Misurare esocitosi nei neuroni Utilizzando Etichettatura FM
30 novembre 2006
La capacità di misurare la cinetica di rilascio delle vescicole può contribuire a fornire indicazioni in alcuni dei principi fondamentali della neurotrasmissione. Qui abbiamo usato imaging in tempo reale delle vescicole etichettati con il colorante rosso fluorescente FM 4-64 per misurare la velocità di rilascio delle vescicole presinaptiche in culture neuronali dell'ippocampo.
Sono Jimmy Lynn. Sono uno studente laureato nel programma di Biologia Molecolare e Cellulare di Harvard. Attualmente lavoro nel Murphy Lab e nel laboratorio lavoriamo con Neuro dell'ippocampo.
E ora vi mostrerò come eseguire esperimenti con FM d. Ora procederemo a montare il vetrino coprioggetto che contiene i neuroni all'interno di questa camera appositamente realizzata. Il nostro microscopio è un CC invertito D e assicurarsi di asciugare accuratamente il fondo.
Non collegare ancora gli elettrodi. No. Ora l'apparato di perfusione è predisposto. Lo posizionerò a un'estremità della camera.
Utilizziamo argilla per fissare. I responsabili di HBS per ogni esperimento procederanno ad aggiungere tutto ciò. La fusione è impostata.
Si desidera utilizzare dell'argilla per mantenere questo in posizione, immagino qualcosa del genere che contenga corpi cellulari, poiché le membrane dei corpi cellulari assorbiranno gran parte del colorante e si troveranno proprio nella sinapsi. Forse un'area adiacente come qui, dove solo questa zona avevo immediatamente e verso cui stiamo andando. E quindi il foto-sbiancamento iniziale derivante dalle prime 10 immagini.
E poi ecco, sono Jamil Newton. Sono uno studente laureato nel programma di biologia molecolare qui a Harvard. Attualmente lavoro in un laboratorio di neuroscienze con Vinky Murphy come mio responsabile scientifico.
E quello di cui voglio parlare oggi con voi è la realizzazione di esperimenti con FM. E qual è, qual è l'obiettivo del vostro esperimento? Il vantaggio offerto da FM è che si tratta di un colorante fluorescente che ci permette di seguire la cinetica dell'esocitosi.
E quindi, per prima cosa verifichiamo che il colorante venga assorbito nella sinapsi somministrando uno stimolo di caricamento. Successivamente, dopo un periodo di lavaggio, applichiamo uno stimolo di ritenzione durante il quale il colorante viene rilasciato dalle vescicole. State lavorando su un tipo specifico di neuroni?
E quindi, nel nostro laboratorio, utilizziamo questo metodo per i neuroni dell'ippocampo e lo impieghiamo su neuroni in coltura piuttosto che in lisati. Quali sono i possibili problemi di questo esperimento? Tra i problemi più comuni, vi è l'uso della stimolazione elettrica.
A volte in passato, per qualsiasi motivo, si sono verificati problemi nel far funzionare la stimolazione elettrica. So che altri laboratori utilizzano anche soluzioni ad alto contenuto di potassio. Pertanto, una soluzione ad alto contenuto di potassio può rappresentare una valida alternativa all'uso dello stimolo elettrico qualora sorgano problemi.
Inoltre, di solito, per qualsiasi motivo durante il passaggio di lavaggio, sembra che non si riesca a rimuovere in modo sufficiente la colorazione non specifica. Spesso ho riscontrato che semplicemente aumentando la velocità di flusso, passando ad esempio da mezzo ml a un ml e mezzo al minuto, e aumentando il tempo da circa cinque a dieci minuti, si ottengono risultati notevolmente migliori. Quali sono le possibili applicazioni di questo esperimento?
Che cosa si desidera effettivamente studiare? Bene, è possibile utilizzarlo per confrontare cellule di controllo con cellule che sono state modificate in qualche modo. Ad esempio, utilizzando diverse linee di topi, si può verificare se la cinetica del rilascio differisce in qualche modo oppure se l'aggiunta di un certo farmaco influisce effettivamente sulla citosi.
Grazie.
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Panoramica
Questo studio si concentra sulla misurazione della cinetica del rilascio delle vescicole per migliorare la comprensione della trasmissione neurochimica. Mediante imaging in tempo reale con il colorante FM 4-64, la ricerca analizza i tassi di rilascio delle vescicole presinaptiche in colture neuronali ippocampali.
Componenti Chiave dello Studio
Area della Scienza
- Neuroscienze
- Biologia cellulare
- Neurotrasmissione
Sfondo
- La trasmissione sinaptica è un processo fondamentale nella comunicazione neuronale.
- Il rilascio delle vescicole è essenziale per la trasmissione dei segnali tra i neuroni.
- Le tecniche di imaging in tempo reale possono fornire informazioni dettagliate sulla dinamica delle vescicole.
- FM 4-64 è un colorante fluorescente comunemente utilizzato per etichettare le vescicole.
Scopo dello studio
- Misurare la velocità di rilascio delle vescicole presinaptiche.
- Ottenere informazioni sui meccanismi della trasmissione neurochimica.
