Vaccino infezione da virus e analisi temporale di espressione genica del virus: Parte 1

Le infezioni in corso temporale di cellule HeLa utilizzando il virus vaccinia iniziano impostando le infezioni virali, infettando le cellule e quindi isolando l'RNA dalle cellule infette in diversi punti temporali successivi all'infezione. Questo RNA può successivamente essere amplificato per l'ibridazione su microarray al fine di analizzare l'espressione genica. Ciao, sono Judy Ann del laboratorio di Kate Irvins presso l'Istituto Whitehead per la Ricerca Biomedica.

Oggi vi mostreremo una procedura per un'infezione in corso di tempo con il virus della vaccinia in cellule di mammifero e la successiva estrazione di RNA dalle cellule infette in diversi punti temporali dopo l'infezione. Questa tecnica rappresenta un primo passo in un protocollo più ampio volto all'estrazione e all'amplificazione dell'RNA al fine di valutare l'espressione genica del virus durante l'infezione, che sarà completato in altri due video di JoVE. Cominciamo: per preparare l'infezione, coltivate cellule HeLa in fiasche e attendete finché le cellule non raggiungono una confluenza di circa l'80%.

Successivamente, assicurarsi di preparare una quantità sufficiente di mezzo di crescita virale per l'esperimento. Utilizzando DMEM normale con il 2% di FBS e senza antibiotici aggiunti, l'infezione può essere eseguita sia con il ceppo di virus vaccinia disponibile in laboratorio con un titolo noto sia con il virus purificato in saccarosio con un titolo noto. Se si teme un'influenza sull'espressione genica dell'ospite, e se si sta utilizzando il virus purificato in saccarosio, passare alla sessione successiva.

Se si utilizza un virus vaccinia grezzo, sottoporre a sonificazione e suddividere in aliquote il virus immediatamente prima dell'infezione, impiegando un bagnomaria a ultrasuoni contenente prevalentemente ghiaccio e una piccola quantità di acqua, con una potenza di circa 30 W per 20 secondi. Vortexare il tubo e ripetere la sonificazione per tre volte, aggiungendo altro ghiaccio se necessario per mantenere il bagnomaria pieno di ghiaccio e ben refrigerato; assicurarsi di effettuare il vortex tra ogni fase di sonificazione. Se non si dispone di un bagnomaria a ultrasuoni, mescolare un volume uguale del ceppo virale grezzo al punto 25 milligrammi per millilitro.

Agitare vigorosamente con tripsina, incubare la scorta del virus e mescolare in un bagno d'acqua a 37 gradi Celsius per 30 minuti. Agitare a intervalli di cinque-dieci minuti per infettare le cellule. Per prima cosa, calcolare la quantità di particelle virali necessarie per infettare il monostrato alla molteplicità di infezione desiderata.

O MOI. Di solito si utilizza un MOI elevato compreso tra cinque e 10 per i corsi temporali di infezione. Successivamente, aggiungere la quantità desiderata di virus purificato in saccarosio o virus grezzo da tryp al mezzo di crescita virale a 37 gradi Celsius e mescolare bene.

Si dovrebbe utilizzare una quantità di mezzo sufficiente a coprire appena il fondo del matraccio. 10 millilitri di mezzo sono sufficienti per un matraccio T175. Rimuovere il mezzo dalle cellule e risciacquare con PBS a temperatura ambiente.

Aggiungere il virus o il terreno di crescita virale a ogni fiasco per un punto temporale mock a zero ore. Aggiungere solo il terreno di crescita virale senza virus, mescolare delicatamente e inclinare le piastre, quindi incubare a 37 gradi Celsius in un incubatore con 5% CO2 per un'ora. Inclinare e mescolare le piastre ogni 15 minuti per distribuire uniformemente il virus e mantenere le cellule umide.

Dopo l'incubazione, rimuovere il mezzo contenente il virus e risciacquare tre volte con PBS a temperatura ambiente. Aggiungere la quantità massima di mezzo di crescita virale a ciascun matraccio.

