Name: Vaccino infezione da virus e analisi temporale di espressione genica del virus: Part 2 (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2009-04-10T00:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 55 s
Description: Impara la sintesi di cDNA e l'amplificazione di RNA virale da cellule HeLa infettate con vaccinia virus. Questo protocollo dettagliato permette di analizzare l'espressione genica dell'ospite e del virus mediante microarray.

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Whitehead Institute Fellows Fondi

Parte 1: sintesi di cDNA da RNA <ol><li> Prima di utilizzare il Amino Ambion allile MessageAmp II kit, aggiungere il volume consigliato del 100% di etanolo al tamponi di lavaggio. </li><li> In tubo di reazione PCR, aggiungere tra 5μg a 100 ng di RNA totale e 1ml di T7 oligo (dT) primer. Portare il volume fino a 12μl con acqua priva di nucleasi. </li><li> Incubare i campioni a 70 ° C per 10 minuti in un termociclatore. </li><li> Rimuovere campioni di RNA da 70 ° C e centrifugare brevemente. Mettere in ghiaccio. </li><li> Preparare lo Strand 1 ° mix di sintesi master e tenere a temperatura ambiente (con il 10% carico eccessivo per il pipettaggio errore). (Tabella 1) </li><li> Delicatamente Master Mix pipetta o sfiorare per mescolare, quindi si centrifuga brevemente. </li><li> Trasferimento 8μl del Master Mix per ogni campione di RNA. Mescolare pipettando su e giù per 3-4 volte. </li><li> Incubare a 42 ° C per 2 ore in termociclatore. </li><li> Centrifugare i campioni brevemente e posto sul ghiaccio. Procedere immediatamente alla fase successiva della sintesi dsDNA. </li><li> Preparare il Settore 2 ° mix di sintesi master sul ghiaccio (con il 10% carico eccessivo per il pipettaggio errore). (Tabella 2) </li><li> Delicatamente Master Mix pipetta o sfiorare per mescolare, quindi si centrifuga brevemente. </li><li> Trasferire 80μl di ciascun campione e mescolare delicatamente pipettando su e giù per 3-4 volte. </li><li> Incubare a 16 ° C per 2 ore in termociclatore. </li><li> Dopo l&#39;incubazione 2 ore, procedere con il cDNA clean-up o step congelare immediatamente a -20 ° C. </li></ol> Parte 2: doppia elica del DNA di pulizia <ol><li> Rimuovere il puro cDNA dal frigorifero e lasciarlo equilibrare a temperatura ambiente per 30 minuti prima dell&#39;uso. Agitare il flacone per sospendere di nuovo pienamente le sfere magnetiche cDNA vincolante prima dell&#39;uso. </li><li> Aliquota nucleasi senza acqua in un tubo di 1,5 ml ed incubare a 50-60 ° C per almeno 10 minuti durante l&#39;incubazione precedente 2 ore. </li><li> Aggiungere 180μl di Pure cDNA per ogni campione, e mescolare bene pipettando su e giù. Trasferire i campioni ad un 96-ben a fondo rotondo piatto. </li><li> Continuare a mescolare i campioni scuotendo leggermente il piatto su un agitatore orbitale per almeno 2 minuti. </li><li> Spostare la piastra ad un supporto magnetico per catturare le sfere magnetiche. Lascia piastra sul supporto per circa 6 minuti, o fino a quando il composto diventa trasparente e le palline sono vincolanti pellet. </li><li> Con attenzione aspirare il surnatante con un aspiratore a vuoto senza disturbare il sfere magnetiche. In alternativa, rimuovere con attenzione il surnatante con una pipetta e scartare il surnatante. </li><li> Togliere la placca dal supporto magnetico. </li><li> Aggiungere 150μl cDNA tampone di lavaggio in ogni bene e agitare la piastra per 1 minuto l&#39;agitatore