Name: Vaccino infezione da virus e analisi temporale di espressione genica del virus: Parte 3 (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2009-04-13T00:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 35 s
Description: Impara a marcare RNA antisenso da cellule HeLa infettate con virus vaccinia mediante accoppiamento amino-allyl di coloranti. Questo metodo prepara i campioni per l'analisi di espressione genica su microarray.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Whitehead Institute Fellows Fondi

Parte 1: ARNA etichettatura: accoppiamento allilico amino dei coloranti <ol><li> Aggiungere 1μg dei campioni ARNA in provette da microcentrifuga 1,5 ml. </li><li> Vuoto a secco i campioni a fuoco basso o nullo fino a quando non sono completamente asciutti. Cap ciascun tubo non appena è asciutto - non asciugare eccessivamente! </li><li> Aggiungi 9μl buffer di accoppiamento a ciascuna provetta e la ARNA delicatamente su vortex per 1 minuto. Centrifugare brevemente per raccogliere il campione sul fondo del tubo, e poi lasciare che il campione sedersi sul ghiaccio. </li><li> Aggiungere 22μl di DMSO di alta qualità per ogni tubo di Cy3 o Cy5 colorante. Un tubo di colorante è sufficiente per 2 campioni. Il colorante è Cy3 per etichettare i campioni di riferimento, e il colorante Cy5 è per etichettare i campioni di prova. </li><li> Vortex le tinture per mescolare completamente. Mantenere i coloranti al buio fino al momento dell&#39;uso. Non preparare colorante prima di 1 ora prima dell&#39;uso. Assicurarsi che l&#39;acqua non arriva in tinta / DMSO mix in qualsiasi momento. </li><li> Aggiungere 11μl del preparato DMSO / Cy colorante per ogni campione. Mescolare bene nel vortex con delicatezza. </li><li> Incubare per 30-45 minuti a temperatura ambiente. Coprire con carta stagnola o tenerli in un cassetto per minimizzare l&#39;esposizione alla luce. </li><li> Dopo l&#39;incubazione, aggiungere 4.5μl hydroxlyamine ad ogni campione di spegnere la reazione. Mescolare bene nel vortex con delicatezza. </li><li> Incubare per altri 15 minuti a temperatura ambiente. Coprire con carta stagnola o tenerli in un cassetto per minimizzare l&#39;esposizione alla luce. </li></ol> Parte 2: Labeled ARNA clean-up <ol><li> Vortex le perline RNA vincolante per breve tempo ad ottenere un impasto omogeneo prima dell&#39;uso. </li><li> Preparare il Mix Binding ARNA a temperatura ambiente. (Tabella 1) </li><li> Mescolare bene nel vortex. </li><li> Aliquote Buffer ARNA eluizione in una provetta 1,5 ml ed incubare a 50-60 ° C per almeno 10 minuti. </li><li> Aggiungere 70μl della miscela ARNA vincolante per ogni campione e mescolare bene pipettando su e giù per 3-4 volte. </li><li> Trasferimento dei campioni dalla piastra PCR ad un 96-ben a fondo rotondo piatto. </li><li> Aggiungere 50μl del 100% di isopropanolo a ciascun campione e mescolare bene pipettando su e giù per 3-4 volte. </li><li> Agitare delicatamente la piastra su un agitatore orbitale per almeno 2 minuti per mescolare completamente i campioni. </li><li> Spostare la