Name: Mappatura ottica di Langendorff-perfusi Hearts Rat (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2009-08-11T19:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 48 s
Description: Impara la mappatura ottica ad alta risoluzione per studiare l'attività elettrica cardiaca su cuori di ratto perfusi con Langendorff usando il colorante di-8-ANEPPS. Questa tecnica non invasiva permette di analizzare la propagazione del potenziale d'azione in tempo reale.

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Questo lavoro è sostenuto da borse di ricerca dal National Institutes of Health (HL068915; HL088206) e contributi al Fondo di conduzione cardiaca presso il Children Hospital di Boston.

Parte 1: Preparare le soluzioni e il sistema isolato cuore perfuso <ol><li> La mattina del dell'esperimento, 4,0 L di Krebs-Henseleit soluzione viene preparata come descritto in precedenza [5, 6]. </li><li> 11 mmol / L 2,3-butanedione monoxime (BDM) è sciolto in 1,0 L di Krebs-Henseleit soluzione decantata dal perfusato preparato al punto 1.1. </li><li> Altri 150 ml di Krebs-Henseleit viene rimosso dal perfusato preparato al passo 1.1 e mescolato con 5 mol / l di-8-ANEPPS (diluito da un mMol / L 10 magazzino sciolto in dimetilsolfossido (DMSO)). </li><li> Queste tre soluzioni sono trasferiti ad acqua con camicia in vetro serbatoi (Radnóti) dove sono pre-riscaldato a 41,0 ° C e ossigenata con un gorgogliatore sommerso (Radnóti) con 0,2 micron filtrata 95% O 2, 5% CO 2. Le soluzioni da 3 serbatoi magazzino vengono pompati al muro con sistema Langendorff Masterflex ™ L / S pompe peristaltiche ea basso assorbimento tubo al silicone (Cole-Parmer). </li><li> Prima del montaggio, il sistema Langendorff vetro (Radnóti) è meticolosamente lavata con E-Toxa-CLEAN reagente (Sigma-Aldrich) e risciacquata a fondo con 0,1 M / L HCl, 100% di etanolo e acqua distillata. </li><li> Il mancato ricircolo Langendorff apparato è stato costruito per fornire 70 mm Hg a pressione costante da 3 serbatoi separati ossigenati, che sono separati dal cuore con l'acqua con camicia serpentine di riscaldamento e trappole bolla (Radnóti) [7]. Le 3 linee di perfusione indipendente convergono sopra il cuore a due rubinetti a 3 vie, che ci permette di controllare con precisione la consegna delle soluzioni preparate in passi 1,1-1,3. Acqua con camicia vetro è collegato in serie con tubi BPT Masterflex PharMed (Cole-Parmer) e riscaldato a 39 ° C con acqua distillata usando due circolatori E100 (Lauda). Perdita di calore attraverso il platino tubo al silicone vulcanizzato (Cole-Parmer) che collega la pressione di testa serbatoi per le bobine di riscaldamento e trappole bolla portato ad una temperatura di 37 ° C perfusato raggiungere il cuore. </li></ol> Parte 2: Raccolta del cuore di ratto e set-up perfusione Langendorff <ol><li> Per indurre profonda anestesia generale in 200-250 g ratti Lewis, 100 mg / kg di ketamina e 10 mg / kg xylazina viene iniettato nella cavità intraperitoneale. A questa miscela, si aggiungono 500 U / kg di eparina per prevenire la coagulazione del sangue e l'ischemia miocardica durante la procedura di espianto. </li><li> Per un facile accesso al cuore e dei grossi vasi, la parete toracica anteriore è stato rimosso. Dopo di che, il tessuto circostante è attentamente sezionato e aperto il sacco pericardico. </li><li> A seguito di identificazione della vena cava inferiore, il vaso è legatura con 5-0 seta (Ethicon) e l'intero blocco cuore-polmone è espiantati. Tessuti è immediatamente posto in ghiacciata Krebs-Henseleit soluzione contenuta in un bicchiere da 50 ml su ghiaccio. </li><li> L'aorta ascendente è rapidamente individuato e sezionato dal tessuto circostante. Una di dimensioni idonee cannula (Harvard Apparatus) è inserita nell'aorta, avendo cura di evitare di interrompere