Name: Vaccino infezione da virus e analisi temporale di espressione genica del virus: Parte 3 (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2009-04-13T00:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 35 s
Description: Impara a marcare RNA antisenso da cellule HeLa infettate con virus vaccinia mediante accoppiamento amino-allyl di coloranti. Questo metodo prepara i campioni per l'analisi di espressione genica su microarray.

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Whitehead Institute Fellows Fondi

Parte 1: ARNA etichettatura: accoppiamento allilico amino dei coloranti <ol><li> Aggiungere 1μg dei campioni ARNA in provette da microcentrifuga 1,5 ml. </li><li> Vuoto a secco i campioni a fuoco basso o nullo fino a quando non sono completamente asciutti. Cap ciascun tubo non appena è asciutto - non asciugare eccessivamente! </li><li> Aggiungi 9μl buffer di accoppiamento a ciascuna provetta e la ARNA delicatamente su vortex per 1 minuto. Centrifugare brevemente per raccogliere il campione sul fondo del tubo, e poi lasciare che il campione sedersi sul ghiaccio. </li><li> Aggiungere 22μl di DMSO di alta qualità per ogni tubo di Cy3 o Cy5 colorante. Un tubo di colorante è sufficiente per 2 campioni. Il colorante è Cy3 per etichettare i campioni di riferimento, e il colorante Cy5 è per etichettare i campioni di prova. </li><li> Vortex le tinture per mescolare completamente. Mantenere i coloranti al buio fino al momento dell&#39;uso. Non preparare colorante prima di 1 ora prima dell&#39;uso. Assicurarsi che l&#39;acqua non arriva in tinta / DMSO mix in qualsiasi momento. </li><li> Aggiungere 11μl del preparato DMSO / Cy colorante per ogni campione. Mescolare bene nel vortex con delicatezza. </li><li> Incubare per 30-45 minuti a temperatura ambiente. Coprire con carta stagnola o tenerli in un cassetto per minimizzare l&#39;esposizione alla luce. </li><li> Dopo l&#39;incubazione, aggiungere 4.5μl hydroxlyamine ad ogni campione di spegnere la reazione. Mescolare bene nel vortex con delicatezza. </li><li> Incubare per altri 15 minuti a temperatura ambiente. Coprire con carta stagnola o tenerli in un cassetto per minimizzare l&#39;esposizione alla luce. </li></ol> Parte 2: Labeled ARNA clean-up <ol><li> Vortex le perline RNA vincolante per breve tempo ad ottenere un impasto omogeneo prima dell&#39;uso. </li><li> Preparare il Mix Binding ARNA a temperatura ambiente. (Tabella 1) </li><li> Mescolare bene nel vortex. </li><li> Aliquote Buffer ARNA eluizione in una provetta 1,5 ml ed incubare a 50-60 ° C per almeno 10 minuti. </li><li> Aggiungere 70μl della miscela ARNA vincolante per ogni campione e mescolare bene pipettando su e giù per 3-4 volte. </li><li> Trasferimento dei campioni dalla piastra PCR ad un 96-ben a fondo rotondo piatto. </li><li> Aggiungere 50μl del 100% di isopropanolo a ciascun campione e mescolare bene pipettando su e giù per 3-4 volte. </li><li> Agitare delicatamente la piastra su un agitatore orbitale per almeno 2 minuti per mescolare completamente i campioni. </li><li> Spostare la piastra ad un supporto magnetico per catturare le sfere magnetiche. Lascia la piastra sul supporto fino a quando il composto diventa trasparente e le palline sono vincolanti pellet. </li><li> Con attenzione aspirare il surnatante con un aspiratore a vuoto senza disturbare il sfere magnetiche. In alternativa, rimuovere con attenzione il surnatante con una pipetta e scartare il surnatante. Il sopranatante deve essere un rosa brillante o un blu brillante a questo punto a causa della molecole di colorante senza personalità giuridica. </li><li> Togliere la placca dal supporto magnetico. </li><li> Aggiungere 100μl soluzione di lavaggio ARNA in ogni pozzetto e agitare la piastra per 1 minuto l&#39;agitatore orbitale a velocità moderata. Perline potrebbero non disperdere in questa fase. </li><li> Spostare la piastra ad un supporto magnetico per catturare le sfere magnetiche. </li><li> Con attenzione aspirare il surnatante con un aspiratore a vuoto senza disturbare il sfere magnetiche. In alternativa, rimuovere con attenzione il surnatante con una pipetta e scartare il surnatante. </li><li> Togliere la placca dal supporto magnetico. </li><li> Ripetere il lavaggio per volta 2 ° con la soluzione di 100μl Wash ARNA. </li><li> Dopo il 2 ° lavare, asciugare le perle agitando la piastra per 1 minuto l&#39;agitatore orbitale alla massima velocità. Non asciugare eccessivamente i campioni! </li><li> Eluire la ARNA dalle perle con l&#39;aggiunta di 20μl preriscaldato Elution Buffer ARNA per ogni campione. </li><li> Agitare vigorosamente la piastra l&#39;agitatore orbitale per 3 minuti, quindi controllare per assicurarsi che le sfere magnetiche sono completamente disperse. In caso contrario, continuare a tremare. </li><li> Una volta che il sfere magnetiche sono completamente dispersi, spostare la piastra ad un supporto magnetico per catturare le sfere magnetiche. Il supernatante contiene il pulito, campioni ARNA etichettati, e dovrebbe essere un rosa pallido o di un azzurro pallido. </li><li> Trasferire accuratamente l&#39;ARNA eluiti ad una nuova piastra PCR (PCR o tubi). </li><li> (Passo opzionale) Controllare la concentrazione di RNA e la quantità di colorante nei campioni misurando 1.5μl su uno spettrofotometro NanoDrop utilizzando il modulo Microarray. </li><li> Immediatamente ibridare l&#39;ARNA etichetta su una piattaforma microarray di vostra scelta, o, in alternativa, è possibile memorizzare l&#39;ARNA etichettati a -80 ° C fino a quando si è pronti per l&#39;ibridazione. </li></ol> Tabella 1 ARNA Mix Binding <table border="1"><tbody><tr><td> Reagente </td><td> Importo per 1 reazione </td></tr><tr><td> Perline RNA Binding * </td><td> 10μl </td></tr><tr><td> Bead Resuspension * Soluzione </td><td> 4μl </td></tr><tr><td> 100% isopropanolo ** </td><td> 6μl </td></tr><tr><td> ARNA Concentrato Binding Buffer </td><td> 50μl </td></tr></tbody></table> * Mescolare le perline RNA legame con latallone soluzione risospensione prima ** Aggiungere l&#39;isopropanolo e mescolare bene prima di aggiungere il legame tampone concentrato ARNA.