piastra ad un supporto magnetico per catturare le sfere magnetiche. Lascia la piastra sul supporto fino a quando il composto diventa trasparente e le palline sono vincolanti pellet. </li><li> Con attenzione aspirare il surnatante con un aspiratore a vuoto senza disturbare il sfere magnetiche. In alternativa, rimuovere con attenzione il surnatante con una pipetta e scartare il surnatante. Il sopranatante deve essere un rosa brillante o un blu brillante a questo punto a causa della molecole di colorante senza personalità giuridica. </li><li> Togliere la placca dal supporto magnetico. </li><li> Aggiungere 100μl soluzione di lavaggio ARNA in ogni pozzetto e agitare la piastra per 1 minuto l&#39;agitatore orbitale a velocità moderata. Perline potrebbero non disperdere in questa fase. </li><li> Spostare la piastra ad un supporto magnetico per catturare le sfere magnetiche. </li><li> Con attenzione aspirare il surnatante con un aspiratore a vuoto senza disturbare il sfere magnetiche. In alternativa, rimuovere con attenzione il surnatante con una pipetta e scartare il surnatante. </li><li> Togliere la placca dal supporto magnetico. </li><li> Ripetere il lavaggio per volta 2 ° con la soluzione di 100μl Wash ARNA. </li><li> Dopo il 2 ° lavare, asciugare le perle agitando la piastra per 1 minuto l&#39;agitatore orbitale alla massima velocità. Non asciugare eccessivamente i campioni! </li><li> Eluire la ARNA dalle perle con l&#39;aggiunta di 20μl preriscaldato Elution Buffer ARNA per ogni campione. </li><li> Agitare vigorosamente la piastra l&#39;agitatore orbitale per 3 minuti, quindi controllare per assicurarsi che le sfere magnetiche sono completamente disperse. In caso contrario, continuare a tremare. </li><li> Una volta che il sfere magnetiche sono completamente dispersi, spostare la piastra ad un supporto magnetico per catturare le sfere magnetiche. Il supernatante contiene il pulito, campioni ARNA etichettati, e dovrebbe essere un rosa pallido o di un azzurro pallido. </li><li> Trasferire accuratamente l&#39;ARNA eluiti ad una nuova piastra PCR (PCR o tubi). </li><li> (Passo opzionale) Controllare la concentrazione di RNA e la quantità di colorante nei campioni misurando 1.5μl su uno spettrofotometro NanoDrop utilizzando il modulo Microarray. </li><li> Immediatamente ibridare l&#39;ARNA etichetta su una piattaforma microarray di vostra scelta, o, in alternativa, è possibile memorizzare l&#39;ARNA etichettati a -80 ° C fino a quando si è pronti per l&#39;ibridazione. </li></ol> Tabella 1 ARNA Mix Binding <table border="1"><tbody><tr><td> Reagente </td><td> Importo per 1 reazione </td></tr><tr><td> Perline RNA Binding * </td><td> 10μl </td></tr><tr><td> Bead Resuspension * Soluzione </td><td> 4μl </td></tr><tr><td> 100% isopropanolo ** </td><td> 6μl </td></tr><tr><td> ARNA Concentrato Binding Buffer </td><td> 50μl </td></tr></tbody></table> * Mescolare le perline RNA legame con latallone soluzione risospensione prima ** Aggiungere l&#39;isopropanolo e mescolare bene prima di aggiungere il legame tampone concentrato ARNA.

