Vaccino infezione da virus e analisi temporale di espressione genica del virus: Parte 3

Ciao, sono Judy Y del laboratorio di Kate Rubins presso il Whitehead Institute for Biomedical Research. Qui dimostriamo come marcare i campioni di RNA antisenso raccolti sia dalle cellule hela infettate dal virus del vaccino che dal virus mediante l'accoppiamento amminico di coloranti LEO. Mostriamo quindi come ripulire l'RNA A marcato e prepararlo per essere ibridato per l'analisi microarray dell'espressione genica.

I precedenti video di Joe evidenziano come eseguire l'isolamento totale dell'RNA delle infezioni virali e le fasi di amplificazione e amplificazione dell'RNA. Quindi iniziamo. Per iniziare la marcatura dell'RNA, aggiungere prima un microgrammo di campioni di RNA A in provette da microcentrifuga da 1,5 millilitri.

Asciugare i campioni sotto vuoto a fuoco basso o assente fino a quando non sono completamente asciutti. Tappare ogni provetta non appena è asciutta. È importante non asciugare eccessivamente i campioni dopo che si sono asciugati.

Aggiungere nove microlitri di tampone di accoppiamento a ciascuna provetta e risospendere l'RNA A agitando delicatamente per un minuto, centrifugare brevemente per raccogliere il campione sul fondo della provetta e quindi lasciare il campione sul ghiaccio. Quindi, aggiungere 22 microlitri di DMSO di alta qualità a ciascuna provetta di LM tre o S cinque coloranti, una tubetta di colorante è sufficiente per due campioni. Il tre matrici S SI per l'etichettatura dei campioni di riferimento e il colorante SCI five per l'etichettatura dei campioni di prova.

Agitare i coloranti per mescolarli accuratamente. Ricordati di tenere i coloranti al buio fino al momento dell'uso. Non preparare il colorante prima di un'ora prima dell'uso e assicurarsi che l'acqua non penetri mai nella miscela di colorante DMSO.

Ora a 11 microlitri della miscela di colorante D-M-S-O-S preparata per ogni campione mescolato bene mediante vortex. Incubare delicatamente per 30-45 minuti a temperatura ambiente. Copri i campioni con carta stagnola o conservali in un cassetto per ridurre al minimo l'esposizione alla luce.

Dopo l'incubazione a 4,5 microlitri di idrossilammina per ogni campione per estinguere la reazione si è mescolata bene mediante vortexing. Incubare delicatamente per altri 15 minuti a temperatura di scopa. Copri i campioni con carta stagnola o conservali in un cassetto per ridurre al minimo l'esposizione alla luce.

Per pulire l'etichetta, vortice di RNA, le perle di legame dell'RNA. Brevemente per ottenere una miscela uniforme prima dell'uso, preparare la miscela legante l'RNA A a temperatura ambiente. Mescolare bene la miscela di legame facendo vorticare l'aliquota del tampone di eluizione dell'RNA A in una provetta da 1,5 millilitri e incubarla a 50-60 gradi Celsius per almeno 10 minuti.

Aggiungere 70 microlitri della miscela legante l'RNA A a ciascun campione e mescolare bene per tubo aggiungendo su e giù tre o quattro volte dopo la miscelazione, trasferire i campioni dalla piastra PCR a una piastra inferiore rotonda da 96 pozzetti. Quindi, aggiungere 50 microlitri di isopropanolo al cento per cento a ciascun campione e mescolare bene pipettando su e giù tre o quattro volte. Agitare delicatamente la piastra su uno shaker orbitale per almeno due minuti.

Per mescolare accuratamente i campioni. Spostare la piastra su un supporto magnetico. Per catturare le perline magnetiche.

Lasciare la piastra sul supporto fino a quando il composto diventa trasparente e le perline di legatura si sono pellettate. Aspirare con cautela il surnatante con un aspiratore a vuoto senza disturbare le biglie magnetiche. In alternativa, rimuovere con cautela il surnatante con una pipetta e gettare il surnatante.

