Visualizzazione di Live Drosophila Gliali-giunzione neuromuscolare con tinture fluorescenti

Questa procedura inizia preparando una larva di drosophila in modo che venga rivoltata come un guanto, esponendo la superficie delle cellule muscolari della parete corporea associate ai neuroni motori e alle cellule ggl. Combinando la colorazione fluorescente dei terminali neuronali presinaptici, l'espressione endogena di GFP e DS red, indirizzata alle membrane gliali e muscolari postsinaptiche, e la visualizzazione dello spazio parasinaptico mediante coloranti fluorescenti, è possibile osservare chiaramente i cambiamenti strutturali che avvengono alla giunzione neuromuscolare gliale in un preparato vivo. Ciao, sono D Brink del laboratorio ALS di Vanessa presso il dipartimento di zoologia dell'Università della British Columbia. Oggi vi mostrerò una preparazione del tessuto e due tecniche di marcatura cellulare per l'acquisizione di immagini di tessuto larvale vivo mediante microscopia confocale.

Utilizziamo questa procedura in laboratorio per studiare le cellule gliali alla sinapsi neuromuscolare. Passiamo ora a qualcosa di completamente diverso: la preparazione del tessuto a sacchetto rovesciato inizia con la determinazione dello stadio delle larve. Questa procedura verrà dimostrata su larve di terzo stadio vaganti, poiché sono grandi e facili da dissezionare; utilizzare esclusivamente larve W3 che si stanno attivamente spostando.

Successivamente, pulire la superficie delle larve con un pennello da pittura molto morbido in una piastra di Petri contenente acqua doppio-distillata. La pulizia delle larve è importante perché migliora l'ottica e riduce anche la presenza di batteri. Dopo aver pulito la larva, trasferirla in una piccola piastra di Petri contenente tre millilitri di HL6 ghiacciato con cinque millimoli di glutammato.

Mettere la piastra sul ghiaccio fino a quando l'animale smette di muoversi e si rilassa, il che di solito richiede circa due minuti. Una volta che le larve hanno smesso di muoversi, è possibile iniziare la dissezione del tessuto utilizzando un microscopio stereoscopico, tenendo le forbici a molla nella mano dominante e una pinzetta a punta molto fine. Con l'altra mano, praticare un piccolo foro nella parete corporea con le forbici per equilibrare la pressione attraverso la parete corporea, tenendo delicatamente l'animale sul fondo della piastra.

Con la pinzetta, tagliare i due segmenti posteriori ed estrarre le viscere. Alcuni tessuti adiposi probabilmente usciranno dalla cavità corporea attraverso l'incisione. Rimuovere anche questo tessuto.

Continuare a trattenere delicatamente le larve contro il fondo della piastra con la pinzetta fine. Con l'altra mano, prendere un ago da insetto numero zero a punta smussata e spingerlo contro le parti boccali delle larve. Spingere le parti boccali all'interno della cavità corporea come se si stesse rivoltando un calzino sul pugno.

Il tessuto, con la parte interna all'esterno, dovrebbe avere questo aspetto. Con le forbici a molla sottilissime per dissezione, rimuovere il corpo adiposo e le trachee dalla parete corporea. Eliminare il più possibile il corpo adiposo.

Cerchi con ogni mezzo di non tirare le trachee né di danneggiare il sistema nervoso. Strappare le trachee causerebbe lacerazioni nei muscoli della parete corporea. Al termine della dissezione, il muscolo dovrebbe apparire traslucido e rilassato, non opaco né contratto.

Se si pone il muscolo nell'HL6 senza glutammato a temperatura ambiente, è probabile che contragga in modo ritmico. Poiché i generatori del pattern motorio nel SNC sono attivi, la parete corporea integra e invertita tende a piegarsi a metà lungo le linee mediane dorsale e ventrale. Pertanto, il preparato fornisce un emianimale destro o sinistro da visualizzare.

Infine, montare il tessuto su un vetrino da microscopio utilizzando un'impalcatura con coprivetrino sospeso. Le procedure per il montaggio del tessuto saranno mostrate in seguito. Per iniziare l'etichettatura dei battoni neuronali, pipettare 30 microlitri di soluzione dell'anticorpo primario anti-HRP marcati con fluorocromo in HL6 e depositarne una goccia su una piastra di Petri.

Successivamente, immergere il preparato della parete corporea rivoltata all'interno nel bagno di colorazione. È possibile osservare l'etichettatura dei terminali neuronali già dopo circa cinque minuti, ma si consiglia un'incubazione di 10-20 minuti per un'etichettatura completa e intensa.

Per rimuovere l'eccesso di marcatura con HRP, immergere il tessuto in 0,5 mL di HL6 per 10-30 secondi a temperatura ambiente. Il colorante non legato si elimina rapidamente, quindi il risciacquo non deve essere lungo né vigoroso. Il tessuto marcato è ora pronto per essere montato e visualizzato mediante microscopia.