<ol><li>Rubins, K. H., Hensley, L. E., Bell, G. W., Wang, C., Lefkowitz, E. J., Brown, P. O., Relman, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparative+analysis+of+viral+gene+expression+programs+during+poxvirus+infection%3A+a+transcriptional+map+of+the+vaccinia+and+monkeypox+genomes%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+ONE%22%5BJournal%5D)">Comparative analysis of viral gene expression programs during poxvirus infection: a transcriptional map of the vaccinia and monkeypox genomes.</a> PLoS ONE. 3 (7), e2628-e2628 (2008).</li>
<li>Assarsson, E., Greenbaum, J. A., Sundström, M., Schaffer, L., Hammond, J. A., Pasquetto, V., Oseroff, C., Hendrickson, R. C., Lefkowitz, E. J., Tscharke, D. C., Sidney, J., Grey, H. M., Head, S. R., Peters, B., Sette, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Kinetic+analysis+of+a+complete+poxvirus+transcriptome+reveals+an+immediate-early+class+of+genes%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci%22%5BJournal%5D)">Kinetic analysis of a complete poxvirus transcriptome reveals an immediate-early class of genes.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. 105 (6), 2140-2145 (2008).</li>
<li>Satheshkumar, P. S., Moss, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Poxvirus+transcriptome+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">Poxvirus transcriptome analysis.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 105, E62-E62 (2008).</li>
<li>Assarsson, E., Greenbaum, J. A., Sundström, M., Schaffer, L., Hammond, J. A., Pasquetto, V., Oseroff, C., Hendrickson, R. C., Lefkowitz, E. J., Tscharke, D. C., Sidney, J., Grey, H. M., Head, S. R., Peters, B., Sette, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A.+Reply+to+Satheshkumar+and+Moss%3A+Poxvirus+transcriptome+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">A. Reply to Satheshkumar and Moss: Poxvirus transcriptome analysis.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 105, E63-E64 (2008).</li>
<li>Guerra, S., López-Fernández, L. A., Pascual-Montano, A., Muñoz, M., Harshman, K., Esteban, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cellular+gene+expression+survey+of+vaccinia+virus+infection+of+human+HeLa+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J+Virol%22%5BJournal%5D)">Cellular gene expression survey of vaccinia virus infection of human HeLa cells.</a> J Virol. 77 (11), 6493-6506 (2003).</li>
<li>Guerra, S., López-Fernández, L. A., Conde, R., Pascual-Montano, A., Harshman, K., Esteban, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microarray+analysis+reveals+characteristic+changes+of+host+cell+gene+expression+in+response+to+attenuated+modified+vaccinia+virus+Ankara+infection+of+human+HeLa+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J+Virol%22%5BJournal%5D)">Microarray analysis reveals characteristic changes of host cell gene expression in response to attenuated modified vaccinia virus Ankara infection of human HeLa cells.</a> J Virol. 78 (11), 5820-5824 (2004).</li>
<li>Guerra, S., López-Fernández, L. A., Pascual-Montano, A., Nájera, J. L., Zaballos, A., Esteban, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Host+response+to+the+attenuated+poxvirus+vector+NYVAC%3A+upregulation+of+apoptotic+genes+and+NF-kappaB-responsive+genes+in+infected+HeLa+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J+Virol%22%5BJournal%5D)">Host response to the attenuated poxvirus vector NYVAC: upregulation of apoptotic genes and NF-kappaB-responsive genes in infected HeLa cells.</a> J Virol. 80 (2), 985-998 (2006).</li>
<li>Guerra, S., Nájera, J. L., González, J. M., López-Fernández, L. A., Climent, N., Gatell, J. M., Gallart, T., Esteban, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Distinct+gene+expression+profiling+after+infection+of+immature+human+monocyte-derived+dendritic+cells+by+the+attenuated+poxvirus+vectors+MVA+and+NYVAC%5BTitle%5D)+AND+%22%22%5BJournal%5D)">Distinct gene expression profiling after infection of immature human monocyte-derived dendritic cells by the attenuated poxvirus vectors MVA and NYVAC.</a> 81 (16), 8707-8721 (2007).</li>
</ol>