orbitale a velocità moderata. Perline NON si disperderà in questa fase, a causa della bassa tensione superficiale del tampone di lavaggio. </li><li> Spostare la piastra ad un supporto magnetico per catturare le sfere magnetiche. </li><li> Con attenzione aspirare il surnatante con un aspiratore a vuoto senza disturbare il sfere magnetiche. In alternativa, rimuovere con attenzione il surnatante con una pipetta e scartare il surnatante. </li><li> Togliere la placca dal supporto magnetico. </li><li> Ripetere il lavaggio per volta 2 ° con 150μl tampone di lavaggio cDNA. </li><li> Dopo il 2 ° lavare, asciugare le perle agitando la piastra per 2 minuti in agitatore orbitale alla massima velocità. Non asciugare eccessivamente! </li><li> Eluire il cDNA dalla perle aggiungendo 18μl del preriscaldato nucleasi acqua priva di ogni campione. </li><li> Agitare vigorosamente la piastra per 3 minuti mediante l&#39;agitatore orbitale, quindi controllare per assicurarsi che le sfere magnetiche sono completamente disperse. In caso contrario, continuare a tremare. </li><li> Una volta che il sfere magnetiche sono completamente dispersi, spostare la piastra ad un supporto magnetico per catturare le sfere magnetiche. </li><li> Trasferire accuratamente l&#39;cDNA eluiti (~ 16μl) ad una nuova piastra PCR (PCR o tubi). </li><li> Procedere direttamente alla fase successiva, o congelare il cDNA a -20 ° C. </li></ol> Parte 3: Trascrizione in vitro (IVT) <ol><li> Preparare la master mix IVT a temperatura ambiente. (Tabella 3) </li><li> Delicatamente pipetta Master Mix o sfiorare per miscelare e centrifugare brevemente. </li><li> Aggiungere 24μl di ciascun campione e mescolare delicatamente pipettando su e giù per 3-4 volte. </li><li> Incubare a 37 ° C per 14 ore in un termociclatore, quindi tenere a 4 ° C fino al momento per il passo successivo. </li></ol> Parte 4: ARNA pulizia dopo IVT <ol><li> Vortex le perline RNA vincolante per breve tempo ad ottenere un impasto omogeneo prima dell&#39;uso. </li><li> Preparare il Mix Binding ARNA a temperatura ambiente (Tabella 4) Questo può essere fatto prima del tempo -. Mix preparato vincolante può essere conservato a temperatura ambiente per un massimo di una settimana. </li><li> Mescolare bene nel vortex. </li><li> Aliquota del buffer di eluizione ARNA in un tubo di 1,5 ml ed incubare a 50-60 ° C per almeno 10 minuti. </li><li> Aggiungere 70μl della miscela ARNA vincolantead ogni campione e mescolare bene pipettando su e giù per 3-4 volte. </li><li> Trasferimento dei campioni dalla piastra PCR ad un 96-ben a fondo rotondo piatto. </li><li> Aggiungere 50μl del 100% di isopropanolo a ciascun campione e mescolare bene pipettando su e giù per 3-4 volte. </li><li> Agitare delicatamente la piastra su un agitatore orbitale per almeno 2 minuti per mescolare completamente i campioni. </li><li> Spostare la piastra ad un supporto magnetico per catturare le sfere magnetiche. Lascia la piastra sul supporto fino a quando il composto diventa trasparente e le palline sono vincolanti pellet. </li><li> Con attenzione aspirare il surnatante con un aspiratore a vuoto senza disturbare il sfere magnetiche. In alternativa, rimuovere con attenzione il surnatante con una pipetta e scartare il surnatante. </li><li> Togliere la placca dal supporto magnetico. </li><li> Aggiungere 100μl soluzione di lavaggio ARNA in ogni pozzetto e agitare la piastra per 1 minuto l&#39;agitatore orbitale a velocità