Dissezione e registrazione dal bivio C. Elegans neuromuscolare

Un'ampolla rivestita con A viene preparata spalmando una goccia di A sul vetrino e lasciandola polimerizzare durante la notte; l'ampolla viene quindi posizionata nella cavità circolare della camera di registrazione prefabbricata e coperta con soluzione di registrazione. Un verme posizionato al centro viene incollato alla superficie del parabrezza, partendo dalla testa o dalla coda, applicando la colla sul lato dorsale del verme mediante una pipetta per colla. Al termine dell'incollaggio, viene effettuata un'incisione adiacente alla vulva, all'interfaccia tra cuticola e colla, utilizzando un ago di vetro, e l'incisione viene estesa verso la testa dopo aver rimosso le viscere e le uova dalla cavità corporea.

Il margine tagliato dell'incisione viene saldato con la colla alsofar, esponendo il nervo ventrale e i muscoli della parete corporea. Il muscolo mediale ventrale anteriore alla vulva viene sottoposto a patch clamp e l'elettrodo di stimolazione viene posizionato a monte del cordone nervoso. Salve, sono Janet Richmond, professoressa associata del Dipartimento di Scienze Biologiche dell'Università dell'Illinois di Chicago.

Oggi vi mostrerò una tecnica di dissezione che ci permette di esporre le giunzioni neuromuscolari della seppia. Per la registrazione elettrofisiologica. Utilizziamo questo preparato per studiare la trasmissione sinaptica.

Ok, iniziamo. Prima di lavorare con i nematodi, alcune attrezzature devono essere preparate almeno un giorno prima della procedura. Una camera di registrazione per dissezione, coprivetri in vetro rivestiti con S guard, pipette usate, un applicatore di colla e una pipetta di estrazione.

Iniziare costruendo la camera. Tagliare un foglio di plexiglass dello spessore di un sedicesimo di pollice in modo che corrisponda alla piastra del microscopio. Utilizzato per effettuare le registrazioni al centro del plexiglass.

Praticare un foro circolare sufficientemente ampio da contenere un vetrino circolare del diametro di 22 millimetri. Fissare un vetrino di 48 per 60 millimetri alla faccia inferiore della camera, al di sotto del foro, utilizzando un piccolo pezzo di paraffina per inclusione istologica a basso punto di fusione in ogni angolo del vetrino. La paraffina viene rapidamente fusa su una piastra riscaldata, lasciando uno strato sottile di paraffina tra il plexiglass e il vetrino dopo il raffreddamento; rimuovere con una lama qualsiasi eccesso di paraffina.

Il vetrino che si adatta alla camera è un vetrino coprioggetto rivestito S guard da 22 millimetri. Affinché il sard funzioni, deve essere preparato al momento seguendo le istruzioni del produttore. Una volta preparato, una piccola goccia di sard viene posta su ciascun vetrino coprioggetto e spalmata con una lama per ottenere una superficie uniforme.

I coprioggetti rivestiti vengono quindi posizionati in contenitori chiusi e lasciati per tutta la notte in un forno a 65 gradi Celsius per la polimerizzazione. Domani saranno pronti per la dissezione durante tutto il protocollo. Sono necessarie pipette di vetro al silicato con un diametro esterno di 1 mm, tirate fino a formare una punta con una resistenza di circa 4 megaohm; pertanto, è consigliabile tenere a disposizione un barattolo di riserva.

Consultare il video pubblicato da JoVE sulla preparazione di patch, pipette ed elettrodi affilati con un polarizzatore programmabile di Miriam Goodman. Per i dettagli tecnici della registrazione elettrofisiologica, il nematode deve essere incollato in posizione. A tale scopo, è necessario un applicatore di colla.

L'applicatore di colla è semplicemente un tubo di plastica di due millimetri con un diametro interno di un millimetro. Un'estremità del tubo verrà tenuta in bocca. Può essere dotato di un boccaglio, e l'altra estremità del tubo sosterrà una pipetta da un millimetro riempita di colla.

Viene utilizzata anche una pipetta specializzata per l'estrazione durante la dissezione. Questa è composta da un tubo e da una pipetta, proprio come l'applicatore di colla, con la differenza che la punta della pipetta è leggermente arretrata per contenere le uova e le viscere. Iniziare tracciando una linea di cera lungo il perimetro della camera.

Ora premere e posizionare un'ampolla con coprivetro rivestito di S guard, con il lato Syl guard rivolto verso l'alto. La linea di cera immobilizza il coprivetro e impedisce alla soluzione di registrazione di infiltrarsi sotto e staccare il coprivetro durante la dissezione e la registrazione. La camera viene quindi riempita con soluzione extracellulare di registrazione. Leggere il testo allegato per la formulazione una volta che la camera è pronta.