Gli autori non hanno nulla da dichiarare.

Passaggi critici Quando si esegue l&#39;accoppiamento allilico aminoacidi, è fondamentale per risospendere il colorante in DMSO poco (meno di 1 ora) prima dell&#39;accoppiamento e garantire l&#39;acqua non entra nella tintura / DMSO mix, come si reagisce con il gruppo attivo sul colorante. Non asciugare eccessivamente l&#39;RNA (può essere asciugati fino a 1-2uL piuttosto che completamente asciutto), e risospendere bene nel buffer di accoppiamento. Durante la reazione di accoppiamento, tenere ...

<table><tbody><tr><td>Pacchetto di coloranti reattivi post-etichettatura CyDye</td><td>Reagente</td><td>GE Healthcare</td><td>RPN5661</td><td>Contiene i coloranti Cy3 e Cy5</td></tr><tr><td>Spettrofotometro NanoDrop ND-1000 UV-VIS</td><td>Altro</td><td>NanoDrop</td><td>ND-1000</td><td>O spettrofotometro equivalente</td></tr></tbody></table>

vaccino infezione da virus e analisi temporale di espressione genica del virus: parte 3

Vaccinia Virus Infection &amp; Temporal Analysis of Virus Gene Expression: Part 3

La famiglia<em&gt; Poxviridae</em&gt; È costituito da grandi DNA a doppia elica che contiene virus che si replicano esclusivamente nel citoplasma delle cellule infette. I membri del<em&gt; Orthopox</em&gt; Genere includono vaiolo, l&#39;agente eziologico del vaiolo umano, vaiolo delle scimmie, e vaccinico (VAC), il membro prototipo della famiglia di virus. All&#39;interno del relativamente grande (~ 200 kb) vaccinia genoma, tre classi di geni sono codificati: precoce, intermedio e in ritardo. Anche se tutte e tre le classi sono trascritte dai virale codifica RNA polimerasi, ogni classe svolge una funzione diversa nel ciclo di vita del virus. Poxvirus utilizzano strategie multiple di modulare l&#39;ambiente host cellulare durante l&#39;infezione. Per capire regolamentazione sia di accoglienza e di espressione genica del virus, abbiamo utilizzato tutto il genoma approcci per analizzare abbondanza trascrizione sia da virus e cellule ospiti. In questo studio dimostriamo infezioni corso a tempo di cellule HeLa con il virus vaccinico e RNA di campionamento in diversi momenti dopo l&#39;infezione. Sia host e virale RNA totale è isolato e amplificato per l&#39;ibridazione di microarray per l&#39;analisi dell&#39;espressione genica.

Protocollo per vaccinia infezione di cellule HeLa e analisi di accoglienza e l&#39;espressione genica virale. Parte 3 descrive il processo di fluorescenza etichettatura RNA amplificato da entrambi host e campioni di virus da aminoacidi accoppiamento allilico di coloranti. Parte 3 di 3.

Vaccino infezione da virus e analisi temporale di espressione genica del virus: Parte 3

La famiglia Poxviridae comprende virus contenenti DNA a doppio filamento di grandi dimensioni che si replicano esclusivamente nel citoplasma delle cellule infette. I membri di...

Ciao, sono Judy Y del laboratorio di Kate Rubins presso l'Istituto Whitehead per la Ricerca Biomedica. In questo video mostriamo come etichettare i campioni di RNA antisenso raccolti sia da cellule HeLa infettate dal virus vaccinia sia dal virus stesso, mediante accoppiamento di coloranti tramite amino allil LEO. Successivamente, illustriamo come purificare l'RNA etichettato e prepararlo per l'ibridazione nell'analisi mediante microarray dell'espressione genica.Nel precedente video di JoVE viene illustrato come eseguire l'isolamento dell'RNA totale da infezioni virali e i passaggi di amplificazione dell'RNA. Cominciamo dunque. Per iniziare l'etichettatura dell'RNA, aggiungere innanzitutto un microgrammo dei campioni di RNA A in provette microcentrifughe da 1,5 millilitri.Essiccare sotto vuoto i campioni a calore basso o nullo fino a completa asciugatura. Chiudere ogni provetta non appena è asciutta. È importante non eccessivamente essiccare i campioni dopo che sono asciutti.Aggiungere nove microlitri di buffer di accoppiamento a ogni provetta e risospendere l'RNA A mediante vortexaggio delicato per un minuto; centrifugare brevemente per raccogliere il campione sul fondo della prove

vaccinia-virus-infection-temporal-analysis-virus-gene-expression-part

Research

Ricerca

JoVE Journal

Biology

Biologia

Protocollo per vaccinia infezione di cellule HeLa e analisi di accoglienza e l'espressione genica virale. Parte 1 di 3.