<ol><li>Rubins, K. H., Hensley, L. E., Bell, G. W., Wang, C., Lefkowitz, E. J., Brown, P. O., Relman, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparative+analysis+of+viral+gene+expression+programs+during+poxvirus+infection%3A+a+transcriptional+map+of+the+vaccinia+and+monkeypox+genomes%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+ONE%22%5BJournal%5D)">Comparative analysis of viral gene expression programs during poxvirus infection: a transcriptional map of the vaccinia and monkeypox genomes.</a> PLoS ONE. 3 (7), e2628-e2628 (2008).</li>
<li>Assarsson, E., Greenbaum, J. A., Sundström, M., Schaffer, L., Hammond, J. A., Pasquetto, V., Oseroff, C., Hendrickson, R. C., Lefkowitz, E. J., Tscharke, D. C., Sidney, J., Grey, H. M., Head, S. R., Peters, B., Sette, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Kinetic+analysis+of+a+complete+poxvirus+transcriptome+reveals+an+immediate-early+class+of+genes%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci%22%5BJournal%5D)">Kinetic analysis of a complete poxvirus transcriptome reveals an immediate-early class of genes.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. 105 (6), 2140-2145 (2008).</li>
<li>Satheshkumar, P. S., Moss, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Poxvirus+transcriptome+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">Poxvirus transcriptome analysis.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 105, E62-E62 (2008).</li>
<li>Assarsson, E., Greenbaum, J. A., Sundström, M., Schaffer, L., Hammond, J. A., Pasquetto, V., Oseroff, C., Hendrickson, R. C., Lefkowitz, E. J., Tscharke, D. C., Sidney, J., Grey, H. M., Head, S. R., Peters, B., Sette, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A.+Reply+to+Satheshkumar+and+Moss%3A+Poxvirus+transcriptome+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">A. Reply to Satheshkumar and Moss: Poxvirus transcriptome analysis.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 105, E63-E64 (2008).</li>
<li>Guerra, S., López-Fernández, L. A., Pascual-Montano, A., Muñoz, M., Harshman, K., Esteban, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cellular+gene+expression+survey+of+vaccinia+virus+infection+of+human+HeLa+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J+Virol%22%5BJournal%5D)">Cellular gene expression survey of vaccinia virus infection of human HeLa cells.</a> J Virol. 77 (11), 6493-6506 (2003).</li>
<li>Guerra, S., López-Fernández, L. A., Conde, R., Pascual-Montano, A., Harshman, K., Esteban, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microarray+analysis+reveals+characteristic+changes+of+host+cell+gene+expression+in+response+to+attenuated+modified+vaccinia+virus+Ankara+infection+of+human+HeLa+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J+Virol%22%5BJournal%5D)">Microarray analysis reveals characteristic changes of host cell gene expression in response to attenuated modified vaccinia virus Ankara infection of human HeLa cells.</a> J Virol. 78 (11), 5820-5824 (2004).</li>
<li>Guerra, S., López-Fernández, L. A., Pascual-Montano, A., Nájera, J. L., Zaballos, A., Esteban, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Host+response+to+the+attenuated+poxvirus+vector+NYVAC%3A+upregulation+of+apoptotic+genes+and+NF-kappaB-responsive+genes+in+infected+HeLa+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J+Virol%22%5BJournal%5D)">Host response to the attenuated poxvirus vector NYVAC: upregulation of apoptotic genes and NF-kappaB-responsive genes in infected HeLa cells.</a> J Virol. 80 (2), 985-998 (2006).</li>
<li>Guerra, S., Nájera, J. L., González, J. M., López-Fernández, L. A., Climent, N., Gatell, J. M., Gallart, T., Esteban, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Distinct+gene+expression+profiling+after+infection+of+immature+human+monocyte-derived+dendritic+cells+by+the+attenuated+poxvirus+vectors+MVA+and+NYVAC%5BTitle%5D)+AND+%22%22%5BJournal%5D)">Distinct gene expression profiling after infection of immature human monocyte-derived dendritic cells by the attenuated poxvirus vectors MVA and NYVAC.</a> 81 (16), 8707-8721 (2007).</li>
</ol>