Una variante del protocollo di marcatura con anticorpi vivi appena mostrato prevede l'utilizzo di destrina marcati con fluorocromo per evidenziare gli spazi extracellulari pieni di liquido. Per iniziare questa procedura, diluire il colorante di destrina marcati con fluorocromo in HL6 a 0,001 milligrammi per millilitro. Potrebbe essere necessario variare la concentrazione di destrina se non si è interessati al tempo esatto di ingresso nell'asse extracellulare.

Pipettare una goccia di 20 microlitri di colorante su un vetrino coprioggetto con ponticello e trasferire il preparato tessutale nel bagno di colorante. Se il tessuto in posizione inversa non necessita di essere perfuso o se il volume di HL6 deve essere mantenuto ridotto, può essere montato su un vetrino con doppio ponticello. Iniziare incollando con colla cianoacrilica due vetrini quadrati da 18 millimetri su un vetrino microscopico molto pulito.

Lasciare un intervallo di due millimetri tra i bordi dei vetrini e centrare l'intervallo, approssimativamente nel mezzo del vetrino. Far asciugare completamente la colla, altrimenti formerà una pellicola sul mezzo acquoso intorno al preparato del tessuto.

Successivamente, posizionare una goccia di 30 microlitri di HL six nello spazio tra i coprioggetti. Posizionare il tessuto al contrario all'interno della goccia di HL six. Potrebbe essere necessario posizionare il tessuto in diagonale se la larva è di grandi dimensioni e il sistema di acquisizione delle immagini ha un array di pixel limitato.

Applicare una piccola quantità di vaselina ai bordi di un terzo coprioggetto da 18 millimetri e posizionarlo con il lato unto rivolto verso il basso sui due coprioggetti incollati, sopra il tessuto, premendo delicatamente. Di seguito i risultati ottenuti con i due metodi di marcatura fluorescente acuta della preparazione di larva inside-out, acquisiti mediante microscopio confocale a disco rotante. La prima è un'immagine a stack ottico di una sinapsi gliale-nervo-muscolo con terminali del botone marcati con anti-HRP vivo.

Alla superficie della cellula muscolare, possiamo osservare terminali di tipo bottone neuronali fortemente marcati, colorati artificialmente in blu. Al centro della serie di immagini, troviamo estensioni gliali marcate con GFP mostrate in verde, così come bottone marcati con HRP in blu. Circondando i bottoni, possiamo vedere sezioni trasversali della SSR simile a una tasca, le reti subsinaptiche, colorate in rosso; anche a metà della serie e in profondità nella serie sono presenti SSR marcati in rosso DS.

I SSR sono le regioni sinaptiche specializzate della cellula muscolare. I bns si trovano all'interno delle invaginazioni delle cellule muscolari, così come alcune parti delle estensioni gliali verdi. Le estensioni delle cellule gliali si inseriscono attorno ai bns e ai SSR, ma non ricoprono la superficie della sinapsi come una coperta negli strati più profondi della struttura.

Troviamo prolungamenti gliali verdi e la SSR rossa, ma non molte terminazioni a bottone. Possiamo inoltre osservare sezioni trasversali del nervo motorio che innerva il muscolo. Le cellule gliali avvolgono il nervo motorio, pertanto anche questo appare verde.

Il secondo risultato della marcatura fluorescente acuta del preparato larvale inside-out è la sinapsi marcata con destrina fluorescente. Qui, il liquido nello spazio parasinaptico o fessura sinaptica è marcato in rosso. Nei livelli superficiali dell'immagine ottenuta mediante stack ottico, è presente uno strato di liquido colorato con destrina rossa, e si può osservare dove si accumula nelle depressioni ondulate della membrana plasmatica muscolare.

Negli strati più profondi della serie, il colorante fluorescente della destrina si è infiltrato nelle fessure sinaptiche; si formano piccoli anelli a forma di ciambella di colorante tra le terminazioni neuronali e le sacche SSR marcate in blu. Questa è la fessura sinaptica evidenziata con il colorante. La lamella gliale verde non impedisce la penetrazione del colorante nella fessura negli strati più profondi della serie di immagini.

Le caratteristiche più evidenti sono la SSR o regione sinaptica del muscolo marcata in blu e le estensioni gliali appiattite che sono verdi. Allo stesso modo, la guaina gliale attorno agli assoni nelle strati profondi appare verde. La guaina gliale sembra escludere il colorante alla destrina.

Vi ho appena mostrato un metodo innovativo per visualizzare la sinapsi nervo-muscolo gliale in una preparazione tissutale invertita di larve di drosophila. Durante la preparazione del tessuto, è importante ricordare di manipolarlo con estrema delicatezza e assicurarsi che il muscolo sia rilassato e che i nervi periferici non subiscano danni. Desidero concludere con una citazione di Marx.

Il tempo vola come una freccia. La paura vola come una banana.