Vaccino infezione da virus e analisi temporale di espressione genica del virus: Parte 1

Protocollo per vaccinia infezione di cellule HeLa e analisi di accoglienza e l'espressione genica virale. Parte 2 di 3.

Vaccino infezione da virus e analisi temporale di espressione genica del virus: Part 2

Fattori dell'ospite romanzo coinvolti nella infezione virale può essere identificato tramite cell-based genome-wide perdita della funzione di screening RNAi.

Lo screening RNAi per fattori di accoglienza che partecipano Vaccinia Infezione da virus utilizzando Drosophila Celle

Virus oncolitici sono promettenti per la terapia del cancro. La possibilità di accertare la infectability di campioni di tessuto ottenuti da pazienti dal vivo prima del trattamento è un vantaggio unico di questo approccio terapeutico. Questo protocollo descrive come processo di tessuti...

Ex infezione Vivo del tessuto Live con virus oncolitici

Descriviamo un protocollo per identificare i ruoli chiave di molecole di segnalazione di accoglienza nella replicazione litica di un herpesvirus modello, gamma herpesvirus 68 (γHV68). Utilizzando ceppi di topi geneticamente modificati e fibroblasti embrionali per γHV68 replica litico, il protocollo consente sia la caratterizzazione fenotipica e molecolare del virus interrogatorio interazioni ospite-in replicazione virale litico.

Dissezione Host-virus Interazione in replica litico di un Herpesvirus modello

Un metodo di tracciare neuroni sinapticamente collegate è descritto. Usiamo specificità TVA di una cella a monte per sondare se una popolazione di cellule riceve input sinaptico da tipi di cellule geneticamente definiti.

Viral Tracciamento di geneticamente definito circuiti neurali

Qui viene descritto un protocollo rapido e modulare per la generazione di virus vaccinia ricombinanti che esprimono simultaneamente proteine contrassegnate fluorescentmente utilizzando il metodo della selezione dominante transitoria.

Metodologia per la generazione efficiente di proteine del virus vaccinia taggate fluorescentmente

Descriviamo l'utilizzo di un virus vaccinia reporter fluorescente che consente la misurazione in tempo reale di infettività virale e l'espressione genica attraverso l'espressione specifica fase di fluorofori giornalista spettralmente distinti. Abbiamo dettaglio un metodo basato piastra per identificare con precisione la fase in cui la replicazione del virus è influenzato in risposta ad inibizione piccola molecola.

Vaccinia Reporter virus per quantificare Funzione virale in tutte le fasi di espressione genica

Qui, presentiamo i protocolli per identificare gli immunomodulatori 1) virus-messo che promuovono la replica da arbovirus e fattori ospite 2) eucariotica che limitano la replica da arbovirus. Questi metodi basati su fluorescenza e luminescenza permettono ai ricercatori di ottenere rapidamente letture quantitative della replica da arbovirus nelle analisi semplicistiche con bassi rapporti segnale-rumore.

Infezioni da arbovirus come strumenti di Screening per l'identificazione di fattori virali immunomodulatori e Host antivirale

ICP0 subisce la traslocazione nucleare--citoplasmico durante l'infezione HSV-1. Non è noto il meccanismo molecolare di questo evento. Qui descriviamo l'uso del microscopio confocale come uno strumento per quantificare ICP0 movimento nell'infezione di HSV-1, che getta le basi per analizzare quantitativamente ICP0 traslocazione in futuri studi meccanicistici.

Analisi temporale della traslocazione nucleare--citoplasmico di Herpes Simplex Virus 1 proteina mediante microscopia confocale immunofluorescente

Impara a marcare RNA antisenso da cellule HeLa infettate con virus vaccinia mediante accoppiamento amino-allyl di coloranti. Questo metodo prepara i campioni per l'analisi di espressione genica su microarray.

Vaccino infezione da virus e analisi temporale di espressione genica del virus: Parte 3

Esplora altri video