Fabbricazione di miogenici Costrutti di ingegneria tessutale

Questa procedura inizia con il prelievo di tessuto muscolare scheletrico da ratti Lewis neonati. Da questo tessuto isoliamo cellule mioblastiche. Questi mioblasti vengono coltivati in piatti per colture cellulari per due giorni, quindi raccolti e mescolati in una miscela di costrutto tissutale a base di collagene.

Questa miscela viene accuratamente pipettata in uno stampo immerso nel mezzo di coltura e incubata a 37 gradi Celsius. Ciao, sono Christina Pesach del laboratorio di Douglas Cowan del Dipartimento di Anestesiologia del Children's Hospital di Boston e della Harvard Medical School. Oggi vi mostreremo una procedura per la creazione di tessuto ingegnerizzato miogenico.

Utilizziamo questa procedura per creare un tessuto ingegnerizzato da inserire nel cuore. Il nostro obiettivo è stabilire una connessione elettrica tra le camere superiori e inferiori del cuore, come terapia alternativa all'impianto di pacemaker cardiaco nei bambini affetti da blocco atrioventricolare completo. Cominciamo dunque.

Nel costrutto, il modello di colata viene utilizzato per fornire una forma al costrutto tissutale a base di collagene impiantabile chirurgicamente. In questo video, il processo di creazione di costrutti tissutali ingegnerizzati contenenti mioblasti scheletrici è descritto in un video allegato. Viene dimostrata l'implantazione cardiaca del tessuto cellularizzato realizzato con questo protocollo.

Uno stampo per tessuti può essere realizzato in quasi ogni forma e dimensione per soddisfare i requisiti fisiologici di qualsiasi cuore per cui il tessuto è progettato. In questa dimostrazione, lo stampo formerà un pezzo di tessuto che può essere tagliato per adattarsi alla solco AV di un cuore di ratto adulto. Iniziare la costruzione dello stampo utilizzando una lametta per tagliare il tubo in silicone in pezzi lunghi tre centimetri, quindi tagliare longitudinalmente ciascun pezzo a metà.

Tagliare un piccolo pezzo di rete in poliestere. Successivamente, posizionare una goccia di adesivo in silicone RTV di grado impiantabile all'interno dell'estremità del tubo. Cercare di mantenere al minimo la quantità di adesivo depositata, poiché è in qualche modo tossico per le cellule in coltura.

Posizionare rapidamente un piccolo pezzo di rete in poliestere sulla goccia di adesivo in silicone e allinearlo con l'estremità del tubo. Questo fornirà una superficie leggermente sollevata e piana per l'attacco del costrutto. Ripetere il procedimento per l'altra estremità del tubo.

Lasciare asciugare lo stampo a temperatura ambiente per tre giorni. È utile preparare da 20 a 30 stampi contemporaneamente, poiché sono essenzialmente monouso. Una volta che l'adesivo è completamente asciutto, per favorire la sterilizzazione degli stampi, conservarli in un contenitore riempito con etanolo al 70% fino al momento del loro utilizzo, dopo averli preparati.

Successivamente, verificare se tutte le soluzioni necessarie sono pronte all'uso per la preparazione all'isolamento cellulare. Preparare una soluzione diluita di laminina costituita da un milligrammo di laminina in 250 millilitri di PBS sterilizzato al 0,2 micron, contenente antibiotici e un fungicida.

Successivamente, rivestire piastre per coltura tissutale da 150 millimetri con quattro millilitri della soluzione di laminina diluita e incubarle a 37 gradi Celsius per almeno quattro ore prima dell'uso. Devono essere preparate anche altre due soluzioni: il mezzo per mioblasti e la soluzione di digestione del muscolo scheletrico.

Fare riferimento alla parte testuale del protocollo per le loro formulazioni. Filtrare. Sterilizzare il buffer di digestione utilizzando un disco filtro da 0,2 micron applicato su una siringa da 10 millilitri. Aliquote del buffer di digestione possono essere conservate a meno 20 gradi Celsius.

Si stima che saranno necessari cinque millilitri di buffer di digestione per ogni nidiata di ratti Lewis. Incubare la quantità richiesta di buffer di digestione dei tessuti e 10 millilitri di mezzo per mioblasti a 37 gradi Celsius. Procedere quindi con la dissezione dei rattoletti.

Per prima cosa, ottenere almeno una nidiata di ratti Lewis neonati sacrificati utilizzando pinze e piccole forbici. Rimuovere i muscoli paraspinali dai ratti Lewis neonati deceduti praticando un'incisione lungo la schiena seguendo il midollo spinale, staccando gli strati di pelle e fascia e quindi escindendo i muscoli. Porre i muscoli escissi in un tubo conico da 50 millilitri contenente 40 millilitri di H-B-S-S 1X su ghiaccio.

Lasciare che le strisce muscolari si depositino sul fondo del tubo e rimuovere con attenzione la maggior parte del liquido e dei residui ematici mediante aspirazione a vuoto con una pipetta Pasteur sterile in un ambiente asettico. Successivamente, versare i pezzi di muscolo raccolti in una piastra di coltura da 150 millimetri ed aspirare via la maggior quantità possibile del liquido residuo. Utilizzando due lame di rasoio monolame, tritare il tessuto fino a ottenere una pasta densa.

La pasta muscolare verrà digerita in una soluzione di digestione preriscaldata. Versare una parte della soluzione di digestione sulla pasta muscolare e trasferire la miscela di soluzione e pasta muscolare in una nuova provetta da 50 millilitri. Utilizzando una pipetta da 10 millilitri, generalmente per una digestione efficiente dei muscoli provenienti da tre litri di Ratti Lewis, si utilizzano da 10 a 15 millilitri di soluzione.