moderata. Perline potrebbero non disperdere in questa fase. </li><li> Spostare la piastra ad un supporto magnetico per catturare le sfere magnetiche. </li><li> Con attenzione aspirare il surnatante con un aspiratore a vuoto senza disturbare il sfere magnetiche. In alternativa, rimuovere con attenzione il surnatante con una pipetta e scartare il surnatante. </li><li> Togliere la placca dal supporto magnetico. </li><li> Ripetere il lavaggio per volta 2 ° con la soluzione di 100μl Wash ARNA. </li><li> Dopo il 2 ° lavare, asciugare le perle agitando la piastra per 1 minuto l&#39;agitatore orbitale alla massima velocità. Non asciugare eccessivamente i campioni! </li><li> Eluire la ARNA dalle perle con l&#39;aggiunta di 40μl preriscaldato Elution Buffer ARNA per ogni campione. </li><li> Agitare vigorosamente la piastra l&#39;agitatore orbitale per 3 minuti, quindi controllare per assicurarsi che le sfere magnetiche sono completamente disperse. In caso contrario, continuare a tremare. </li><li> Una volta che il sfere magnetiche sono completamente dispersi, spostare la piastra ad un supporto magnetico per catturare le sfere magnetiche. Il supernatante contiene la ARNA ripulito amino-allil incorporato. </li><li> Trasferire accuratamente l&#39;ARNA eluiti ad una nuova piastra PCR (PCR o tubi). </li><li> (Passo opzionale) Controllare la concentrazione di RNA dei campioni misurando 1.5μl su uno spettrofotometro NanoDrop. </li><li> Immediatamente continuare al passaggio successivo, o lasciare il ARNA a -80 ° C. </li></ol> Tabella 1: Mix Strand cDNA 1 ° master di sintesi <table border="1" cellpadding="8"><tbody><tr><td> Reagente </td><td> Importo per 1 reazione </td></tr><tr><td> 10X Buffer Strand Primo </td><td> 2 microlitri </td></tr><tr><td> dNTP Mix </td><td> 4 microlitri </td></tr><tr><td> Inibitore di ribonucleasi </td><td> 1 ml </td></tr><tr><td> Array Script </td><td> 1 ml </td></tr></tbody></table> Tabella 2: Strand cDNA 2 ° Mix sintesi Maestro <table border="1" cellpadding="8"><tbody><tr><td> Reagente </td><td> Importo per 1 reazione </td></tr><tr><td> Acqua priva di nucleasi </td><td> 63 microlitri </td></tr><tr><td> 10X Buffer secondo filone </td><td> 10 microlitri </td></tr><tr><td> dNTP Mix </td><td> 4 microlitri </td></tr><tr><td> DNA polimerasi </td><td> 2 microlitri </td></tr><tr><td> RNasi H </td><td> 1 ml </td></tr></tbody></table> Tabella 3: IVT Master Mix <table border="1" cellpadding="8"><tbody><tr><td> Reagente </td><td> Importo per 1 reazione </td></tr><tr><td> aaUTP soluzione (75 mm) </td><td> 2 microlitri </td></tr><tr><td> ATP, CTP, GTP mix (25 mm) </td><td> 12 microlitri </td></tr><tr><td> T7 soluzione UTP (75 mm) </td><td> 2 microlitri </td></tr><tr><td> T7 tampone di reazione 10X </td><td> 4 microlitri </td></tr><tr><td> T7 Enzyme Mix </td><td> 4 microlitri </td></tr></tbody></table> Tabella 4: Mix ARNA Binding <table border="1" cellpadding="8"><tbody><tr><td> Reagente </td><td> Importo per 1 reazione </td></tr><tr><td> Perline RNA Binding * </td><td> 10 microlitri </td></tr><tr><td> Bead Resuspension * Soluzione </td><td> 4 microlitri </td></tr><tr><td> 100% isopropanolo ** </td><td> 6 microlitri </td></tr><tr><td> ARNA Concentrato Binding Buffer </td><td> 50 microlitri </td></tr></tbody></table> * Mescolare le perline RNA vincolante con la soluzione di risospensione primo tallone. ** Aggiungere l&#39;isopropanolo e mescolare bene prima di aggiungere il legame tampone concentrato ARNA.

