciascun flaconcino. Posiziona le fiale in un'area buia a 22-25 gradi Celsius per consentire alle mosche di accoppiarsi e deporre le uova, attendi quattro o cinque giorni fino a quando non sono visibili le terze larve stellate.

A questo punto, puoi sbarazzarti delle mosche adulte. Ora siamo pronti per procedere con l'allestimento del rig di elettrofisiologia. Collegare qualsiasi oculare per cannocchiale da dissezione a una sorgente luminosa a LED blu con un dissipatore di calore.

Utilizzare un perno e un morsetto per fissare una base magnetica all'oculare e alla sorgente luminosa a LED. Posizionare la base magnetica sulla tavola d'aria del banco di elettrofisiologia. Quindi, collegare la sorgente luminosa a un circuito di controllo, quindi collegare il circuito di controllo a una fonte di tensione esterna.

Utilizziamo la tensione di uscita dal sistema di acquisizione dati di elettrofisiologia del laboratorio di potenza realizzato da ad instruments. Una volta collegato alla sorgente di tensione, dare impulsi da uno a cinque volt al circuito di controllo per attivare la luce blu, regolare la base magnetica e la sorgente luminosa fino a quando il raggio di luce blu non è focalizzato sull'area da occupare dalla dissezione larvale. Dopo aver effettuato le opportune regolazioni, siamo pronti per passare alla dissezione larvale.

Per iniziare con la dissezione, posiziona sei spilli da 0,1 millimetri sul pavimento di un piatto foderato di sigaro. Rimuovi un terzo di larve stellate dal terreno alimentare e mettilo in qualsiasi capsula di Petri di plastica. Sciacquare le larve con soluzione salina per rimuovere il cibo attaccato alle larve.

Quindi ha posto le larve nella piastra di dissezione vicino ai perni estratti e ha riempito la piastra a metà con soluzione fisiologica. Ora orienta le larve in modo da poter vedere due tubi argentei che corrono lungo la superficie dorsale dell'animale. Questi tubi argentei sono la trachea.

Inserire un grande perno direttamente nella coda tra i tubi tracheali. Tieni premute le larve e inserisci un secondo grande spillo nella sua testa. Assicurarsi di allungare il corpo nel senso della lunghezza mentre il perno viene inserito.

Usa le forbici per fare una piccola incisione vicino alla coda. Continua l'incisione per tutta la lunghezza del corpo. Assicurati che le punte delle forbici siano sollevate per evitare di tagliare i nervi ventrali e/o i muscoli della parete del corpo.

Posiziona quattro spilli ai quattro angoli degli animali. Ora apri la sezione centrale. Inserire gli spilli nel piatto di dissezione in modo da filettare l'animale.

Appunta anche il preparato in modo che venga insegnato usando pinze e forbici. Rimuovi l'animale, gli organi digestivi, la trachea e i corpi adiposi. Risciacquare la preparazione con soluzione fisiologica.

Dopo il risciacquo, individuare i lobi frontali e il ganglio ventrale della preparazione utilizzando le micro forbici. Tagliare con cura il ganglio ventrale appena dietro i lobi frontali. Una volta completata la dissezione, procedere con la stimolazione con luce blu e la registrazione muscolare.

Per eseguire la registrazione muscolare, tirare un elettrodo di resistenza da 10 a 20 mega ohm. Utilizzando un estrattore elettronico per elettrodi, riempire l'elettrodo estratto con tre molari KCL. Posizionare l'elettrodo pieno nel portaelettrodo.

Ora posiziona la preparazione larvale sotto un microscopio da dissezione sul rig. Regolare la luce blu in modo che la preparazione sezionata sia centrata nel raggio di luce. Identificare il muscolo sei o M sei in qualsiasi segmento della parete corporea della larva utilizzando un micro manipolatore, inserire con cura l'elettrodo in M sei e osservare la rapida iperpolarizzazione muscolare.

I potenziali di membrana a riposo dovrebbero essere compresi tra 30 millivolt negativi e 70 millivolt negativi. Una volta che l'elettrodo è inserito correttamente, fornire impulsi di tensione da 20 a 100 millisecondi al circuito di controllo. Aumentare in modo incrementale la tensione fornita al circuito di controllo.

Prestare attenzione ai potenziali di giunzione ecci nella cellula muscolare. Ecco un risultato rappresentativo che mostra un potenziale di giunzione ecci evocato da brevi impulsi luminosi. L'ampiezza del potenziale di giunzione ecci mostrata qui è l'ampiezza sommata di due motoneuroni che sono entrambi noti per mangiare.

M sei. Intensità più basse o durate più brevi della luce possono esporre il potenziale di giunzione eccitatoria di ampiezza inferiore di un singolo motoneurone. Vi abbiamo appena mostrato come eseguire la strada del canale in assenza di due stimolazioni mediate dei potenziali sinaptici alla giunzione neuromuscolare oph.

Quando si esegue questa procedura, è importante ricordare di non danneggiare la parete corporea del preparato durante la dissezione. È anche importante ricordare che, sebbene una preparazione possa essere sovraeccitata subito dopo una dissezione, si calmerà nel tempo e consentirà buone registrazioni. Quando si impalano i muscoli, fare attenzione a non scendere sotto il primo strato di muscoli nella parete del corpo.

Quando l'elettrodo è incastrato nella parete del corpo. A volte è possibile ottenere potenziali iperpolarizzati ma non essere effettivamente in una cellula muscolare. Quindi questo è tutto.

Grazie per aver guardato e buona fortuna con i tuoi esperimenti.