Posizionare il tubo su una piattaforma oscillante e digerire a 37 gradi Celsius per circa 30 minuti. Durante la digestione enzimatica, il tessuto viene occasionalmente agitato tre volte senza formare bolle. Utilizzare una pipetta da 10 millilitri montata su un pipettatore senza fili.

Una volta che il muscolo è stato liquefatto, far passare la soluzione attraverso un filtro cellulare da 70 micron. Quindi centrifugare le cellule filtrate a temperatura ambiente per 10 minuti a 600 G; utilizzando una pipetta Pasteur e un'aspirazione, rimuovere quanta più parte liquida possibile e risospendere il pellet con 10 millilitri di mezzo per mioblasti caldo. Seminare le cellule su una piastra per colture tessutali non rivestita da 150 millimetri per 15 minuti, al fine di rimuovere eventuali fibroblasti, poiché questi si attaccano più rapidamente dei mioblasti.

Posizionare la piastra in un incubatore umidificato impostato a 37 gradi Celsius con il 5% di anidride carbonica. Rimuovere la piastra dall'incubatore e trasferire le cellule che non si sono ancora attaccate alla coltura rivestita con laminina. Collezionarle e diluirle nel mezzo per mioblasti in modo da ottenere una piastra per ogni uno o due cuccioli di ratto.

Se le cellule vengono seminate troppo densamente, si differenzieranno in tubuli miotubulari. Infine, lasciare crescere le cellule in un ambiente umidificato a 37 gradi Celsius con il 5% di anidride carbonica. Dopo uno o due giorni di incubazione, le cellule saranno pronte per essere inglobate in costrutti tessutali.

Dopo uno o due giorni di incubazione, rimuovere quattro delle piastre da coltura tissutale per mioblasti da 150 millimetri dall'incubatore. Non attendere più di 48 ore, altrimenti i fibroblasti sopraffaranno la popolazione di mioblasti. Aspirare il mezzo dalle cellule.

Quindi risciacquare le cellule due volte con un XPBS riscaldato a 37 gradi Celsius per staccare i mioblasti dalla piastra e aggiungere quattro millilitri di soluzione di tripsina-EDTA 0,05% riscaldata a ciascuna piastra, quindi reinserire le piastre nell'incubatore per cinque minuti. Raccogliere i mioblasti nell'area di lavoro sterile e recuperare il liquido in un tubo da 50 millilitri. Utilizzare 10 millilitri di mezzo per mioblasti per risciacquare tutte le piastre e unire il liquido con le cellule nel tubo da centrifuga.

Centrifugare le cellule a temperatura ambiente per 10 minuti a 600 G ed aspirare la maggior quantità possibile del liquido in eccesso. Ri-sospendere ora i mioblasti in 1,4 millilitri di mezzo per mioblasti e porli sul ghiaccio. Utilizzando pinzette con cura, rimuovere un stampo per costrutto dal bagno di etanolo e risciacquarlo due volte immergendolo in una soluzione di PBS 1X; aspirare tutte le tracce di PBS con una pipetta Pasteur prima di posizionare lo stampo in una pozzetta vuota di una piastra per colture cellulari a sei pozzette.

In questo momento, è necessario formulare una soluzione. Raccogliere i seguenti reagenti su ghiaccio. 10 x hams F 10 funghi zona penicillina streptomicina.

Cellule di collagene di tipo I sospese in mezzo per mioblasti, bicarbonato di sodio e gel. Combinare i reagenti secondo il protocollo scritto. Vortexare la miscela per 20 secondi; diventerà rosa.

Si noti che le diverse varietà di collagene di tipo I disponibili in commercio hanno un effetto variabile sulla miscela, sulla solidificazione e sulla consistenza. Nel prodotto finale, rimettere il tubo nel secchiello con ghiaccio per alcuni minuti per eliminare le bolle dalla soluzione.

Il collagene di tipo I non deve essere irradiato, altrimenti non formerà gelatina. Qui utilizziamo un prodotto derivato dalla pelle di ovide. Prima che la miscela si solidifichi, versare con attenzione la miscela nello stampo presente nella piastra di coltura.

Ogni stampo conterrà circa un millilitro del liquido viscoso. Cerchi di evitare di introdurre bolle d'aria durante questa procedura. Trasferisca con attenzione la piastra contenente gli stampi per costrutti nell'incubatore a 37 gradi Celsius.

Mentre la miscela si solidifica, il colore passerà dal rosa scuro al rosa chiaro, mentre la muffa si solidifica riscalda un po' di mezzo per mioblasti a 37 gradi Celsius. Dopo circa mezz'ora di incubazione, immergi con attenzione ciascun costrutto tessutale nel mezzo per mioblasti riscaldato e riponi la piastra nell'incubatore. Quando questo protocollo viene eseguito correttamente, il costrutto tessutale contenente mioblasti è pronto per l'impianto in vivo o per ulteriori analisi.

Dopo due giorni di incubazione, vi abbiamo appena mostrato come fabbricare un costrutto ingegnerizzato di tessuto miogenico. Quando si esegue questa procedura, è importante ricordare di mantenere tutti i reagenti necessari per la soluzione del costrutto sul ghiaccio per prevenire una solidificazione prematura. Ecco fatto.

Grazie per aver guardato e buona fortuna con i vostri esperimenti.