Name: Misurare esocitosi nei neuroni Utilizzando Etichettatura FM (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2006-11-30T00:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 56 s
Description: Impara a misurare l'esocitosi nei neuroni ippocampali utilizzando la marcatura con il colorante FM 4-64 e l'imaging in tempo reale. Questo metodo permette di studiare la cinetica del rilascio delle vescicole sinaptiche.

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Celle: Rat (o il mouse) colture primarie di neuroni dell&#39;ippocampo (14-28 giorni in vitro). Stimolazione: elettrica, consegnato tramite due elettrodi di platino; 70-90 mV Microscopia: lente olio 60x su un microscopio invertito a fluorescenza CCD. Software: Slidebook (Intelligent Imaging Innovations, Santa Monica, CA) Vedi supplementare pagina metodi per ulteriori dettagli <ol><li> Caldo HEPES soluzione salina tamponata (SPA) a temperatura ambiente. Aggiungere il glutammato antagonisti dei recettori APV (50 microM concentrazione finale) e CNQX (10 mM finale). Ogni esperimento FM di solito richiede 20-30 ml HBS. Per lavorare concentrazione di 10 mM FM 4-64 (Molecular Probes), soluzione madre diluita 1:1000 in HBS (con gli antagonisti aggiunto). Fai 2 ml FM soln per ciascun esperimento. Coprire con un foglio di soluzione per evitare l&#39;esposizione alla luce. </li><li> Montate il coprioggetti contenente i neuroni sulla camera di elettrodi. Controllare che i media in camera è di livello con la parte superiore della camera e copre completamente gli elettrodi. Rimuovere qualsiasi soluzione in eccesso dalla parte inferiore del coprioggetto. Aggiungere l&#39;olio alla lente (se si utilizza una lente d&#39;olio). </li><li> Sistemare il dispositivo di perfusione. Prima sciacquare con pochi ml di ognuno di noi seguiva la nell&#39;ordine dato (lasciamo che ognuno di flusso a fondo prima di aggiungere il successivo): acqua, etanolo, acqua, poi HBS. Ora aggiungete il HBS (salvo pochi millilitri di aggiungere a mano nelle fasi successive) e chiudere la perfusione. Impostare la presa di perfusione e l&#39;aspirazione sui lati opposti ai bordi del coprioggetto. E &#39;meglio se la presa di perfusione raggiunge nella camera, dove, come l&#39;aspirazione deve rimanere in cima. Mentre l&#39;aggiunta di HBS (sia per perfusione oa mano), aprire l&#39;aspirazione e regolarne la posizione in modo che mantenga la media a destra livello appena a coprire interamente gli elettrodi. </li><li> Cercare l&#39;area sul vetrino che si desidera immagine e cercare di portare o meno a fuoco. Aree ottimali contengono molte sinapsi, ma non dovrebbe essere così densa in modo tale che i singoli processi diventano indistinguibili. Non ci dovrebbero essere-per-minimal corpi cellulari, membrane estranei (come ad esempio macchie di astrociti), o altri materiali non specifici (come ad esempio lint). Il colorante non specifico FM può aderire a questi. </li><li> Utilizzare il cubo filtro &quot;WG&quot; (che eccita con la luce verde e raccoglie le emissioni rosso rosso-to-lontano). Impostare SlideView &quot;preferenze di cattura&quot; per fornire 900 AP a 10Hz su insorgenza di immagine 0 (di solito 300-900 AP sono utilizzati per questo stimolo