la perfusione obbligatorio delle arterie coronarie mediante l'inserimento della cannula troppo nella radice aortica. La cannula viene fissato l'aorta ascendente con 5-0 seta (Ethicon). </li><li> Il cuore di ratto è poi situato su di esso Langendorff senza introdurre bolle d'aria nella cannula. Retrograda perfusione vascolare coronarica è ormai consolidata con il caldo, ossigenata di Krebs-Henseleit soluzione dalla pressione a testa descritto al punto 1.6. </li><li> Tessuto extra, tra cui i polmoni, è ora rimosso e il cuore è perfuso per 20 minuti per permettere il recupero della funzione e stabilizzare il ritmo. Durante questo periodo, una sonda molto sottile di temperatura termocoppia (Cole-Parmer) è introdotto nella cavità ventricolare sinistra e suturato in posizione con 5-0 Prolene sutura (Ethicon). La sonda è collegata ad un termo-regolatore (di Digi-Sense) per garantire la temperatura del cuore è mantenuta a 37 ° C regolando le impostazioni di pompe di circolazione dell'acqua. Moto da perfusato stillicidio dalla apice cardiaco è ridotto al minimo mettendo un pezzo di garza nel recipiente effluenti. </li></ol> Parte 3: il cuore di carico con colorante potenziometrica e acquisire segnali elettrografiche e ottici <ol><li> Di-8-ANEPPS (Invitrogen) viene caricato nel cuore passando alla linea di perfusione contenente il Krebs-Henseleit miscelato con il colorante fluorescente con un rubinetto. Inoltre, una cannula 18G è collocato nell'atrio sinistro e / o diritto e ulteriori 50 ml di soluzione colorante sta lentamente somministrato in ognuna di queste camere perché non sono sufficientemente perfusi con colorante introdotto attraverso le arterie coronariche. </li><li> Durante la procedura di caricamento, 3 derivazioni ECG (Harvard Apparatus) sono gentilmente messo sulla superficie del cuore che non sta affrontando l'ottica utilizzata per la mappatura. Elettrodo N o 1 è posizionato sulla parte posteriore apicale del ventricolo sinistro, N ° 2 sul atrio sinistro, e N <su> p&gt; o 3 come un elettrodo di riferimento sulla radice aortica (Figura 1). I segnali atriali e ventricolari elettrografiche sono poi amplificati, digitalizzati, e visualizzata accanto segnali ottici utilizzando il software (redshirt Imaging) (Figura 2). Un oscilloscopio (Tektronix TDS modello 1002) è utilizzato anche per visualizzare la superficie ECG s in tempo reale e per garantire la stimolazione adeguata. </su></li><li> ECG amplificatore (Hugo Sachs Elektronik) impostazioni: filtro passa-alto: 0,1 Hz Filtro passa basso: 150 Hz </li><li> La fotocamera CMOS (redshirt Imaging) e macroscopio stata posizionata mediante gli aggiustamenti XYZ modo che la superficie del cuore è a fuoco e centrata nella cornice di acquisizione. La fotocamera e le ottiche sono montate su un tavolo isolamento dalle vibrazioni (Minus K Technology) per ridurre al minimo le frequenze di risonanza. Allo stesso tempo, un elettrodo di stimolazione coassiale (Harvard Apparatus), controllato con un isolato, S48 elettrico-stimolazione unità (Grass), è posto sulla atrio destro e il cuore viene stimolato a 300 battiti al minuto (Figura 1). </li><li> Stimolazione elettrica (Erba) impostazioni: Vota: 5 impulsi al secondo Ritardo: 0,2 ms Durata: 2 ms Volt: 6-12 V Modalità: Ripetizione Pulse: Singolo </li><li> Per le registrazioni ottiche che mancano di artefatti da movimento di contrazione, il cuore ha bisogno di essere elettromeccanicamente disaccoppiato. Facciamo questo nuovo passaggio linee di perfusione a Krebs-Henseleit soluzione che contiene 11 mmol / L BDM. Tra acquisizioni, il cuore è perfuso con puro Krebs-Henseleit per aiutare a preservare la vitalità del preparato. </li><li> I parametri di registrazione sono impostati utilizzando il software (Imaging redshirt) con le impostazioni di acquisizione seguenti: Configurazione: 