Gli autori non hanno nulla da dichiarare.

Passaggi critici Quando si esegue l&#39;accoppiamento allilico aminoacidi, è fondamentale per risospendere il colorante in DMSO poco (meno di 1 ora) prima dell&#39;accoppiamento e garantire l&#39;acqua non entra nella tintura / DMSO mix, come si reagisce con il gruppo attivo sul colorante. Non asciugare eccessivamente l&#39;RNA (può essere asciugati fino a 1-2uL piuttosto che completamente asciutto), e risospendere bene nel buffer di accoppiamento. Durante la reazione di accoppiamento, tenere ...

<table><tbody><tr><td>Pacchetto di coloranti reattivi post-etichettatura CyDye</td><td>Reagente</td><td>GE Healthcare</td><td>RPN5661</td><td>Contiene i coloranti Cy3 e Cy5</td></tr><tr><td>Spettrofotometro NanoDrop ND-1000 UV-VIS</td><td>Altro</td><td>NanoDrop</td><td>ND-1000</td><td>O spettrofotometro equivalente</td></tr></tbody></table>

vaccino infezione da virus e analisi temporale di espressione genica del virus: parte 3

Vaccinia Virus Infection &amp; Temporal Analysis of Virus Gene Expression: Part 3

La famiglia<em&gt; Poxviridae</em&gt; È costituito da grandi DNA a doppia elica che contiene virus che si replicano esclusivamente nel citoplasma delle cellule infette. I membri del<em&gt; Orthopox</em&gt; Genere includono vaiolo, l&#39;agente eziologico del vaiolo umano, vaiolo delle scimmie, e vaccinico (VAC), il membro prototipo della famiglia di virus. All&#39;interno del relativamente grande (~ 200 kb) vaccinia genoma, tre classi di geni sono codificati: precoce, intermedio e in ritardo. Anche se tutte e tre le classi sono trascritte dai virale codifica RNA polimerasi, ogni classe svolge una funzione diversa nel ciclo di vita del virus. Poxvirus utilizzano strategie multiple di modulare l&#39;ambiente host cellulare durante l&#39;infezione. Per capire regolamentazione sia di accoglienza e di espressione genica del virus, abbiamo utilizzato tutto il genoma approcci per analizzare abbondanza trascrizione sia da virus e cellule ospiti. In questo studio dimostriamo infezioni corso a tempo di cellule HeLa con il virus vaccinico e RNA di campionamento in diversi momenti dopo l&#39;infezione. Sia host e virale RNA totale è isolato e amplificato per l&#39;ibridazione di microarray per l&#39;analisi dell&#39;espressione genica.