carico). Nella finestra immagine, selezionare l&#39;opzione &quot;fluo-vis-rosso&quot; impostazioni del filtro e cambiare il tempo di esposizione di 100 ms. Disattivare qualsiasi pre-esistente impostazioni timelapse. Non prendere le immagini fino a quando si è pronti per iniziare la stimolazione. </li><li> Assicurarsi che l&#39;aspirazione è su / aperto. Aggiungere rapidamente le soln FM (2 ml) alla camera dalla parte opposta della aspirazione. Premere immediatamente ok nella finestra dell&#39;immagine per scattare una foto e iniziare la stimolazione. Attendere 30-45 secondi dopo la stimolazione e poi rapidamente lavare FM con l&#39;aggiunta di ~ 2 ml di HBS (lo faccio a mano con una pipetta, ma questo può essere fatto anche da perfusione). </li><li> Lavare la FM con HBS tramite perfusione per ~ 10 minuti. La portata dovrebbe essere 1-1,5 ml / min. Durante questa fase di lavaggio, cambiare le preferenze di stimolazione in modo che l&#39;inizio della stimolazione inizia immagine @ 10 (di solito 900-1200 AP @ 10 Hz sono usati per questo stimolo decolorazione). Circa 7 min nel lavare, controllare le preferenze (insorgenza di stimolo a immagine 10). Ora, utilizzando la finestra piccola attenzione scegliere e mettere a fuoco una sottoarea. Assicurarsi che le impostazioni di stimolazione sono stati cambiati prima di procedere alla fase successiva. Prendete una singola immagine per vedere se il lavaggio è completo (singole sinapsi devono essere chiaramente punctated). In caso contrario, aumentare la portata 0.5mL/min uno aggiuntivo, e attendere altri 2 minuti. </li><li> Una volta lavaggio è completo, regolare il tempo di esposizione necessario per ricevere ancora una buona, chiaro segnale (di solito tra 50-100 ms. Tempi di esposizione dovrebbe essere ridotto al minimo a causa di photobleaching rapido della FM). Quindi impostare le preferenze Timelapse prendere 38 immagini ogni 5 secondi. Controllare la perfusione di fare c&#39;è abbastanza HBS per altri 5 minuti, e lasciare scorrere la perfusione. Inizio timelapse per iniziare decolorazione. </li><li> Dopo Decolorare, modificare le impostazioni stimolo per fornire 1200 AP @ 10Hz (solitamente 1200-2000 AP è utilizzata in questa fase finale) su immagine 0. Disattivare le impostazioni timelapse e prendere una singola immagine per iniziare la stimolazione. La perfusione deve essere ancora scorre Questo passo consentirà di eliminare eventuali rimanenti colorante vescicolare FM, per determinare baseline / &quot;totale rilasciabili&quot; fluorescenza. Dopo lo stimolo è terminato, disattivare le impostazioni stimolazione, portare la regione a fuoco. Chiudere la perfusione e di aspirazione, E poi prendere due immagini di riferimento finale. Sia immagini singole o Z-stack immagini (0,5 punti micron) possono essere prese. Z-stack sono utili nel caso ci fosse un cambiamento nel piano di messa a fuoco durante l&#39;esperimento. </li><li> L&#39;esperimento FM è fatto. Se immediatamente fare di più esperimenti, l&#39;obiettivo e la camera dovrebbe essere puliti ogni prova, ma l&#39;apparato perfusione non devono essere puliti fino a dopo l&#39;esperimento finale. Sciacquare l&#39;apparato completamente con acqua, poi l&#39;etanolo. </li></ol>