2.000 Hz; 128x128 gamma di pixel Intervallo di telaio: 0,5 ms Fotocamera Guadagno Amplificatore: 5x On-Chip Guadagno: 8x-12Me-bene Shutter: 500 ms di ritardo Numero di fotogrammi: 4000 Durata: 2000 ms </li><li> Tutte le luci della stanza e le attrezzature sono disattivati ​​o schermati per eliminare rumori di fondo durante la registrazione. La luce a LED illumina il cuore solo durante la registrazione ottica per ridurre fotometabolismo e tossicità colorante. L'otturatore sorgente luminosa è controllata con un impulso di 5 V fornita attraverso il pannello di controllo per mezzo di un D-to-A bordo del computer (Imaging redshirt). </li></ol> Parte 4: Analisi delle informazioni di acquisizione utilizzando Imaging Software redshirt <ol><li> A seguito dell'acquisizione, i dati vengono elaborati utilizzando diverse impostazioni del filtro. Noi di solito utilizzare le impostazioni predefinite, tranne quando si regola la Banda Stop / filtro passa, che è impostato con il confine a sinistra al 44,0 e il bordo destro a 98,0. In seguito le informazioni registrate vengono elaborate e un film è generato (Imaging redshirt). </li><li> I dati di uno di acquisizione corrisponde alla attivazione elettriche locali a 16.384 siti sulla superficie del cuore per un periodo di 2 secondi. Il software permette a questi segnali locali per essere direttamente confrontati tra loro e con le registrazioni atriali e ventricolari elettrografiche. I dati vengono quindi visualizzati con la mappatura locali attivazione elettrica per colorare e rendere queste informazioni come un'animazione che mostra l'attivazione spazio-temporale elettrico sulla superficie cardiaca. Per creare un'animazione tale, si usa il software: <ul><li> temporalmente e / o spazialmente filtrare i dati </li><li> selezionare un orario di inizio e di fine per l'animazione </li><li> segnali ottici mappa di colori in base a riposo l'intensità luminosa di ogni pixel </li><li> sovrapporre i dati di colore risultante con una foto del cuore </li><li> generare l'animazione </li></ul></li></ol> Parte 5: risultati Rappresentante Se la preparazione cuore perfuso era immobile durante la registrazione, i segnali ottici mostrano un picco distinto per ogni pixel coinvolti in un cambiamento della intensità di emissione di di-8-ANEPPS. I film corrispondente (figure 3 e 4) dimostrare un fronte d'onda di eccitazione di propagazione attraverso la superficie epicardica del cuore così come le registrazioni acquisite simultaneamente elettrografiche (Figura 2). <img src="/files/ftp_upload/1138/Figure3.jpg" alt="Diagramma di configurazione del cuore di Langendorff per lo studio della stimolazione cardiaca, evidenziando i componenti numerati." data-altupdatedat="1754907201000" data-alt="Figura 1"> Figura 1. Una fotografia di un Langendorff-perfuso preparazione cuore raffiguranti le posizioni degli elettrodi sulla stimolazione atrio destro e il derivazioni come descritto al punto 3.2. <img src="/files/ftp_upload/1138/Figure4thumb.jpg" alt="Diagramma di processo biologico con segnali; Analisi dei dati dei risultati della microscopia a fluorescenza." border="0" data-altupdatedat="1754907201000" data-alt="Figura 2"> Figura 2. Rappresentante segnali ottici e registrazioni elettrografiche da un cuore perfuso di ratto Lewis. Un pannello mostra un'immagine della superficie epicardico utilizzato per l'imaging ottico. La posizione dei pixel selezionati per dimostrare i cambiamenti nella emissione di fluorescenza nel tempo, nel Pannello di B sono indicati da frecce colorate. Segnali elettrografici sono mostrati in Pannello di C con la linea rossa che indica l'attivazione atriale e la linea di luce blu che corrisponde al segnale ventricolare. Per favoreve.com/files/ftp_upload/1138/Figure4.jpg "&gt; clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.