<ol><li>Rubins, K. H., Hensley, L. E., Bell, G. W., Wang, C., Lefkowitz, E. J., Brown, P. O., Relman, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparative+analysis+of+viral+gene+expression+programs+during+poxvirus+infection%3A+a+transcriptional+map+of+the+vaccinia+and+monkeypox+genomes%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+ONE%22%5BJournal%5D)">Comparative analysis of viral gene expression programs during poxvirus infection: a transcriptional map of the vaccinia and monkeypox genomes.</a> PLoS ONE. 3 (7), e2628-e2628 (2008).</li>
<li>Assarsson, E., Greenbaum, J. A., Sundström, M., Schaffer, L., Hammond, J. A., Pasquetto, V., Oseroff, C., Hendrickson, R. C., Lefkowitz, E. J., Tscharke, D. C., Sidney, J., Grey, H. M., Head, S. R., Peters, B., Sette, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Kinetic+analysis+of+a+complete+poxvirus+transcriptome+reveals+an+immediate-early+class+of+genes%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci%22%5BJournal%5D)">Kinetic analysis of a complete poxvirus transcriptome reveals an immediate-early class of genes.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. 105 (6), 2140-2145 (2008).</li>
<li>Satheshkumar, P. S., Moss, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Poxvirus+transcriptome+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">Poxvirus transcriptome analysis.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 105, E62-E62 (2008).</li>
<li>Assarsson, E., Greenbaum, J. A., Sundström, M., Schaffer, L., Hammond, J. A., Pasquetto, V., Oseroff, C., Hendrickson, R. C., Lefkowitz, E. J., Tscharke, D. C., Sidney, J., Grey, H. M., Head, S. R., Peters, B., Sette, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A.+Reply+to+Satheshkumar+and+Moss%3A+Poxvirus+transcriptome+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">A. Reply to Satheshkumar and Moss: Poxvirus transcriptome analysis.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 105, E63-E64 (2008).</li>
<li>Guerra, S., López-Fernández, L. A., Pascual-Montano, A., Muñoz, M., Harshman, K., Esteban, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cellular+gene+expression+survey+of+vaccinia+virus+infection+of+human+HeLa+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J+Virol%22%5BJournal%5D)">Cellular gene expression survey of vaccinia virus infection of human HeLa cells.</a> J Virol. 77 (11), 6493-6506 (2003).</li>
<li>Guerra, S., López-Fernández, L. A., Conde, R., Pascual-Montano, A., Harshman, K., Esteban, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microarray+analysis+reveals+characteristic+changes+of+host+cell+gene+expression+in+response+to+attenuated+modified+vaccinia+virus+Ankara+infection+of+human+HeLa+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J+Virol%22%5BJournal%5D)">Microarray analysis reveals characteristic changes of host cell gene expression in response to attenuated modified vaccinia virus Ankara infection of human HeLa cells.</a> J Virol. 78 (11), 5820-5824 (2004).</li>
<li>Guerra, S., López-Fernández, L. A., Pascual-Montano, A., Nájera, J. L., Zaballos, A., Esteban, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Host+response+to+the+attenuated+poxvirus+vector+NYVAC%3A+upregulation+of+apoptotic+genes+and+NF-kappaB-responsive+genes+in+infected+HeLa+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J+Virol%22%5BJournal%5D)">Host response to the attenuated poxvirus vector NYVAC: upregulation of apoptotic genes and NF-kappaB-responsive genes in infected HeLa cells.</a> J Virol. 80 (2), 985-998 (2006).</li>
<li>Guerra, S., Nájera, J. L., González, J. M., López-Fernández, L. A., Climent, N., Gatell, J. M., Gallart, T., Esteban, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Distinct+gene+expression+profiling+after+infection+of+immature+human+monocyte-derived+dendritic+cells+by+the+attenuated+poxvirus+vectors+MVA+and+NYVAC%5BTitle%5D)+AND+%22%22%5BJournal%5D)">Distinct gene expression profiling after infection of immature human monocyte-derived dendritic cells by the attenuated poxvirus vectors MVA and NYVAC.</a> 81 (16), 8707-8721 (2007).</li>
</ol>