Protocollo per vaccinia infezione di cellule HeLa e analisi di accoglienza e l&#39;espressione genica virale. Parte 3 descrive il processo di fluorescenza etichettatura RNA amplificato da entrambi host e campioni di virus da aminoacidi accoppiamento allilico di coloranti. Parte 3 di 3.

Vaccino infezione da virus e analisi temporale di espressione genica del virus: Parte 3

La famiglia Poxviridae comprende virus contenenti DNA a doppio filamento di grandi dimensioni che si replicano esclusivamente nel citoplasma delle cellule infette. I membri di...

Ciao, sono Judy Y del laboratorio di Kate Rubins presso l'Istituto Whitehead per la Ricerca Biomedica. In questo video mostriamo come etichettare i campioni di RNA antisenso raccolti sia da cellule HeLa infettate dal virus vaccinia sia dal virus stesso, mediante accoppiamento di coloranti tramite amino allil LEO. Successivamente, illustriamo come purificare l'RNA etichettato e prepararlo per l'ibridazione nell'analisi mediante microarray dell'espressione genica.Nel precedente video di JoVE viene illustrato come eseguire l'isolamento dell'RNA totale da infezioni virali e i passaggi di amplificazione dell'RNA. Cominciamo dunque. Per iniziare l'etichettatura dell'RNA, aggiungere innanzitutto un microgrammo dei campioni di RNA A in provette microcentrifughe da 1,5 millilitri.Essiccare sotto vuoto i campioni a calore basso o nullo fino a completa asciugatura. Chiudere ogni provetta non appena è asciutta. È importante non eccessivamente essiccare i campioni dopo che sono asciutti.Aggiungere nove microlitri di buffer di accoppiamento a ogni provetta e risospendere l'RNA A mediante vortexaggio delicato per un minuto; centrifugare brevemente per raccogliere il campione sul fondo della provetta, quindi lasciare il campione in ghiaccio. Successivamente, aggiungere 22 microlitri di DMSO di alta qualità a ogni provetta di colorante SCI tre o S cinque; una provetta di colorante è sufficiente per due campioni. Il colorante S SI tre è destinato all'etichettatura dei campioni di riferimento, mentre il colorante SCI cinque è per l'etichettatura dei campioni in prova.Vortexare i coloranti per mescolarli accuratamente. Ricordare di mantenere i coloranti al buio fino al momento dell'uso. Non preparare il colorante più di un'ora prima dell'utilizzo e assicurarsi che nessuna traccia di acqua entri nella miscela di colorante in DMSO in nessun momento.Aggiungere ora 11 microlitri della miscela di colorante D-M-S-O-S a ciascun campione, mescolando bene mediante vortex. Incubare delicatamente per 30-45 minuti a temperatura ambiente. Coprire i campioni con carta stagnola o mantenerli in un cassetto per ridurre al minimo l'esposizione alla luce.Dopo l'incubazione, aggiungere 4,5 microlitri di idrossilammina a ogni campione per bloccare la reazione, quindi mescolare accuratamente mediante vortex. Incubare delicatamente per altri 15 minuti a temperatura ambiente. Coprire i campioni con carta d'alluminio o mantenerli in un cassetto per ridurre al minimo l'esposizione alla luce.Per pulire l'etichetta, si effettua un vortex dell'RNA e delle perle di legame all'RNA. Per ottenere brevemente una miscela omogenea prima dell'uso, preparare la miscela di legame all'RNA A a temperatura ambiente. Mescolare accuratamente la miscela di legame mediante vortex, aliquotare il tampone di eluizione dell'RNA A in una provetta da 1,5 millilitro e incubare a 50-60 gradi Celsius per almeno 10 minuti.Aggiungere 70 microlitri della miscela di legame A RNA a ciascun campione e mescolare accuratamente aspirando e dispensando con la pipetta da tre a quattro volte; dopo il mescolamento, trasferire i campioni dalla piastra PCR a una piastra rotonda a 96 pozzetti. Successivamente, aggiungere 50 microlitri di isopropanolo al cento per cento a ciascun campione e mescolare accuratamente aspirando e dispensando con la pipetta da tre a quattro volte. Agitare delicatamente la piastra su un agitatore orbitale per almeno due minuti.Per mescolare accuratamente i campioni. Spostare la piastra su un supporto magnetico. Per catturare le perle