<ol><li>Efimov, I. R., Nikolski, V. P., Salama, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optical+imaging+of+the+heart%5BTitle%5D)+AND+%22Circ+Res%22%5BJournal%5D)">Optical imaging of the heart.</a> Circ Res. 95 (1), 21-33 (2004).</li>
<li>Hucker, W. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Images+in+cardiovascular+medicine.+Optical+mapping+of+the+human+atrioventricular+junction%5BTitle%5D)+AND+%22Circulation%22%5BJournal%5D)">Images in cardiovascular medicine. Optical mapping of the human atrioventricular junction.</a> Circulation. 117 (11), 1474-147 (2008).</li>
<li>Entcheva, E., Bien, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Macroscopic+optical+mapping+of+excitation+in+cardiac+cell+networks+with+ultra-high+spatiotemporal+resolution%5BTitle%5D)+AND+%22Prog+Biophys+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Macroscopic optical mapping of excitation in cardiac cell networks with ultra-high spatiotemporal resolution.</a> Prog Biophys Mol Biol. 92 (2), 232-257 (2006).</li>
<li>Entcheva, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fluorescence+imaging+of+electrical+activity+in+cardiac+cells+using+an+all-solid-state+system%5BTitle%5D)+AND+%22IEEE+Trans+Biomed+Eng%22%5BJournal%5D)">Fluorescence imaging of electrical activity in cardiac cells using an all-solid-state system.</a> IEEE Trans Biomed Eng. 51 (2), 333-341 (2004).</li>
<li>Stamm, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rapid+endotoxin-induced+alterations+in+myocardial+calcium+handling%3A+obligatory+role+of+cardiac+TNF-alpha%5BTitle%5D)+AND+%22Anesthesiology%22%5BJournal%5D)">Rapid endotoxin-induced alterations in myocardial calcium handling: obligatory role of cardiac TNF-alpha.</a> Anesthesiology. 95 (6), 1396-1405 (2001).</li>
<li>Choi, Y. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cardiac+conduction+through+engineered+tissue%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Pathol%22%5BJournal%5D)">Cardiac conduction through engineered tissue.</a> Am J Pathol. 169 (1), 72-85 (2006).</li>
<li>Skrzypiec-Spring, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolated+heart+perfusion+according+to+Langendorff---still+viable+in+the+new+millennium%5BTitle%5D)+AND+%22J+Pharmacol+Toxicol+Methods%22%5BJournal%5D)">Isolated heart perfusion according to Langendorff---still viable in the new millennium.</a> J Pharmacol Toxicol Methods. 55 (2), 113-126 (2007).</li>
<li>Fedorov, V. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Application+of+blebbistatin+as+an+excitation-contraction+uncoupler+for+electrophysiologic+study+of+rat+and+rabbit+hearts%5BTitle%5D)+AND+%22Heart+Rhythm%22%5BJournal%5D)">Application of blebbistatin as an excitation-contraction uncoupler for electrophysiologic study of rat and rabbit hearts.</a> Heart Rhythm. 4 (5), 619-626 (2007).</li>
</ol>

Gli esperimenti sugli animali sono stati eseguiti secondo le linee guida e regolamenti stabiliti dalla cura degli animali e del Comitato Istituzionale uso in bambini Hospital di Boston.

L&#39;asportazione del cuore di ratti anestetizzati deve essere eseguita rapidamente per evitare di ischemia miocardica. Se la perfusione ischemia coronarica o insufficiente si verifica, il cuore probabilmente sviluppare aritmie e può diventare infartuata. Inoltre, questi cuori si dimostrano insufficienti emissione di fluorescenza per le registrazioni informative e le analisi successive. Prima di caricare il colorante, le cellule del miocardio devono essere adeguatamente perfusi con soluzione Krebs-Henseleit di stabilir...