Gli autori non hanno nulla da dichiarare.

Passaggi critici Un secondo ciclo di amplificazione non è consigliato come pregiudizi nei dati di serie sono stati osservati. Mescolando con cura in ogni fase enzimatica (1 ° e 2 ° sintesi filamento cDNA, IVT) è fondamentale per ottenere buoni rendimenti amplificazione, così come di incubazione di ogni passo enzimatica a temperatura adeguata. Un cycler PCR con regolabile coperchio riscaldato si preferisce - deviazioni anche il più piccolo 2-3 gradi durante IVT in un forno...

<table><tbody><tr><td>Kit di amplificazione aRNA Amino Allyl MessageAmp II</td><td>Reagente</td><td>Applied Biosystems</td><td>AM1753</td><td>Per 20 reazioni</td></tr><tr><td>Kit di amplificazione aRNA Amino Allyl MessageAmp II</td><td>Reagente</td><td>Applied Biosystems</td><td>AM1821</td><td>Per 100 reazioni, in formato a 96 pozzetti</td></tr><tr><td>Spettrofotometro NanoDrop ND-1000 UV-VIS</td><td>Altro</td><td>NanoDrop</td><td>ND-1000</td><td>O spettrofotometro equivalente</td></tr></tbody></table>

vaccino infezione da virus e analisi temporale di espressione genica del virus: part 2

Vaccinia Virus Infection &amp; Temporal Analysis of Virus Gene Expression: Part 2

La famiglia<em&gt; Poxviridae</em&gt; È costituito da grandi DNA a doppia elica che contiene virus che si replicano esclusivamente nel citoplasma delle cellule infette. I membri del<em&gt; Orthopox</em&gt; Genere includono vaiolo, l&#39;agente eziologico del vaiolo umano, vaiolo delle scimmie, e vaccinico (VAC), il membro prototipo della famiglia di virus. All&#39;interno del relativamente grande (~ 200 kb) vaccinia genoma, tre classi di geni sono codificati: precoce, intermedio e in ritardo. Anche se tutte e tre le classi sono trascritte dai virale codifica RNA polimerasi, ogni classe svolge una funzione diversa nel ciclo di vita del virus. Poxvirus utilizzano strategie multiple di modulare l&#39;ambiente host cellulare durante l&#39;infezione. Per capire regolamentazione sia di accoglienza e di espressione genica del virus, abbiamo utilizzato tutto il genoma approcci per analizzare abbondanza trascrizione sia da virus e cellule ospiti. In questo studio dimostriamo infezioni corso a tempo di cellule HeLa con il virus vaccinico e RNA di campionamento in diversi momenti dopo l&#39;infezione. Sia host e virale RNA totale è isolato e amplificato per l&#39;ibridazione di microarray per l&#39;analisi dell&#39;espressione genica.

Protocollo per vaccinia infezione di cellule HeLa e analisi di accoglienza e l&#39;espressione genica virale. Parte 2 di 3.

Vaccino infezione da virus e analisi temporale di espressione genica del virus: Part 2

La famiglia Poxviridae è composta da virus contenenti grandi DNA a doppio filamento che si replicano esclusivamente nel citoplasma delle cellule infette. I membri di...