A questo punto, il surnatante dovrebbe essere di un rosa brillante o di un blu brillante a causa delle molecole di colorante non incorporate. Una volta scartato il surnatante, rimuovere la piastra dal supporto magnetico. Ora aggiungi un centinaio di microlitri, una soluzione di lavaggio dell'RNA a ciascun pozzetto e agita la piastra per un minuto sull'agitatore orbitale a velocità moderata.

Le perle potrebbero non disperdersi completamente in questa fase, riportare la piastra su un supporto magnetico. Per catturare le perline magnetiche. Aspirare con cautela il surnatante con un aspiratore a vuoto senza disturbare le biglie magnetiche.

In alternativa, rimuovere con cautela il surnatante con una pipetta e gettare il surnatante. Rimuovere la piastra dal supporto magnetico. Ripetere il lavaggio una seconda volta con 100 microlitri, una soluzione di lavaggio a RNA.

Dopo il secondo lavaggio. Asciugare le perle agitando la piastra per un minuto sullo scuotitore orbitale alla massima velocità. Non asciugare eccessivamente i campioni, eluire l'RNA A dalle perle aggiungendo 20 microlitri di tampone di eluizione dell'RNA A preriscaldato.

Per ogni campione, agitare energicamente la piastra sull'agitatore orbitale per tre minuti. Quindi verificare che le perline magnetiche siano completamente disperse. In caso contrario, continuare a scuotere.

Una volta che le perline magnetiche sono completamente disperse, spostare la piastra su un supporto magnetico per catturare le perline magnetiche. Il surnatante contiene i campioni di RNA A marcati ripuliti e dovrebbe essere di un rosa pallido o di un blu pallido. Quindi, trasferire con cura l'RNA alluso in una nuova piastra PCR o in provette PCR.

A questo punto, è possibile controllare la concentrazione di RNA e la quantità di colorante nei campioni misurando 1,5 microlitri su uno spettrofotometro NanoDrop. Utilizzando il modulo microarray, ibridate immediatamente l'RNA A marcato su una piattaforma di microarray di vostra scelta. Oppure, in alternativa, è possibile conservare l'RNA A marcato a una temperatura negativa di 80 gradi Celsius fino a quando non si è pronti per l'ibridazione.

Si tratta di una lettura rappresentativa dello spettrofotometro e di un grafico OD generato utilizzando lo spettrofotometro NanoDrop per misurare la concentrazione del campione e l'incorporazione del colorante. È possibile vedere i picchi OD a 260 nanometri per calcolare la concentrazione dei campioni, nonché i due picchi intorno a 532 e 635 nanometri che rappresentano rispettivamente i cinque coloranti S3 e SCI. Vi abbiamo appena mostrato come marcare in fluorescenza i campioni di RNA incorporati nell'allele immuno amplificato per l'ibridazione a microraggi.

Quando si esegue questa procedura, è importante ricordarsi di risospendere il colorante in DMSO meno di un'ora prima dell'accoppiamento e assicurarsi che l'acqua non penetri nella miscela di colorante DMSO poiché reagirà con il gruppo attivo sul colorante. È anche importante ricordare di non asciugare eccessivamente l'RNA, se necessario. I campioni possono essere essiccati fino a uno o due microlitri piuttosto che completamente asciutti, e quindi risospesi bene nel tampone di accoppiamento durante la reazione di accoppiamento.

Mantieni le reazioni al buio con occasionali movimenti e gira verso il basso se lo desideri. Quindi questo è tutto. Grazie per aver guardato e buona fortuna con i tuoi esperimenti.

Assicurati di guardare gli altri video di questa serie in cui mostriamo come eseguire un'infezione nel corso del tempo con il virus vaccinico e l'estrazione dell'RNA dei campioni e la procedura per l'amplificazione lineare dei campioni di RNA.