<ol><li>Betz, W. J., Bewick, G. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optical+analysis+of+synaptic+vesicle+recycling+at+the+frog+neuromuscular+junction%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Optical analysis of synaptic vesicle recycling at the frog neuromuscular junction.</a> Science. 255, 200-203 (1992).</li>
</ol>

Gli autori non hanno nulla da dichiarare.

Di 300 potenziali d&#39;azione (AP) è sufficiente per indurre almeno un giro di riciclaggio delle vescicole, uno stimolo di carico di 300 o più punti di accesso è spesso dato per etichettare il riciclo del pool di vescicole. Anche se gli stimoli di carico più intenso, come 900 punti di accesso, può consentire a un numero nominale di vescicole aggiuntivi da etichettare, questo aumenta anche la quantità di tempo che il colorante possibile incorporare nelle membrane extracellulare, portando ad una maggiore colorazione aspecifica. Ho trovato la...

<table><tbody><tr><td>APV</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A5282</td><td></td></tr><tr><td>FM 4-64</td><td>Molecular Probes, Life Technologies</td><td>T-3166</td><td></td></tr><tr><td>sale disodico di CNQX</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C-239</td><td></td></tr></tbody></table>

misurare esocitosi nei neuroni utilizzando etichettatura fm

Measuring Exocytosis in Neurons Using FM Labeling

La capacità di misurare la cinetica di rilascio delle vescicole può contribuire a fornire indicazioni in alcuni dei principi fondamentali della neurotrasmissione. Qui abbiamo usato imaging in tempo reale delle vescicole marcato con FM colorante per monitorare la velocità di rilascio delle vescicole presinaptiche. FM4-64 è un colorante rosso fluorescente anfifilici styryl che incorpora nelle membrane delle vescicole sinaptiche come endocitosi è stimolata. Interazioni lipofile causa del colorante per aumentare notevolmente in fluorescenza, così che emette un segnale luminoso quando associata a vescicole e una nominale quando nel liquido extracellulare. Dopo una fase di lavaggio viene usato per aiutare a rimuovere colorante esterno all&#39;interno della membrana plasmatica, il restante FM è concentrata all&#39;interno del vescicole e poi viene espulso quando esocitosi è indotta da un altro ciclo di stimolazione elettrica. Il tasso di rilascio delle vescicole è misurata dalla conseguente diminuzione della fluorescenza. Dal FM tintura può essere applicata esterni e transitoriamente, è uno strumento utile per determinare i tassi di esocitosi nelle culture neuronali, specialmente quando si confrontano i tassi tra le sinapsi transfettate e boutons controllo limitrofe.

La capacità di misurare la cinetica di rilascio delle vescicole può contribuire a fornire indicazioni in alcuni dei principi fondamentali della neurotrasmissione. Qui abbiamo usato imaging in tempo reale delle vescicole etichettati con il colorante rosso fluorescente FM 4-64 per misurare la velocità di rilascio delle vescicole presinaptiche in culture neuronali dell&#39;ippocampo.

Misurare esocitosi nei neuroni Utilizzando Etichettatura FM

La capacità di misurare la cinetica del rilascio di vescicole può aiutare a fornire informazioni su alcuni degli aspetti fondamentali della neurotrasmissione. In questo studio abbiamo utilizzato il monitoraggio in tempo reale...

Sono Jimmy Lynn. Sono uno studente laureato nel programma di Biologia Molecolare e Cellulare di Harvard. Attualmente lavoro nel Murphy Lab e nel laboratorio lavoriamo con Neuro dell'ippocampo.E ora vi mostrerò come eseguire esperimenti con FM d. Ora procederemo a montare il vetrino coprioggetto che contiene i neuroni all'interno di questa camera appositamente realizzata. Il nostro microscopio è un CC invertito D e assicurarsi di asciugare accuratamente il fondo.Non collegare ancora gli elettrodi. No. Ora l'apparato di perfusione è predisposto. Lo posizionerò a un'estremità della camera.Utilizziamo argilla per fissare. I responsabili di HBS per ogni esperimento procederanno ad aggiungere tutto ciò. La fusione è impostata.Si desidera utilizzare dell'argilla per mantenere questo in posizione, immagino qualcosa del genere che contenga corpi cellulari, poiché le membrane dei corpi cellulari assorbiranno gran parte del colorante e si troveranno proprio nella sinapsi. Forse un'area adiacente come qui, dove solo questa zona avevo immediatamente e verso cui stiamo andando. E quindi il foto-sbiancamento iniziale derivante dalle prime 10 immagini.E poi ecco, sono Jamil Newton. Sono uno studen

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Un nuovo mezzo per misurare la neurotrasmissione otticamente con analoghi della dopamina fluorescenti.

Il rilascio di dopamina a singoli terminali presinaptici visualizzate con FFNs

Una tecnica dal vivo imaging di fluorescenza per quantificare la ricostituzione e la mobilitazione di specifiche vescicole sinaptiche (SV) piscine in terminazioni nervose centrale è descritto. Due tornate di SV riciclaggio sono monitorati nei terminali nervosi pur prevedendo un controllo interno.

Analisi quantitativa di Replenishment pool delle vescicole sinaptiche in colture di neuroni granuli cerebellari utilizzando coloranti FM

Trasporto retrogrado di colorante fluorescente etichetta una sotto-popolazione di neuroni basati su proiezione anatomica. Assoni con etichetta possono essere mirati...