Ad esempio, 30 millilitri di mezzo per una fiala T 1 75. È possibile iniziare a conteggiare questo come il punto temporale zero al momento desiderato post-infezione. Controllare le cellule al microscopio e annotare eventuali effetti citopatici o CPE.

Rimuovere il mezzo e lavare le cellule con 30 millilitri di PBS a temperatura ambiente. Successivamente, aggiungere 15 millilitri di tripsina alle cellule e incubare per due-cinque minuti. A 37 gradi Celsius, verificare al microscopio il distacco delle cellule e battere delicatamente il fiasco per staccare le cellule.

Trasferire le cellule con una pipetta sierologica sterile in un tubo conico da 50 millilitri. Lavare la fiasca con un volume uguale di terreno di crescita cellulare e aggiungere il terreno alle cellule trattate con tripsina nel tubo conico. Centrifugare le cellule a 500 G per cinque minuti a temperatura ambiente.

Dopo la centrifugazione, rimuovere il mezzo triin dal pellet cellulare, risospendere il pellet cellulare e aggiungere o il reagente triolo o il buffer di lisi del kit di isolamento dell'RNA scelto. Se si utilizza il triolo, dividere il campione in aliquote di un millilitro in provette eppendorf da 1,5 millilitri etichettate e congelare a meno 80 gradi Celsius. Ripetere per tutti i punti temporali.

Raccolta di un'unità di coltura per ogni punto temporale. A questo punto, il campione dovrebbe essere sospeso nel reagente triolo e pronto per essere processato. Aggiungere 200 microlitri del reagente di separazione delle fasi BCP.

Per ogni millilitro di triolo in ogni provetta, il BCP o il bromo tre cloro propano vengono utilizzati al posto del fenolo. Per ridurre la contaminazione da DNA genomico, potrebbe essere necessario trasferire il campione in una provetta più grande. Se si parte con una grande quantità di triolo, vortexare o agitare energeticamente e incubare a temperatura ambiente per due o tre minuti; dopo l'incubazione, centrifugare il campione a 12.000 ×g per 15 minuti.

Una fase acquosa dovrebbe essere visibile come un chiaro strato superiore. Trasferire la fase acquosa in una provetta pulita. Si dovrebbero recuperare circa 600 microlitri per ogni millilitro di triazolo di partenza.

Eseguire una seconda estrazione con fenolo-cloroformio. Questa volta utilizzare 500 microlitri di cloroformio per ogni millilitro di triazolo invece di BCP. La seconda estrazione con cloroformio serve a rimuovere eventuali tracce di solvente organico dall'estrazione, poiché anche quantità minime possono inibire i successivi passaggi di amplificazione.

Vortexare o agitare vigorosamente, quindi incubare a temperatura ambiente per due o tre minuti. Centrifugare il campione a 12.000 ×g per 15 minuti dopo la centrifugazione. Trasferire la fase acquosa in una provetta nuova.

Ricordare che la fase acquosa è lo strato trasparente superiore. Successivamente, aggiungere 20 microgrammi di acrilamide lineare a ciascun campione. L'acrilamide lineare funge da veicolo e favorisce la precipitazione dell'RNA.

Aggiungere 500 microlitri di isopropanolo per ogni millilitro di triolo di partenza a ciascun campione e mescolare. Incubare accuratamente i campioni a temperatura ambiente per 10 minuti; dopo l'incubazione, centrifugare in una microcentrifuga alla velocità massima per 10-15 minuti. Il pellet di RNA sarà visibile sul fondo del tubo dopo la centrifugazione.

Rimuovere con molta attenzione il soprannatante dal tubo, utilizzando un aspiratore a vuoto oppure manualmente con una pipetta. Non disturbare il pellet. Lavare il pellet con un millilitro di etanolo al 70% e centrifugare alla velocità massima per cinque o sette minuti.