Ciao, sono Judy Yen del laboratorio di Kate Rubins presso l'Istituto Whitehead per la Ricerca Biomedica. Dopo aver infettato cellule HeLa con il virus vaccinia e isolato l'RNA totale, come mostrato in un precedente protocollo video di JoVE, l'RNA virale può essere isolato e amplificato mediante trascrizione inversa e trascrizione in vitro; l'RNA amplificato verrà successivamente utilizzato nell'analisi mediante microarray dell'espressione genica virale e dell'ospite. Cominciamo dunque.Per iniziare questa sintesi di cDNA a partire dall'RNA, aggiungere il volume raccomandato di etanolo al cento per cento ai buffer di lavaggio prima di utilizzare il kit ambient amino allele message AMP two in una provetta per reazione PCR; aggiungere da 100 nanogrammi a cinque microgrammi di RNA totale e un microlitro di primer oligo T7. Portare il volume a 12 microlitri con acqua priva di nucleasi. Incubare i campioni a 70 gradi Celsius per 10 minuti in un termociclatore.Successivamente, rimuovere i campioni di RNA da 70 gradi Celsius nella centrifuga. Dopo una breve centrifugazione, posizionare i campioni sul ghiaccio. Preparare il mix master per la sintesi del primo filamento con un eccesso volumetrico del 10% per compensare eventuali errori di pipettaggio.Lasciare a temperatura ambiente, pipettare delicatamente il master mix o agitare leggermente per mescolare, quindi centrifugare brevemente. Dopo la centrifugazione, trasferire otto microlitri del master mix in ogni campione di RNA, mescolando mediante pipettaggio su e giù per tre o quattro volte, e incubare a 42 gradi Celsius per due ore nel termociclatore. Al termine dell'incubazione, centrifugare brevemente i campioni e porli subito sul ghiaccio. Procedere immediatamente al passaggio successivo della sintesi di DS dsd A.Preparare la miscela maestra per la sintesi del secondo filamento in ghiaccio, aggiungendo un eccesso del 10% in volume per compensare eventuali errori di pipettaggio; pipettare delicatamente la miscela maestra o agitare brevemente il tubo, quindi centrifugare brevemente. Trasferire 80 microlitri in ogni campione e mescolare delicatamente aspirando e dispensando da tre a quattro volte. Incubare a 16 gradi Celsius per due ore nel termociclatore.Dopo l'incubazione di due ore, procedere con il passaggio di purificazione del cDNA o congelare immediatamente a meno 20 gradi Celsius. Per iniziare la purificazione del cDNA a doppio filamento, rimuovere il cDNA purificato dal refrigeratore e lasciarlo equilibrare alla temperatura ambiente per 30 minuti prima dell'uso; agitare il flacone per ri-sospendere completamente le perle magnetiche di legame del cDNA prima dell'uso. Aliquotare acqua priva di nucleasi in un tubo da 1,5 millilitri e incubare a 50-60 gradi Celsius per almeno 10 minuti.Durante l'incubazione precedente di due ore, aggiungere 180 microlitri di CD NA pure a ciascun campione e mescolare accuratamente mediante pipettaggio su e giù. Trasferire i campioni in una piastra da 96 pozzetti con fondo rotondo. Dopo aver trasferito i campioni nella piastra, continuare a mescolarli agitando delicatamente la piastra su un agitatore orbitale per almeno due minuti.Spostare la piastra su un supporto magnetico per catturare le perle magnetiche. Lasciare la piastra sul supporto per circa sei minuti o fino a quando la miscela diventa trasparente e le perle di legame si sono sedimentate. Aspirare con attenzione il soprannatante utilizzando un aspiratore a vuoto, senza disturbare le perle magnetiche.In alternativa, rimuovere con attenzione il soprannatante utilizzando una pipetta e scartare il soprannatante. Dopo aver scartato il soprannatante, rimuovere la piastra dal magnete. Aggiungere quindi 150 microlitri di buffer di lavaggio del cDNA in ciascun pozzetto e agitare la piastra per un minuto sullo shaker orbitale a velocità moderata.Le perle non si disperderanno in questo passaggio a causa della bassa tensione superficiale del buffer di lavaggio. Dopo l'agitazione, riposizionare la piastra su un supporto magnetico. Per catturare le perle magnetiche, aspirare con attenzione il sopranatante mediante un aspiratore a vuoto senza disturbare le perle magnetiche.O rimuovere con attenzione il soprannatante utilizzando una pipetta e scartare il soprannatante. Rimuovere la piastra dal supporto magnetico. Ripetere il lavaggio una seconda volta con 150 microlitri di tampone di lavaggio per cDNA.Dopo il secondo lavaggio, asciugare le perle agitando la piastra per due minuti sullo shaker orbitale alla velocità massima. È importante non far asciugare eccessivamente le perle. Successivamente, eluire il cDNA dalle perle aggiungendo vigorosamente 18 microlitri di acqua priva di nucleasi preriscaldata a ciascun campione.Agitare la piastra per tre minuti sullo shaker orbitale. Quindi verificare che le perle magnetiche siano completamente disperse. In caso contrario, continuare ad agitare.Una volta che le perle magnetiche sono completamente disperse, spostare la piastra su un supporto magnetico. Per catturare le perle magnetiche, trasferire con attenzione il cd NA eluito in una nuova piastra PCR o in provette PCR. Si dovrebbero