Retrograda Etichettatura fluorescente Consente mirata extracellulare singola unità di registrazione da parte dei neuroni identificati<em&gt; In vivo</em

In questo video, le fibre nervose delle larve di Drosophila sono immerse in un colorante FM, che si lega ai lipidi della membrana cellulare. Il microelettrodo di aspirazione e gli impulsi elettrici stimolano il processo di endocitosi, incorporando il colorante FM nelle vescicole endocitiche di nuova formazione. Questo metodo, che visualizza le fasi presinaptiche della neurotrasmissione, è utile per studiare la funzione sinaptica e il rilascio di neurotrasmettitori.

Carico e scarico del colorante FM mediato da microelettrodi nelle cellule nervose delle larve di Drosophila

Descriviamo l'uso di coloranti stirilico FM per l'immagine riciclo delle vescicole sinaptiche nei terminali nervosi funzionali. Questo protocollo può essere applicato non solo evocata, ma anche spontanea e attività sinaptiche in miniatura. Il protocollo espande la varietà di eventi sinaptici che possono essere adeguatamente valutati.

Esame delle vescicole sinaptiche Riciclaggio Uso FM coloranti Durante evocati, spontaneo, e miniatura Attività Synaptic

Questo articolo fornisce un metodo per studiare la dinamica delle vescicole dei neurotrasmettitori nelle cellule di neuroblastoma, utilizzando un costrutto di sinaptobrevina2-pHluorin e la microscopia a fluorescenza a riflessione interna totale. Viene inoltre riportata la strategia sviluppata per l'elaborazione delle immagini e l'analisi dei dati.

TIRFM e GFP-sonde pH-sensibile per valutare Neurotransmitter Vesicle Dynamics in cellule SH-SY5Y neuroblastoma: cell imaging e analisi dei dati

Qui descriviamo una nuova preparazione per l'imaging di terminali sensoriali lanceolati vivi di terminazioni a palizzata che innervano i follicoli piliferi della pelle dell'orecchio di topo durante la colorazione e la decolorazione con coloranti di stirylpyridinio.

Il monitoraggio ottico di Living nervo terminale Etichettatura nel follicolo pilifero lanceolate Endings del<em&gt; Ex Vivo</em&gt; Mouse Ear pelle

Endocitosi delle vescicole sinaptiche sono rilevato da microscopia chiara di pHluorin fuso con proteine delle vescicole sinaptiche e da microscopia elettronica dell'assorbimento della vescicola.

Endocitosi delle vescicole sinaptiche in colture di neuroni ippocampali di misura

Il volume è un parametro importante per quanto riguarda le caratteristiche fisiologiche e patologiche delle cellule. Descriviamo un metodo di esclusione fluorescente che permette di pieno-campo misura di volume di un neurone in vitro con sub-micrometrica risoluzione assiale richiesto per l'analisi dei neuriti e strutture dinamiche implicite nella crescita neuronale.

Alta risoluzione Volume Imaging di neuroni nell'esclusione di uso di fluorescenza metodo e dedicato dispositivi microfluidici

Delle vescicole sinaptiche (SV) la bicicletta è il meccanismo di base della comunicazione intercellulare alle sinapsi neuronali. Rilascio e l'assorbimento della tintura di FM sono il mezzo primario di quantitativamente analizzante SV endo - ed esocitosi. Qui, mettiamo a confronto tutti i metodi di stimolazione per guidare FM1-43 ciclismo alla sinapsi Drosophila giunzione neuromuscolare (NMJ) modello.

Tintura di FM in bicicletta alla sinapsi: confronto tra alto potassio depolarizzazione, elettrica e stimolazione Channelrhodopsin

Impara a misurare l'esocitosi nei neuroni ippocampali utilizzando la marcatura con il colorante FM 4-64 e l'imaging in tempo reale. Questo metodo permette di studiare la cinetica del rilascio delle vescicole sinaptiche.

Misurare esocitosi nei neuroni Utilizzando Etichettatura FM

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