Con molta attenzione, rimuovere l'etanolo dal tubo utilizzando un aspiratore a vuoto oppure manualmente con una pipetta. Scartare il soprannatante.

Verificare che il pellet sia visibile sul fondo del tubo. Ripetere questo passaggio di lavaggio dopo aver scartato il sopranatante. Contrassegnare la posizione del pellet sul tubo.

Far asciugare all'aria il pellet per non più di cinque minuti. Non asciugare eccessivamente, altrimenti l'RNA sarà difficile da ricostituire. Successivamente, se si prevede il trattamento con DNA, sospendere il pellet in 17 microlitri di acqua priva di nucleasi.

Se il trattamento con D'S non è previsto, sospendere in 20 microlitri. Per il trattamento con D'S, utilizzare il kit KaiGen RNA free DNA. Aggiungere due microlitri di buffer RDD e un microlitro di RNAsi ricostituita priva di RNA.

Incubare il DNA a 37 gradi Celsius per 30 minuti in presenza di RNA, dopo aver risospeso delicatamente la miscela. Successivamente, aggiungere due microlitri di EDTA 2,5 millimolare e incubare a 65 gradi Celsius per cinque minuti. Per inattivare il DNA, non superare il tempo o la temperatura di inattivazione, poiché tempi più lunghi e temperature più elevate possono causare la degradazione dell'RNA.

Ora hai completato il trattamento del DNA. Verifica la concentrazione di RNA mediante spettrofotometro. Tracce di fenolo o BCP possono essere rilevate come un picco a 270 nanometri oltre il picco standard a 260 nanometri.

Quando si misura l'assorbanza dell'RNA totale dopo l'estrazione, se appare tale contaminazione, purificare nuovamente l'RNA utilizzando un metodo di estrazione basato su filtro o colonnina prima di procedere con l'amplificazione. Il campione di RNA può essere conservato a meno 80 gradi Celsius. Se lo si desidera, è possibile verificare la qualità dell'RNA utilizzando un bioanalizzatore Agilent oppure eseguendo il campione su un gel denaturante e controllando le letture di densità ottica (OD) sul bioanalizzatore.

Una buona qualità dell'RNA è indicata dal numero di integrità dell'RNA o RIN. Il RIN si basa su un sistema numerico che va da uno a 10, dove uno corrisponde al profilo più degradato e 10 a quello più integro. Abbiamo appena mostrato come eseguire un'infezione in corso di tempo con il virus della vaccinia e come estrarre l'RNA da cellule infette in diversi punti temporali successivi all'infezione.

Quando si esegue questa procedura, è importante ricordare che ci sono diversi passaggi critici nella preparazione di un'infezione sincrona da vaccinia. Innanzitutto, una sonificazione accurata o una trattamento con tripsina del virus. È fondamentale disgregare le particelle virali poiché il vaccinia tende fortemente ad aggregarsi, il che impedirebbe un'infezione uniforme delle cellule.

In secondo luogo, per ottenere un'infezione asincrona, si dovrebbe utilizzare un MOI elevato, superiore a due, al fine di garantire che ogni cellula venga infettata. Una miscela di cellule infette e non infette porterà a ripetuti cicli di infezione, a miscele eterogenee di punti temporali e a risposte trascrizionali virali e dell'ospite asincrone. In terzo luogo, l'infezione deve essere eseguita con quantità minime di mezzo per consentire un'assorbimento massimo del virus sulle cellule.

Inoltre, l'agitazione regolare del flacone o delle piastre di coltura ogni 10 minuti favorisce la distribuzione del virus all'interno del flacone e garantisce che le cellule non si secchino. Questo è tutto. Grazie per averci seguito e buona fortuna con i vostri esperimenti.

Assicurarsi di guardare gli altri video di questa serie in cui mostriamo la procedura per l'amplificazione lineare di campioni di RNA e la preparazione e la purificazione di RNA marcato con fluorocromo.