recuperare circa 16 microlitri di eluato per campione.Procedere direttamente al passaggio successivo oppure congelare il cd NA a meno 20 gradi Celsius. Preparare la miscela maestra IVT a temperatura ambiente. Pipettare delicatamente la miscela maestra o agitare leggermente per mescolare e centrifugare brevemente.Dopo la centrifugazione, aggiungere 24 microlitri a ogni campione e mescolare delicatamente aspirando e dispensando da tre a quattro volte, quindi incubare a 37 gradi Celsius per 14 ore in un termociclatore. Successivamente, mantenere a 4 gradi Celsius fino al momento dell'utilizzo. Vortexare brevemente le perle per il legame dell'RNA per ottenere una sospensione omogenea prima dell'uso. Preparare il mix di legame dell'RNA A a temperatura ambiente.Questa operazione può essere eseguita in anticipo. La miscela di legame preparata può essere conservata a temperatura ambiente per un massimo di una settimana. Mescolare accuratamente per vortex e aliquotare il tampone di eluizione dell'RNA A in una provetta da 1,5 millilitri, quindi incubare a 50-60 gradi Celsius per almeno 10 minuti.Ora, aggiungere 70 microlitri della miscela di legame A RNA a ciascun campione e mescolare accuratamente aspirando e dispensando da tre a quattro volte. Trasferire i campioni dalla piastra PCR a una piastra rotonda a 96 pozzetti. Successivamente, aggiungere 50 microlitri di isopropanolo al cento per cento a ciascun campione e mescolare accuratamente aspirando e dispensando da tre a quattro volte.Agitare delicatamente la piastra su un agitatore orbitale per almeno due minuti. Per miscelare completamente i campioni, spostare la piastra su un supporto magnetico al fine di catturare le perle magnetiche.Lasciare la piastra sul supporto fino a quando la miscela diventa trasparente e le perle di legame si sono sedimentate. Dopo la sedimentazione delle perle, aspirare con attenzione il soprannatante utilizzando l'aspiratore a vuoto senza disturbare le perle magnetiche. In alternativa, rimuovere con attenzione il soprannatante con una pipetta e scartare il soprannatante.Rimuovere la piastra dal supporto magnetico. Successivamente, aggiungere 100 microlitri di soluzione di lavaggio per RNA in ogni pozzetto e agitare la piastra per un minuto sullo shaker orbitale a velocità moderata; in questa fase, le perle non devono disperdersi completamente. A questo passaggio, spostare la piastra su un supporto magnetico.Per catturare le perle magnetiche. Aspirare attentamente il soprannatante con un aspiratore a vuoto senza disturbare le perle magnetiche. In alternativa, rimuovere con attenzione il soprannatante mediante pipetta e scartare il soprannatante.Dopo aver rimosso il soprannatante, rimuovere la piastra dal supporto magnetico. Ripetere il lavaggio una seconda volta con 100 microlitri di soluzione di lavaggio per RNA. Dopo il secondo lavaggio, asciugare le perle agitando la piastra per un minuto sullo shaker orbitale alla velocità massima.Ricordarsi di non asciugare eccessivamente i campioni. Eluire l'RNA A dalle perle aggiungendo 40 microlitri del tampone di eluizione per l'RNA A preriscaldato a ciascun campione. Agitare vigorosamente la piastra sullo shaker orbitale per tre minuti. Successivamente, verificare che le perle magnetiche siano completamente disperse.Se non lo sono, continuare ad agitare. Una volta che le perle magnetiche si sono completamente disperse, spostare la piastra su un supporto magnetico per catturare le perle magnetiche. Il sopranatante contiene l'allele amino purificato, incorporato con un RNA.Trasferire con attenzione l'RNA eluito in una nuova piastra PCR o in provette PCR. A questo punto, è possibile verificare la concentrazione di RNA dei campioni misurando 1,5 microlitri con uno spettrofotometro NanoDrop. Procedere immediatamente con il passaggio successivo oppure conservare l'RNA a -80 gradi Celsius.Abbiamo appena mostrato come etichettare con fluorescenza campioni di RNA contenenti alleli immunitari amplificati per l'ibridazione su micromatrici. Quando si esegue questa procedura, è importante ricordare che un secondo ciclo di amplificazione non è consigliato. Poiché sono stati osservati bias e anomalie nei dati dell'array, è inoltre fondamentale ricordare di mescolare accuratamente a ogni passaggio enzimatico, sia per il primo che per il secondo filamento.La sintesi del cDNA, o il passaggio di IVT, è fondamentale per ottenere rese elevate di amplificazione, così come lo è l'incubazione di ciascun passaggio enzimatico alla temperatura appropriata. È preferibile utilizzare un termociclatore PCR con coperchio riscaldato regolabile, poiché anche piccole deviazioni di due o tre gradi durante la trascrizione in vitro in un fornetto ad aria o in un bagnomaria possono influenzare in modo significativo la resa del prodotto amplificato.Ecco fatto. Grazie per averci seguito e buona fortuna con i vostri esperimenti. Assicuratevi di guardare gli altri video di questa serie in cui mostriamo come eseguire un'infezione in corso di tempo con il virus vaccinia, l'estrazione dell'RNA dai campioni e la preparazione e purificazione dell'RNA marcato con fluorocromo.

