Immagini dal vivo di Dense-core Vescicole nella Primaria neuroni coltivati ​​ippocampale

L'analisi in tempo reale delle cellule vive è particolarmente utile quando si studiano le dinamiche del traffico organellare. Questo video illustrerà una procedura utilizzata per acquisire immagini di vescicole a contenuto denso in neuroni ippocampali coltivati. I complessi di trasfezione vengono innanzitutto ottenuti mescolando il mezzo D-N-A-M-E-M e il reagente di trasfezione lipectomia.

Poiché i neuroni dell'ippocampo vengono coltivati su coprioggetti capovolti rivolti verso un monostrato di cellule gliali, questi coprioggetti devono essere girati per esporli al reagente di trasfezione. Dopo aver previsto un tempo sufficiente per l'espressione delle proteine dei vescicoli a nucleo denso marcate con GFP, viene allestita una camera per l'acquisizione delle immagini. L'acquisizione di immagini di ICALs a nucleo denso in neuroni in coltura può essere effettuata mediante microscopia a fluorescenza in campo chiaro.

Questo protocollo è flessibile e può essere adattato per l'immagine di altri organelli come mitocondri, endosomi e perossisomi. Ciao, sono Michael Silverman e benvenuti nel mio laboratorio di neuroscienze cellulari alla Simon Fraser University. Siamo interessati al modo in cui gli organelli si muovono nelle cellule nervose.

Per affrontare questa domanda, etichettiamo gli organelli della membrana don, in particolare le vescicole a contenuto denso in neuroni ippocampali in coltura. E per mostrarvi come procediamo, cedo la parola a David. Ciao, sono David del laboratorio Silverman.

Oggi vi mostrerò un procedimento per l'immagine in tempo reale di vescicole a nucleo denso e di neuroni in coltura, utilizzando una microscopia a campo ampio. Cominciamo. Per la maggior parte degli esperimenti, utilizziamo piatti di neuroni ippocampali di ratto coltivati a una densità cellulare di 250.000 cellule per piatto da sei centimetri, per ogni trasfezione, etichettando due tubi da 1,5 millilitri, uno per il plasmide di DNA e l'altro per il reagente di trasfezione.

In una cappa a flusso laminare, per combinare un microgrammo di DNA plasmidico con cento microlitri di MEM in un singolo tubo a temperatura ambiente, assicurarsi di utilizzare MEM che non contenga alcun supplemento. Combinare sei microlitri di lip con cento microlitri di MEM nell'altro tubo. La stessa quantità può essere utilizzata per una doppia trasfezione, anche se in tali casi il rapporto tra lip e DNA sarà dimezzato.

Per preservare la durata del reagente lipidico, mantenerlo sempre refrigerato o in un refrigeratore da banco; incubare le provette per cinque minuti a temperatura ambiente. Trasferire la miscela di DNA in MEM nel tubo lipidico e mescolare delicatamente con APE Next, quindi incubare per 30 minuti a temperatura ambiente. Dopo 25 minuti, aggiungere 60 microlitri di acido K neuraminico 50 millimolare per ridurre al minimo i danni citotossici ai neuroni in coltura.

Dato che coltiviamo i neuroni sul lato inferiore di coprioggetti sospesi sopra uno strato monocellulare di GL, è necessario capovolgere i coprioggetti ed esporre i neuroni alla soluzione di trasfezione. Capovolgere con attenzione il coprioggetto, posizionandolo con i piedini verso l'alto, utilizzando pinze sterili. Disporli in modo che non si sovrappongano.

Attenzione a non graffiare la superficie del coverslip rivestita con neuroni o la superficie della piastra rivestita con ggl. Al termine dell'incubazione di 30 minuti, prelevare circa N 0,5 millilitri di mezzo dalla piastra da sei centimetri e mescolare delicatamente con il DNA nel tubo. Trasferire nuovamente la soluzione di DNA nella piastra, lasciandola cadere uniformemente sulla superficie del mezzo.

Fare scivolare delicatamente la piastra avanti e indietro in una direzione, avendo cura di non provocare turbolenze nel mezzo. Dopo aver mescolato in una direzione, fermarsi e ripetere nell'orientamento perpendicolare per distribuire uniformemente i complessi di lipofezione del DNA all'interno della piastra. Incubare per 90 minuti nell'incubatore per colture cellulari a 37 °C e 5% di anidride carbonica.

Dopo l'incubazione, capovolgere i vetrini con il lato dei piedi verso il basso e disporli in modo che non si sovrappongano. Infine, lasciare procedere l'espressione del DNA per il tempo desiderato, che di solito è da tutta la notte fino a 48 ore nell'incubatore. L'analisi in tempo reale di vescicole dense marcate con GFP nei neuroni ippocampali in coltura richiede un microscopio a fluorescenza dotato di una telecamera CCD.

Sarà necessaria una camera per imaging dotata di un controllore di temperatura e di un riscaldatore per l'obiettivo. La camera non deve presentare porte aperte, una modifica che può essere inclusa al momento dell'ordine della camera stessa. Successivamente, accendere la fotocamera del microscopio, la lampada a fluorescenza e il software di acquisizione delle immagini.

Accendere l'alimentazione della piattaforma della camera e dei riscaldatori dell'obiettivo. Questo è anche il momento opportuno per applicare una goccia di olio sugli obiettivi. Preparare ora la piattaforma riscaldata e la camera di imaging.