<table><tbody><tr><td>CardioCMOS-SM128f</td><td>Attrezzatura</td><td>RedShirtImaging, LLC</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Software CardioPlex</td><td>Attrezzatura</td><td>RedShirtImaging, LLC</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Sorgente luminosa LED LUXEON 460-490 nm</td><td>Attrezzatura</td><td>Lumileds Lighting, US, LLC, San Jose, CA 95131 USA</td><td>LXHL-PB02</td><td></td></tr><tr><td>Amplificatore ECG Tipo 689 Hugo Sachs Elektronik</td><td>Attrezzatura</td><td>Harvard Apparatus</td><td>730149</td><td></td></tr><tr><td>Specchio Dicroico 505 nm</td><td>Attrezzatura</td><td>Semrock</td><td>FF505-SDi01-25x36</td><td></td></tr><tr><td>Filtro di Emissione Passa-Alto a 605 nm</td><td>Attrezzatura</td><td>SciMedia</td><td></td><td></td></tr><tr><td>THT Sideways</td><td>Attrezzatura</td><td>SciMedia</td><td>25 BM-8</td><td></td></tr><tr><td>Porta Giunto Sferico Mini</td><td>Attrezzatura</td><td>Harvard Apparatus</td><td>BS4 73-0177</td><td></td></tr><tr><td>Set di Elettrodi di Stimolazione Piccoli</td><td>Attrezzatura</td><td>Harvard Apparatus</td><td>BS4 73-0160</td><td></td></tr><tr><td>Piattaforma BM-6 per Isolamento dalle Vibrazioni da Banco</td><td>Attrezzatura</td><td>Technology Inc., Inglewood, CA 90301</td><td>25 BM-6</td><td></td></tr><tr><td>Elettrodo Monopolare per ECG</td><td>Attrezzatura</td><td>Harvard Apparatus</td><td>BS4 73-0200</td><td></td></tr><tr><td>Pompa a Rulli SCI 400</td><td>Attrezzatura</td><td>Watson-Marlow Pumps Group</td><td>401U/D1</td><td></td></tr><tr><td>Pompa a Rulli MasterFlex Easy Load II</td><td>Attrezzatura</td><td>Cole-Parmer</td><td>Modello 77201-60</td><td></td></tr><tr><td>Tubazione Marprene #14</td><td>Attrezzatura</td><td>Watson-Marlow Pumps Group</td><td>902.0016.016</td><td></td></tr><tr><td>Tubazione MasterFlex</td><td>Attrezzatura</td><td>PharMed, Westlake, OH 44145 USA</td><td>06485-25</td><td></td></tr><tr><td>Stimolatore ad Impulsi Quadrati S48</td><td>Attrezzatura</td><td>Grass Technologies</td><td>Modello S48</td><td></td></tr><tr><td>Unità di Isolamento con Trasformatore RF SIU5</td><td>Attrezzatura</td><td>Grass Technologies</td><td>Modello SIU5</td><td></td></tr><tr><td>Reservoir da 5 Litri con Giacca d'Acqua</td><td>Attrezzatura</td><td>Radnoti Glass Technology Inc.</td><td>120142-5</td><td></td></tr><tr><td>Reservoir da 2 Litri con Giacca d'Acqua</td><td>Attrezzatura</td><td>Radnoti Glass Technology Inc.</td><td>120142-2</td><td></td></tr><tr><td>Reservoir da 0,5 Litri con Giacca d'Acqua</td><td>Attrezzatura</td><td>Radnoti Glass Technology Inc.</td><td>120142-0</td><td></td></tr><tr><td>Reservoir da 0,25 Litri con Giacca d'Acqua</td><td>Attrezzatura</td><td>Radnoti Glass Technology Inc.</td><td>120142-025</td><td></td></tr><tr><td>Bobina Riscaldante da 10 ml</td><td>Attrezzatura</td><td>Radnoti Glass Technology Inc.</td><td>158822</td><td></td></tr><tr><td>Trappola per Bolle di Compatibilità</td><td>Attrezzatura</td><td>Radnoti Glass Technology Inc.</td><td>130149</td><td></td></tr><tr><td>Cannula con Sconnessione Luer</td><td>Attrezzatura</td><td>Harvard Apparatus</td><td>72-1444</td><td></td></tr><tr><td>Rubinetto a Tre Vie, FLL a MLT, Senza Coperchi per Porta</td><td>Attrezzatura</td><td>Harvard Apparatus</td><td>BS4 72-2630</td><td></td></tr><tr><td>Termometro a Termocoppia</td><td>Attrezzatura</td><td>Cole-Parmer</td><td>WU-91100-40</td><td></td></tr><tr><td>Microsonda Flessibile Ultrafine Serie IT</td><td>Attrezzatura</td><td>PhysiTemp Instruments Inc., Clifton, NJ 07013 USA</td><td>IT-24P</td><td></td></tr><tr><td>Oscilloscopio Tektronix TDS 1002</td><td>Attrezzatura</td><td>Tektronix, Inc.</td><td>TDS 1002B</td><td></td></tr><tr><td>Monossima di 2,3-butanedione</td><td>Reagente</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>B0753</td><td></td></tr><tr><td>Cloridrato di Ketamina</td><td>Reagente</td><td>Hospira Inc.</td><td>RL-0065</td><td></td></tr><tr><td>Xilazina</td><td>Reagente</td><td>Lloyd, Inc.</td><td>LB15705A</td><td></td></tr><tr><td>E-TOXA-CLEAN&amp;#174;</td><td>Reagente</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>E9029</td><td></td></tr><tr><td>Di-8-ANEPPS</td><td>Reagente</td><td>Invitrogen</td><td>D-3167</td><td></td></tr></tbody></table>