magnetiche.Lasciare la piastra sul supporto fino a quando la miscela diventa trasparente e le perle di legame si sono sedimentate. Aspirare con attenzione il soprannatante utilizzando un aspiratore a vuoto, senza disturbare le perle magnetiche. In alternativa, rimuovere con attenzione il soprannatante con una pipetta e scartare il soprannatante.In questo momento, il surnatante dovrebbe essere di un colore rosa brillante o blu brillante a causa delle molecole di colorante non incorporate. Dopo aver eliminato il surnatante, rimuovere la piastra dal supporto magnetico. Aggiungere ora cento microlitri di soluzione di lavaggio per RNA in ogni pozzetto e agitare la piastra per un minuto sullo shaker orbitale a velocità moderata.Le perle potrebbero non disperdersi completamente in questo passaggio; riposizionare la piastra su un supporto magnetico per catturare le perle magnetiche. Aspirare con attenzione il sopranatante utilizzando un aspiratore a vuoto, senza disturbare le perle magnetiche.In alternativa, rimuovere con attenzione il soprannatante utilizzando una pipetta e scartare il soprannatante. Rimuovere la piastra dal supporto magnetico. Ripetere il lavaggio una seconda volta con 100 microlitri di soluzione di lavaggio A per RNA.Dopo il secondo lavaggio, asciugare le perle agitando la piastra per un minuto sullo shaker orbitale alla velocità massima. Non asciugare eccessivamente i campioni; eluire l'RNA A dalle perle aggiungendo 20 microlitri di tampone di eluizione per RNA A preriscaldato.Agitare vigorosamente ogni campione sulla piastra agitata per tre minuti. Successivamente, verificare che le perle magnetiche siano completamente disperse. In caso contrario, continuare ad agitare.Una volta che le perle magnetiche sono completamente disperse, spostare la piastra su un supporto magnetico per catturare le perle magnetiche. Il surnatante contiene i campioni di RNA A marcati e purificati e deve essere di un colore rosa pallido o blu pallido. Successivamente, trasferire con attenzione l'RNA A indicato in una nuova piastra PCR o in provette PCR.A questo punto, è possibile verificare la concentrazione di RNA e la quantità di colorante nei campioni misurando 1,5 microlitri con uno spettrofotometro NanoDrop. Utilizzando immediatamente il modulo per microarray, ibridare l'RNA marcato A su una piattaforma a microarray a scelta. In alternativa, è possibile conservare l'RNA marcato A a meno 80 gradi Celsius fino al momento dell'ibridazione.Questa è una lettura rappresentativa di uno spettrofotometro e un grafico di densità ottica generati utilizzando lo spettrofotometro NanoDrop per misurare la concentrazione del campione e l'incorporazione del colorante. È possibile osservare i picchi di densità ottica a 260 nanometri per il calcolo della concentrazione dei campioni, nonché i due picchi intorno a 532 e 635 nanometri, che rappresentano rispettivamente i coloranti S3 e SCI five. Abbiamo appena mostrato come etichettare fluorescentemente campioni di RNA con alleli immunitari amplificati incorporati per l'ibridazione su micromatrici.Quando si esegue questa procedura, è importante ricordare di risospendere il colorante nel DMSO meno di un'ora prima della coniugazione e assicurarsi che nessuna traccia di acqua entri nella miscela di colorante e DMSO, poiché reagirebbe con il gruppo attivo del colorante. È inoltre fondamentale evitare di asciugare eccessivamente l'RNA, se necessario. I campioni possono essere portati a un volume di uno-due microlitri anziché essere completamente asciutti, quindi risospesi accuratamente nel buffer di coniugazione durante la reazione di coniugazione.Mantenere le reazioni al buio con occasionali movimenti rotatori e centrifugare se desiderato. Questo è tutto. Grazie per aver guardato e buona fortuna con i vostri esperimenti.Assicurarsi di guardare gli altri video di questa serie in cui mostriamo come eseguire un'infezione in corso di tempo con il virus vaccinia, l'estrazione dell'RNA dai campioni e la procedura di amplificazione lineare dei campioni di RNA.

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