- Utilizzare l'immagine in tempo reale per osservare la dinamica delle vescicole.
Metodi Utilizzati
- Acquisizione in tempo reale di vescicole marcate con FM 4-64.
- Utilizzo di colture neuronali di ippocampo per gli esperimenti.
- Camera personalizzata per il montaggio di coprioggetti con neuroni.
- Configurazione del microscopio invertito per l'acquisizione delle immagini.
Risultati principali
- Misurazione riuscita dei tassi di rilascio delle vescicole presinaptiche.
- Informazioni sulle cinetiche della dinamica di rilascio delle vescicole.
- Dimostrazione dell'efficacia di FM 4-64 negli studi di imaging.
- Contributo alla comprensione dei processi di trasmissione neurochimica.
Conclusioni
- L'imaging in tempo reale è uno strumento prezioso per lo studio del rilascio delle vescicole.
- Lo studio migliora la conoscenza dei meccanismi di neurotrasmissione.
- FM 4-64 fornisce un metodo affidabile per la visualizzazione delle vescicole.
Domande frequenti
Rilevanza Industriale del Progetto
La misurazione quantitativa dell'esocitosi delle vescicole sinaptiche mediante marcatura con colorante FM fornisce informazioni utili sui meccanismi di rilascio dei neurotrasmettitori, sostenendo la validazione precoce delle molecole bersaglio nella scoperta di farmaci orientata alla neurobiologia. Questo approccio consente un confronto diretto della cinetica di rilascio delle vescicole tra neuroni modificati geneticamente o farmacologicamente e controlli, fornendo elementi meccanicistici per la riduzione del rischio e una maggiore affidabilità predittiva nel momento cruciale della scoperta.
Applicazioni Strategiche nella Ricerca e Sviluppo in Biopharma
Scoperta Precoce e Validazione del Bersaglio
- Permette l'analisi dei meccanismi di rilascio sinaptico in colture neuronali rilevanti per le malattie.
- Consente la validazione funzionale di manipolazioni genetiche o farmacologiche che influenzano l'esocitosi.
- Semplifica la riduzione del rischio meccanicistico quantificando i cambiamenti della funzione presinaptica.
- Fornisce un'elevata affidabilità predittiva per lo sviluppo di programmi su composti neuroattivi.
Sviluppo di Screening e Saggi
- Stabilisce letture quantitative e riproducibili per il rilascio di vescicole in colture neuronali primarie.
- Permette la standardizzazione del saggio per confrontare sinapsi trasfettate e di controllo.
- Consente una valutazione scalabile degli effetti di composti o interventi genetici sui tassi di esocitosi.
- Prepara sistemi validati per lo screening successivo di modulatori sinaptici.
Ricerca Translazionale e Preclinica
- Allinea i saggi della funzione sinaptica in vitro a modelli neuronali pertinenti per la malattia.
- Fornisce continuità dalla scoperta meccanicistica alla validazione preclinica di bersagli sinaptici.
- Supporta l'avanzamento dei candidati neuroterapeutici con rischio modulato in base a letture funzionali.
Integrazione di Pipeline e Flusso di Lavoro
La misurazione dell'esocitosi basata sui coloranti FM si integra nel continuum dalla scoperta alla fase preclinica, collegando studi meccanicistici iniziali e validazione traslazionale in sistemi neuronali.
- Biologia della scoperta Quantifica il rilascio delle vescicole sinaptiche per verificare ipotesi sui meccanismi di neurotrasmissione.
- Screening: Fornisce output quantitativi e riproducibili per lo screening di composti o di carattere genetico in colture neuronali.
- Analitica: Fornisce misurazioni cinetiche basate sulla fluorescenza per un confronto statistico robusto delle condizioni sperimentali.
- Ricerca traslazionale Collega la funzione sinaptica in vitro a fenotipi rilevanti per la malattia in modelli preclinici.
- Riutilizzo aziendale: Offre una piattaforma riutilizzabile per valutare diverse interazioni neuroattive in diversi programmi.
Impatto Operativo ed Aziendale
- Valore scientifico: Aumenta la fiducia predittiva e riduce l'ambiguità meccanicistica nella validazione dei bersagli sinaptici.
- Valore operativo: Standardizza e rende scalabili i saggi quantitativi di esocitosi per consentire il confronto tra studi.
- Valore strategico: Orienta le decisioni di avanzamento o interruzione dei progetti e migliora l'efficienza nell'uso del capitale nei portafogli di neurobiologia.
- Impatto sul portafoglio: Permette la priorizzazione di composti neuroattivi e bersagli genetici in base al rischio.
Considerazioni sull'implementazione
- Richiede competenze nella coltura di neuroni e nell'immagine di fluorescenza su cellule vive.
- Necessita dell'accesso a un microscopio a fluorescenza invertito e a camere di perfusione personalizzate.
- Richiede protocolli rigorosi di lavaggio e stimolazione per garantire la riproducibilità del saggio.
- È necessario adattare le velocità di flusso e la durata dei lavaggi per ottimizzare la rimozione del colorante e la specificità del segnale.
- I limiti pratici includono la variabilità potenziale nell'efficienza della stimolazione elettrica e nell'assorbimento del colorante.