mappatura ottica di langendorff-perfusi hearts rat

Optical Mapping of Langendorff-perfused Rat Hearts

Mappatura ottica della superficie cardiaca con coloranti fluorescenti voltaggio-sensibile è diventato un importante strumento per indagare l&#39;eccitazione elettrica in modelli sperimentali che vanno in scala da colture di cellule di interi organi<sup&gt; [1, 2]</sup&gt;. Utilizzando state-of-the-art sistemi di imaging ottico, generazione e propagazione dei potenziali d&#39;azione durante il normale ritmo cardiaco o per tutto l&#39;inizio e la manutenzione di aritmie possono essere visualizzati quasi istantaneamente<sup&gt; [1]</sup&gt;. L&#39;ultima disponibile in commercio di sistemi in grado di fornire informazioni spazio-temporali a risoluzioni estremamente elevate e si basano su custom-built attrezzature inizialmente sviluppato per superare gli ostacoli imposti dalla elettrofisiologici metodi più convenzionali<sup&gt; [1]</sup&gt;. I progressi in alta risoluzione e ad alta velocità Complementary Metal-Oxide-Semiconductor (CMOS), macchine fotografiche e intensamente brillante, diodi emettitori di luce (LED), così come tensione-sensibili coloranti, ottica, ed i filtri hanno cominciato a fare l&#39;aquisizione del segnale elettrico pratiche per i biologi cellulari cardiovascolari che sono più abituati a lavorare con microscopi. Anche se l&#39;ultima generazione di telecamere CMOS in grado di acquisire 10.000 frame al secondo su di un array 16.384 pixel, a seconda del tipo di preparazione del campione, ormai consolidata tecnologie di acquisizione di fluorescenza come array fotodiodo, sistemi di scansione laser, e raffreddato charged-coupled device (CCD telecamere) hanno ancora alcuni distinti vantaggi rispetto alla gamma dinamica e rapporto segnale-rumore e efficienza quantica<sup&gt; [1, 3]</sup&gt;. Nel presente studio, i cuori di ratto Lewis sono stati perfusi<em&gt; Ex vivo</em&gt; Con un perfusato cristalloidi (Krebs-Henseleit soluzione) a 37 ° C in un apparecchio Langendorff modificato. Dopo un periodo di stabilizzazione di 20 minuti, i cuori erano intermittente perfusi con 11 mmol / L 2,3-butanedione monoxime per eliminare le contrazioni associate movimento durante l&#39;acquisizione dell&#39;immagine. Per la mappatura ottica, abbiamo caricato i cuori con la risposta rapida sonda potenziometrica di-8-ANEPPS<sup&gt; [4]</sup&gt; (5 mmol / L) e brevemente illuminato la preparazione con 475 ± 15 nm luce di eccitazione. Durante un tipico 2 secondo periodo di illuminazione,&gt; 605 nm luce emessa dalla preparazione cardiaco è stato ripreso con una telecamera ad alta velocità CMOS collegata ad un macroscopio orizzontale. Per questa dimostrazione, i cuori sono stati ritmo di 300 battiti al minuto con un elettrodo coassiale collegato ad un&#39;unità isolata stimolazione elettrica. Registrazioni simultanee bipolare elettrografiche sono stati acquisiti e analizzati insieme con i segnali di tensione utilizzando un software facilmente reperibili. In questo modo, i potenziali d&#39;azione sulla superficie del Langendorff-cuori di ratto perfusi possono essere visualizzati e registrati con segnali elettrografiche.

Questo articolo descrive una tecnica ad alta risoluzione temporale e spaziale a otticamente movimento immagine del potenziale d&#39;azione sulla superficie del Langendorff-cuore perfuso di ratto utilizzando un colorante potenziometrica (di-8-ANEPPS).

Mappatura ottica di Langendorff-perfusi Hearts Rat

La mappatura ottica della superficie cardiaca mediante l'uso di coloranti fluorescenti sensibili alla tensione è diventata uno strumento importante per indagare l'eccitazione elettrica in ...