Utilizzare un ago per nematodi per posizionare diversi nematodi nella soluzione. Con la pratica, i nematodi in movimento possono essere incollati senza ulteriori procedure per impedirne lo spostamento. Riempire un contenitore per colla realizzato con un tappo di PCR fissato alla cera o alla argilla modellabile con una soluzione lavorativa della colla acrilica Sano per poter lavorare con la colla.

Completare la costruzione dell'applicatore di colla collegando la pipetta di registrazione all'estremità dell'applicatore. Quindi, sotto la lente di dissezione, riempire l'applicatore di colla mediante aspirazione orale. L'applicazione della colla su un nematode è difficoltosa e richiede pratica, poiché la colla si polimerizza al contatto con la soluzione extracellulare di registrazione.

Per evitare ciò, mantenere un flusso costante verso l'esterno della colla, altrimenti si indurirà e ostruirà la pipetta. Se la pipetta dovesse ostruirsi, a volte è possibile rimuovere l'ostruzione picchiettando delicatamente la punta sul vetrino coprioggetto. Esercitarsi a lavorare con la colla.

E quando sei in grado di scrivere il tuo nome con la colla sulla superficie del sil guard, probabilmente sei pronto per incollare la cuticola del nematode. Per prima cosa, scegline uno vicino al centro della camera, dove c'è spazio sufficiente per operare. In secondo luogo, applica una piccola quantità di colla sulla testa o sulla coda del nematode e trascinalo rapidamente sulla superficie del sil guard.

Applicare quindi un filo di colla lungo il margine dorsale della cuticola dei nematodi. Questo costringe il nematode in una posizione a C con la vulva rivolta verso l'interno. Eventuali interruzioni in questa linea di colla devono essere riempite per massimizzare l'adesione tra il nematode e il supporto in silicio.

Questo è un procedimento delicato e può essere utile esercitarsi su mutanti con ipo motilità. Come nel caso del 31, c'è una vescicola proprio a destra. Ora sposterò questo preparato e poi introdurrò l'ago di vetro e inizierò a praticare l'incisione. Per effettuare l'incisione nel cuticolo, passare a una pipetta da dissezione manuale.

Questa pipetta deve essere più affilata delle pipette utilizzate per le registrazioni con colla e deve avere un gambo corto e robusto, usando l'ingrandimento più elevato. Sotto il microscopio stereoscopico, allineare la pipetta parallelamente all'asse longitudinale del nematode ed inserire la punta vicino alla vulva, all'interfaccia tra cuticola e colla. Quest'incisione rilascia la pressione idrostatica del nematode, facendo fuoriuscire uova e intestino attraverso il punto d'incisione.

Continuare a tagliare la cuticola in direzione della testa del nematode con un movimento a fettina, simile a quello usato per aprire una lettera, fino a raggiungere la faringe. Passare ora alla pipetta di estrazione per aspirare gli organi interni del nematode. Dopo aver ripulito l'incisione, la cuticola aperta manterrà la sua forma cilindrica.

Successivamente, prendere una pipetta per incollare nuova. Utilizzarla per saldare con punti di colla la cuticola al bordo dell'incisione sulla superficie della protezione in syl. È importante utilizzare quantità minime di colla in questa fase per evitare di danneggiare o oscurare i njs.

Il cordone nervoso ventrale e i muscoli della parete corporea sono ora esposti, ma la membrana basale che ricopre la giunzione neuromuscolare deve ancora essere rimossa. Per fare ciò, aspirare la soluzione di registrazione extracellulare dalla camera e applicare una soluzione di registrazione extracellulare con 0,4 milligrammi per millilitro. Dopo 10-20 secondi, rimuovere la collagenasi e lavare il preparato diverse volte con soluzione di registrazione fresca.

Il nematode è ora pronto per le registrazioni elettrofisiologiche. Nella posizione della giunzione neuromuscolare, sulla camera di registrazione posta sul palco di un microscopio eretto, utilizzare un obiettivo 10x per centrare il nematode, quindi passare a un obiettivo a immersione in acqua 40x con ottica DIC e verificare che i muscoli della parete corporea e il cordone nervoso siano integri. Posizionare il nematode in orizzontale in modo che gli elettrodi possano essere introdotti sia dal lato sinistro che da quello destro.

Normalmente effettuiamo la registrazione sulla parte ventrale mediale del corpo, dove si trovano i muscoli interni alla vulva, ma è possibile registrare facilmente anche sui muscoli situati sia sul lato dorsale che su quello ventrale del verme, con un paio di neuroni che appaiono come semicerchi premuti contro il muscolo. Procedere quindi con la registrazione sul muscolo utilizzando tecniche standard di patch clamping per ottenere un gigaseal. Nella nostra esperienza, elettrodi di registrazione con una resistenza di circa quattro megaohm si sono rivelati efficaci per la modalità di registrazione in voltage clamp in intera cellula.