Per facilitare la manipolazione, etichettare un lato del coperchio della camera con un pennarello indelebile. Posizionare il coperchio della camera con il lato superiore rivolto verso l'alto sul tappo di un tubo da 50 millilitri, che funge da supporto ideale per la camera.

Applicare un anello di grasso alla scanalatura che circonda il foro sul lato della camera contrassegnata come superiore. Evitare di usare troppo grasso poiché potrebbe entrare nella camera e ridurre l'area osservabile. Utilizzare pinzette.

Applicare un'ampolla pulita e non utilizzata da 18 centimetri sulla faccia superiore della camera. Esercitare una leggera pressione sui bordi dell'ampolla per creare una chiusura ermetica all'interno della scanalatura incassata della camera. Ruotare la camera e applicare un anello simile di grasso sulla scanalatura del lato opposto o inferiore della camera.

Trasferire 750 microlitri di mezzo di imaging nella camera. Questa è una quantità eccessiva, ma la vaselina dovrebbe impedire al mezzo di fuoriuscire e l'eccesso eviterà che si formino bolle d'aria quando viene applicato il coverslip ricoperto di cellule. Mantenere la camera preparata nell'incubatrice per colture cellulari fino al momento dell'utilizzo.

Incubazioni prolungate, come un'ora o più, devono essere evitate poiché il mezzo di imaging evaporerà e ne cambierà la composizione. Per il montaggio finale della camera per l'imaging in condizioni di vita, spostare la camera preparata e una piastra contenente coprivetri trasfettati dall'incubatrice all'ambiente sterile. Utilizzando pinze sterili, rimuovere con attenzione un coprivetro dalla piastra trasfettata.

Quindi toccare il bordo del vetrino con un fazzoletto di carta kim per rimuovere il mezzo di crescita. Successivamente, posizionare il vetrino con il lato dei neuroni rivolto verso il basso sulla camera preparata. Toccare un lato del vetrino con la vaselina prima di applicare pressione lungo i bordi, in modo da appiattire il vetrino senza intrappolare bolle d'aria.

Si prevede che l'eccesso di mezzo di imaging fuoriesca; rimuovere l'eccesso di mezzo di imaging, facendo attenzione a non spostare il coprioggetto dalla sua posizione. Spostare la camera sul riscaldatore della piattaforma preriscaldata e fissare saldamente la camera in posizione. Successivamente, trasferire la camera sul palchetto per ridurre il fotoblecamento e la fototossicità.

Regolare la lampada all'intensità minima necessaria per individuare le cellule trasfettate. Individuare ora una cellula di interesse. Utilizzando un obiettivo a immersione con basso ingrandimento, ad esempio 40 x, è utile seguire un modello di ricerca pianificato per garantire una copertura massima del vetrino e per evitare acquisizioni di immagini ridondanti.

Una volta localizzato il campo desiderato, passare al canale di una proteina d'interesse marcata con un fluorocromo. Passare a un obiettivo ad immersione ad alta ingrandimento, ad esempio da 60 a 100x, e riportare l'intensità della lampada a un valore elevato; utilizzare l'acquisizione in continuo o una funzione equivalente del software di imaging per registrare la dinamica della proteina marcata con fluorocromo per organelli in rapido movimento. Il tempo di esposizione e il ritardo tra le esposizioni devono essere ridotti al minimo per ottenere registrazioni con un'elevata frequenza di fotogrammi.

La deriva del fuoco osservata nell'anteprima a schermo può essere corretta in tempo reale mediante regolazione manuale della messa a fuoco. Assicurarsi di acquisire un'immagine in contrasto di fase e tutte le altre immagini necessarie per le analisi e le presentazioni successive. Salvare tutte le immagini prima di proseguire l'esplorazione del vetrino e procedere con la registrazione successiva.

Di norma, si considera un successo l'ottenimento di tre a cinque registrazioni da un solo cover slip, e ogni cover slip viene osservato per un periodo compreso tra 30 e 60 minuti; in generale, è necessario tenere presente la fototossicità e il suo impatto sulla salute cellulare, poiché i trasportatori possono risultare ridotti in cellule danneggiate. Le osservazioni mediante microscopia a cellule vive consistono tipicamente in registrazioni, note anche come serie di immagini (stack), che mostrano il movimento di organelli marcati con fluorescenza all'interno del campo visivo. Di seguito è riportato un filmato rappresentativo del trasporto di iCal a nucleo denso.

Il colore è stato invertito per una più facile osservazione. Osservare le particelle in movimento. I grafici CH sono immagini che illustrano il movimento delle particelle affiancando scansioni lineari in cui ogni punto temporale è rappresentato da una colonna del grafico.

Questa figura mostra come due particelle che si muovono in direzioni opposte vengono rappresentate in un grafico CH. Un'ulteriore analisi dei cronografi può fornire informazioni sulla velocità del flusso di particelle, sugli inversioni della lunghezza della corsa e sulle particelle stazionarie. Ciao, ti abbiamo appena mostrato come acquisire registrazioni ad alta velocità del trasporto di vescicole dsco e di neuroni ippocampali coltivati.

Quando si esegue questa procedura, è importante ricordare di preriscaldare tutti i componenti della camera di imaging e della piattaforma per ridurre lo stress cellulare durante il passaggio dall'incubatrice al palchetto. È necessario lavorare con rapidità ma attenzione. Questo è tutto.

Grazie per aver guardato e buona fortuna con i vostri esperimenti.