Ciao, sono Yon Ziv del laboratorio del Dott. Cohen del Dipartimento di Anestesiologia del Children's Hospital e della Howard Medical School. Oggi mostreremo una procedura di mappatura ottica su cuori rossi perfusi con soluzione di Langendorff. Utilizziamo questa procedura nel nostro laboratorio per studiare la propagazione dell'attività elettrica sulla superficie cardiaca.Iniziamo. Al mattino dell'esperimento, preparare quattro litri di soluzione di Krebs Hensel. Dopo aver preparato la soluzione, rimuovere le particelle non disciolte mediante filtrazione sotto vuoto con un filtro da 200 micron.Per prima cosa, utilizzare un litro della soluzione di Krebs Henzel lite preparata per sciogliere 11 millimoli di BDM. In secondo luogo, prelevare altri 100 millilitri di Krebs Henzel lite e aggiungere 10 millimolare di D otto NFS in DMSO per ottenere una concentrazione finale di cinque micromolare di D otto annex nella soluzione. I serbatoi in vetro con giacca d'acqua, il bollitore e il materiale vetrario utilizzati qui provengono tutti da red.Naughty.Trasferire le due soluzioni nei serbatoi preriscaldati a 41 gradi Celsius. Ossigenare le soluzioni con gas filtrato a 0,2 micron utilizzando una pompa a bolle sommersa; far passare le soluzioni dai tre serbatoi di riserva attraverso il sistema montato a parete Ling Endorf mediante pompe peristaltiche e tubi di silicone a bassa assorbività per il prelievo del cuore di ratto. Iniettare prima intraperitonealmente in un ratto Lewis di 200-250 grammi ketamina e xilazina per indurre un’anestesia generale profonda e eparina per prevenire la coagulazione del sangue e l’ischemia miocardica durante l’espianto.Una volta che il ratto è completamente anestetizzato e non risponde a una pressione sulle dita dei piedi, procedere con l'asportazione del cuore. Iniziare l'intervento chirurgico rimuovendo prima la parete toracica anteriore per accedere facilmente al cuore e ai grossi vasi. Successivamente, dissezionare con cura i tessuti circostanti e aprire la sacca pericardica.Dopo aver identificato la vena cava inferiore, legare questo vaso con cinque suture in Proline 0 e espiantare l'intero blocco cuore-polmone. Immergere immediatamente il tessuto in soluzione fredda di Krebs-Henzel in un becher da 50 millilitri posto sul ghiaccio, identificare rapidamente l'aorta ascendente e dissezionarla dal tessuto circostante. Inserire una cannula di dimensioni adeguate nell'aorta.Avendo cura di non inserire troppo in profondità la cannula nella radice aortica e di non interrompere la perfusione obbligatoria delle arterie coronarie. Fissare la cannula all'aorta ascendente. Quindi posizionare il cuore di ratto sull'apparato Ling Endorf senza introdurre bolle d'aria nella cannula.La perfusione vascolare coronarica retrograda è ora stabilita con la soluzione di Krebs Hensel lite calda e ossigenata. Dal contenitore di pressione dell'apparato Ling Endorf, rimuovere ora i tessuti aggiuntivi, inclusi i polmoni, dopo aver pulito e perfondere il cuore per 20 minuti per consentire il recupero della funzione e stabilizzare il ritmo mentre il cuore è in perfusione. Introdurre una sonda termocoppia molto sottile nella cavità del ventricolo sinistro.Fissare la sonda in posizione con cinque punti di sutura in prolene e regolare le impostazioni delle pompe del circuito d'acqua per mantenere la temperatura del cuore a 37 gradi Celsius. Minimizzare i movimenti causati dal perfusato che gocciola dall'apice cardiaco. Posizionando un pezzo di garza nel recipiente per l'effluente, il cuore è ora pronto per essere caricato con il colorante potenzio-metrico al fine di acquisire segnali elettrografici e ottici, introducendo il colorante potenzio-metrico dye eight NEPs nel cuore.Passare alla linea di perfusione contenente Krebs, quindi luce mescolata con colorante fluorescente. Poiché gli atri non vengono sufficientemente perfusi con il colorante introdotto attraverso le arterie coronarie, viene posizionata una cannula di calibro 18 nell'atrio sinistro e/o destro. E ulteriori 50 millilitri di soluzione di colorante vengono somministrati lentamente in ciascuna di queste camere.Durante la procedura di posizionamento, posizionare delicatamente tre derivazioni ECG sulla superficie del cuore, ovvero su quella non rivolta verso l'ottica utilizzata per la mappatura. Il primo elettrodo viene posizionato sulla porzione apicale posteriore del ventricolo sinistro.Il secondo è posizionato sull'atrio sinistro e il terzo funge da elettrodo di riferimento sulla radice aortica. I segnali elettrogrammici atriali e ventricolari vengono successivamente amplificati, digitalizzati e visualizzati come segnali ottici mediante il software. Viene inoltre utilizzato un oscilloscopio per visualizzare in tempo