Applicare una maggiore aspirazione e colpire la membrana finché il sigillo giga non si rompe. Abbiamo parlato di avere una resistenza di quattro megaohm. Quindi, se osserva lì, sì, indica 4,9 megaohm.

È più grande, è normale. È nell'ordine di grandezza che utilizziamo. Ok. Sì. Ora proveremo ad andare sul grande, quindi cosa?

Cosa? Vogliamo che scenda completamente. Sì. Capito. Evviva.

In una registrazione di buona qualità, i muscoli della parete corporea di nematodi adulti di tipo selvatico presentano generalmente una capacità della membrana cellulare di circa 70 picofarad e possono essere registrati in modo stabile per almeno 10 minuti a un potenziale di clamping di -60 millivolt, con correnti di clamping minime, pari a circa 50 picoampere. Una volta effettuato il patch su una cellula muscolare, la stimolazione mediante un secondo elettrodo, l'attivazione luminosa di un canale, Rodin o l'aggiunta di soluzione iperosmotica genereranno tutte risposte misurabili. Per ottenere una risposta evocata elettricamente, posizioniamo tipicamente un elettrodo stimolante contenente soluzione extracellulare sul cordone nervoso ventrale, interno rispetto al muscolo patchato.

Questa configurazione in patch lasso richiede impulsi di corrente di uno-due millisecondi compresi tra 10 e 40 volt. Sfortunatamente, dopo alcuni risposte evocate, il cordone nervoso viene danneggiato in modo irreversibile e, per motivi sconosciuti, con questa configurazione è possibile ottenere soltanto risposte evocate colinergiche. In alternativa, nematodi che esprimono un canale attivato dalla luce, in cui il transgene dosin è presente in diverse popolazioni neuronali, possono essere utilizzati per indurre il rilascio.

In previsione di questo metodo, tenere presente che i nematodi utilizzati per questa applicazione devono essere coltivati su batteri arricchiti con retinolo. In questa preparazione, un LED ad alta potenza da 470 nanometri filtrato attraverso un filtro di eccitazione GFP da 450 a 490 nanometri viene utilizzato per attivare ripetutamente l'opsina del canale, inducendo il rilascio di diversi neurotrasmettitori a seconda dei tipi cellulari che esprimono il canale. L'ultima tecnica da esaminare può essere utilizzata per misurare l'ampiezza del pool di riserva prontamente rilasciabile di vescicole sinaptiche da diversi neuroni al muscolo registrato.

Questo si ottiene applicando per uno o tre secondi un'impulso di pressione di una soluzione extracellulare iperosmotica sul muscolo in patch. Il risultato sarà una scarica di eventi postsinaptici asincroni. Vengono mostrate registrazioni del muscolo della parete corporea in voltometria in configurazione whole cell per ciascuno dei tre protocolli di stimolazione descritti sopra: risposte evocate elettricamente, evocate dalla luce e iperosmotiche.

In tutti i casi, il muscolo della parete corporea mediale ventrale viene clampato a -60 millivolt. Le cellule muscolari di tipo selvatico mostrano tipicamente elevati tassi di correnti sinaptiche miniature endogene entranti. Nelle nostre soluzioni standard per la registrazione, una depolarizzazione della corda nervosa ventrale anteriore della durata di due millisecondi provoca un rilascio sincrono da diverse sinapsi, generando una risposta evocata di circa 2-2,5 nanoampere.

In vermi di tipo selvatico, tracce rappresentative a destra delle tracce del tipo selvatico in A e B mostrano il rilascio sinaptico in un mutante gravemente scoordinato; nel pannello C18 si osserva una risposta evocata dalla luce alla giunzione neuromuscolare di un verme di tipo selvatico che esprime channel red dosin. Nei neuroni colinergici, un impulso luminoso di due millisecondi produce tipicamente una risposta compresa tra 1,5 e 1,8 nanoampere. L'eiezione sotto pressione di soluzione salina iperosmotica da 850 milliosmole sul muscolo per un secondo provoca un bombardamento asincrono di correnti sinaptiche miniature, rappresentative del pool di vescicole prontamente rilasciabili.

Vi ho appena mostrato la tecnica di dissezione che utilizziamo per esporre le giunzioni neuromuscolari di *Aplysia californica* ed effettuare registrazioni elettrofisiologiche. È importante ricordare che questa tecnica è complessa e probabilmente vi richiederà mesi per perfezionarla. Tuttavia, una volta acquisita, è come andare in bicicletta.

Le tecniche rimarranno con voi, e più le praticherete, più la preparazione diventerà veloce e affidabile. Questo è tutto. Grazie per aver guardato e buona fortuna con i vostri esperimenti.