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Virus oncolitici sono promettenti per la terapia del cancro. La possibilità di accertare la infectability di campioni di tessuto ottenuti da pazienti dal vivo prima del trattamento è un vantaggio unico di questo approccio terapeutico. Questo protocollo descrive come processo di tessuti...

Ex infezione Vivo del tessuto Live con virus oncolitici

Descriviamo un protocollo per identificare i ruoli chiave di molecole di segnalazione di accoglienza nella replicazione litica di un herpesvirus modello, gamma herpesvirus 68 (γHV68). Utilizzando ceppi di topi geneticamente modificati e fibroblasti embrionali per γHV68 replica litico, il protocollo consente sia la caratterizzazione fenotipica e molecolare del virus interrogatorio interazioni ospite-in replicazione virale litico.

Dissezione Host-virus Interazione in replica litico di un Herpesvirus modello

Un metodo di tracciare neuroni sinapticamente collegate è descritto. Usiamo specificità TVA di una cella a monte per sondare se una popolazione di cellule riceve input sinaptico da tipi di cellule geneticamente definiti.

Viral Tracciamento di geneticamente definito circuiti neurali

Qui viene descritto un protocollo rapido e modulare per la generazione di virus vaccinia ricombinanti che esprimono simultaneamente proteine contrassegnate fluorescentmente utilizzando il metodo della selezione dominante transitoria.

Metodologia per la generazione efficiente di proteine del virus vaccinia taggate fluorescentmente

Descriviamo l'utilizzo di un virus vaccinia reporter fluorescente che consente la misurazione in tempo reale di infettività virale e l'espressione genica attraverso l'espressione specifica fase di fluorofori giornalista spettralmente distinti. Abbiamo dettaglio un metodo basato piastra per identificare con precisione la fase in cui la replicazione del virus è influenzato in risposta ad inibizione piccola molecola.

Vaccinia Reporter virus per quantificare Funzione virale in tutte le fasi di espressione genica

Qui, presentiamo i protocolli per identificare gli immunomodulatori 1) virus-messo che promuovono la replica da arbovirus e fattori ospite 2) eucariotica che limitano la replica da arbovirus. Questi metodi basati su fluorescenza e luminescenza permettono ai ricercatori di ottenere rapidamente letture quantitative della replica da arbovirus nelle analisi semplicistiche con bassi rapporti segnale-rumore.

Infezioni da arbovirus come strumenti di Screening per l'identificazione di fattori virali immunomodulatori e Host antivirale

ICP0 subisce la traslocazione nucleare--citoplasmico durante l'infezione HSV-1. Non è noto il meccanismo molecolare di questo evento. Qui descriviamo l'uso del microscopio confocale come uno strumento per quantificare ICP0 movimento nell'infezione di HSV-1, che getta le basi per analizzare quantitativamente ICP0 traslocazione in futuri studi meccanicistici.

Analisi temporale della traslocazione nucleare--citoplasmico di Herpes Simplex Virus 1 proteina mediante microscopia confocale immunofluorescente

Impara la sintesi di cDNA e l'amplificazione di RNA virale da cellule HeLa infettate con vaccinia virus. Questo protocollo dettagliato permette di analizzare l'espressione genica dell'ospite e del virus mediante microarray.

Vaccino infezione da virus e analisi temporale di espressione genica del virus: Part 2

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