reale gli ECG di superficie e per garantire un adeguato pacing.Impostare l'amplificatore dell'ECG a 0,1 hertz per il filtro passa-alto e a 150 hertz per il filtro passa-basso. Posizionare la telecamera CMOs utilizzando le regolazioni X, Y, Z. Un pezzo di vetro posizionato nel piano focale della telecamera viene appoggiato sulla superficie del cuore in modo che l'area di interesse sia a fuoco e centrata nel campo di acquisizione. La telecamera e l'ottica sono montate su un tavolo di isolamento dalle vibrazioni per minimizzare le frequenze risonanti.Nello stesso momento, posizionare sull'atrio destro un elettrodo di stimolazione coassiale controllato da un'unità isolata di stimolazione elettrica S 48. Questa farà battere il cuore a 300 battiti al minuto; impostare la stimolazione elettrica come segue.La frequenza deve essere di cinque impulsi al secondo, con un ritardo di 0,2 millisecondi, una durata della stimolazione di due millisecondi, un'intensità compresa tra sei e dodici volt e la modalità impostata su ripetizione e impulso singolo. Per le registrazioni ottiche prive di artefatti di movimento dovuti alla contrazione, il cuore deve essere disaccoppiato elettromeccanicamente. A tale scopo, passare nuovamente alle linee di perfusione con soluzione di Krebs-Henseleit contenente 11 millimolari di BDM.Tra un'acquisizione e l'altra. Perfusionare il cuore con soluzione di Krebs-Henseleit non modificata per aiutare a preservare la vitalità del preparato. Configurare i parametri di registrazione del software a 2000 hertz con un array di pixel di 1 28 per 1 28.L'intervallo tra i fotogrammi deve essere impostato a 0,5 millisecondi e i guadagni devono essere impostati a cinque x per l'amplificatore della telecamera e a otto x per il guadagno integrato. Il guadagno integrato deve inoltre essere impostato a 12. Impostare nel software il controllo della telecamera con un ritardo dell'otturatore di 500 millisecondi e registrare 4.000 fotogrammi per una durata di 2000 millisecondi.Spegnere o schermare tutte le luci della stanza e delle attrezzature per eliminare il rumore di fondo durante la registrazione; la luce LED illumina il cuore solo durante la registrazione ottica. Per ridurre il fotoblanco e la tossicità del colorante, controllare lo scatto della sorgente luminosa con un impulso di cinque volt erogato tramite il pannello di controllo attraverso una scheda D2A nel computer dopo l'acquisizione. Elaborare i dati utilizzando diverse impostazioni di filtro.Le impostazioni predefinite vengono generalmente utilizzate, ad eccezione della regolazione del filtro passa-banda con attenuazione, il cui limite sinistro è impostato a 44,0 e il limite destro a 98,0. Successivamente, le informazioni registrate vengono elaborate per generare un filmato. I dati provenienti da un'acquisizione corrispondono all'attivazione elettrica locale in 16.384 punti della superficie cardiaca nel corso di un periodo di due secondi.Il software consente di confrontare direttamente questi segnali locali tra loro e con i dati delle registrazioni elettrogrammiche atriali e ventricolari, mappando l'attivazione elettrica locale su un codice a colori e visualizzando queste informazioni sotto forma di un'animazione che mostra l'attivazione elettrica spaziotemporale sulla superficie cardiaca. Per creare un'animazione di questo tipo, innanzitutto utilizzare il software per filtrare temporalmente e/o spazialmente i dati. Successivamente, selezionare un tempo iniziale e un tempo finale per l'animazione.In terzo luogo, associare i segnali ottici a colori in base all'intensità luminosa di riposo di ciascun pixel. In quarto luogo, sovrapporre i dati cromatici risultanti a un'immagine del cuore e, infine, generare l'animazione qualora il preparato cardiaco perfuso fosse rimasto immobile durante la registrazione. I segnali ottici mostrano un picco distinto per ogni pixel coinvolto in una variazione dell'intensità di emissione della D eight anep. Questi filmati di imaging in tempo reale mostrano un fronte di eccitazione che si propaga sulla superficie epicardica del cuore, insieme alle registrazioni elettrografiche acquisite simultaneamente.Abbiamo appena dimostrato una tecnica ad alta risoluzione per ottenere immagini ottiche del movimento del potenziale d'azione sulla superficie del cuore rosso perfuso di Alanor. Durante questa procedura, è fondamentale rimuovere rapidamente il cuore dal soggetto rosso anestetizzato. Per evitare ischemia miocardica, le cellule miocardiche devono essere adeguatamente perfuse e il cuore deve essere completamente caricato con un colorante sensibile all'acqua.Ecco fatto. Grazie per aver guardato e buona fortuna con i vostri esperimenti.

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