A lungo termine Imaging cellule di mammifero utilizzando Wide-Field Microscopia

In realtà, quello che farò è montarlo qui per primo e poi sostituire te. Quindi ora aspirerò cercando di essere il più delicato possibile. Okay. Alcuni secondi tenendo fermo. Okay. Va bene.

Le caratteristiche importanti della nostra griglia per l'imaging in tempo reale sono le seguenti: si tratta di un microscopio invertito, il che significa che l'obiettivo e i campioni qui presenti si trovano al di sotto dell'obiettivo. Pertanto, l'obiettivo è rivolto verso l'alto e l'intero microscopio, o quasi l'intero microscopio, compresi gli obiettivi e il campione, si trova a 37 gradi. Così, tutto all'interno di questa scatola di plastica è mantenuto a 37 gradi.

E proprio sopra il palchetto abbiamo una miscela di aria e CO2. Si tratta di CO2 al 5%. L'idea è che il campione si trovi effettivamente in una cella, simile a un incubatore per cellule.

E quindi abbiamo, questo è il nostro miscelatore per l'aria e la CO2 e, e viene umidificato e riscaldato, per poi essere convogliato sul campione presente sul palchetto. Ok. E oggi eseguiremo semplicemente la fluorescenza in un canale, la fluorescenza GFP. Questo è il tubo attraverso cui entra la CO2, al 5% di CO2, e si inserisce semplicemente nel supporto del palchetto.

Questo è importante. Poi possiamo chiudere questi, abbassarli e passare alla nostra prima posizione. Quello che farò è spostarmi sul primo campo, che è il mio campione di controllo, e sceglierò le posizioni in base a ciò che vedo sullo schermo.

Quindi mi assicuro sempre di guardare effettivamente nel microscopio in ogni nuova pozzetta, perché il piano focale per ciascuna pozzetta è diverso; infatti, il fondo della piastra non è perfettamente piatto. Pertanto, sarà necessario effettuare regolazioni fini quando ci si sposta da una pozzetta all'altra. Al momento mi trovo sulla prima pozzetta; ciò che farò ora è mettere a fuoco: ho appena acceso la luce, la luce trasmessa per il microscopio.

E ho verificato che tutta la luce sia indirizzata verso gli oculari. Quindi guardo semplicemente all'interno, per assicurarmi di ottenere un campo visivo nitido. Dopodiché, spengo quella luce, accendo la luce per la fluorescenza e verifico che le cellule che sto osservando appaiano sane e non apoptotiche.

E, e lo spengo. E quello che faccio successivamente è inviare, quindi ora inizierò a selezionare delle posizioni, il che significa che devo inviare il percorso della luce alla telecamera. Questa è la telecamera qui.

Quindi, chiedo al microscopio di inviare tutto alla fotocamera, in modo che non si veda nulla negli oculari. Quello che farò è selezionare, nel software di controllo del microscopio, il corretto insieme di filtri, che per le nostre esigenze è psy. Dopodiché, imposto un tempo di esposizione.

E conosco molto bene queste cellule e so che richiedono un tempo di esposizione di 0,2 secondi. Quindi indico al software di fare proprio questo. E quello che farò ora è premere il tasto messa a fuoco.

Questo è, ed è fondamentalmente vivo. Una luce si accenderà e tu puoi, oh, non so se riesci a vedere le cellule, ma il motivo per cui questo è un buon campo è perché tutte le cellule sono, anche in termini di fluorescenza, non ci sono cellule apoptotiche. Le cellule apoptotiche tendono ad essere molto luminose e non ci sono detriti o impurità nel campo.

E si può notare che, in realtà, questa è una cellula in metafase e questa è una cellula in metafase, mentre questa è una cellula che probabilmente ha appena terminato la mitosi. Lo riconosco perché sembra che questi due insiemi di cromatina siano orientati in modo molto ordinato l'uno rispetto all'altro. Come se avessero appena completato l'anafase.

Quindi questo è un buon campo. Ora che so che il tempo di esposizione e il set di filtri sono corretti, e questo dipenderà dal software utilizzato, andrò a selezionare delle posizioni e il software memorizzerà la posizione X, Y, Z di quel campo. Poi, quando sceglierò un altro campo, mentre seleziono nuovi campi, ma sempre nello stesso, beh, userò il, sposterò il, chiuderò lo shutter, aprirò lo shutter e controllerò cosa vedo sullo schermo, scegliendo i campi in base a ciò che osservo sullo schermo piuttosto che guardando direttamente attraverso l'oculare.

Quindi non vedo nessuno dei miei tonici lì dentro. Ma ancora una volta, anche se ben centrati, queste cellule attraverseranno il mio PS, continuo, ecco un buon esempio. Ecco un buon esempio di ciò che eviterei, vedi quanto è luminoso?

È molto luminoso. Probabilmente si tratta dei resti di una cellula apoptotica. Eviterei questo campo perché, essendo così luminoso, quando il software esegue l'autofocus, si concentrerà proprio su di esso e non sarà nello stesso piano di tutte le altre cellule.

Quindi non otterrò alcuna informazione da quel campo. Sembra buono. C'è una, questa è una profase qui, questa è una metafase.

Quindi, prenderò tre posizioni per ogni pozzetto. Quelle erano tre posizioni e ora passerò al mio prossimo pozzetto, quindi potete, quindi quello che probabilmente farò è acquisire immagini ogni 10 minuti. È un compromesso.

L'analisi dell'immagine in tempo reale è sempre un compromesso, vero? È necessario acquisire le immagini, ma allo stesso tempo si devono mantenere le cellule in buone condizioni, soprattutto se si è interessati alla mitosi. Pertanto, è fondamentale ridurre al minimo l'esposizione delle cellule alla luce fluorescente.

E, ma si desidera ottenere informazioni. Quindi è necessario acquisire immagini, si deve, quindi si deve fare un compromesso, si deve fare una scelta su cosa si vuole catturare, su quale tipo di informazione si desidera ottenere. Ai nostri fini, la mitosi richiede in genere circa un'ora.

Quindi, se consideriamo intervalli di 10 minuti, è piuttosto buono. Vediamo la profase, vediamo la metafase, vediamo l'anafase, e possiamo osservare quando ci sono trattamenti, farmaci o siRNA che influenzano questi specifici stadi del ciclo cellulare. Pertanto, ai nostri fini, è sufficiente, ma vogliamo sempre di più.

Vogliamo sempre più posizioni, o un tempo e un intervallo più fini, o qualcosa del genere. Quindi è un compromesso. Poi premerò avvio.

Quindi il nostro software esegue un passaggio di messa a fuoco automatica al primo tentativo. Non appena premo avvio, dovrebbe iniziare automaticamente la messa a fuoco automatica e vedrete l'otturatore aprirsi e chiudersi durante la messa a fuoco automatica. Quindi premo avvio.

Quindi, l'otturatore si sta aprendo e chiudendo. Il motore Z si sta attivando e sta effettivamente cercando il piano con il maggior contrasto, che corrisponderà al massimo fuoco. Si può effettivamente vedere sullo schermo l'immagine entrare e uscire dal piano di messa a fuoco migliore, il che potrebbe risultare preoccupante.

Quello che fa è muovere il motore Z per trovare il piano di messa a fuoco migliore, cioè quello con l'immagine più nitida. Successivamente acquisisce un'immagine in corrispondenza di tale posizione e memorizza la coordinata Z. Tale posizione Z verrà poi utilizzata per le successive 12 acquisizioni.

E poi eseguiremo nuovamente la fase di messa a fuoco automatica. Che tipo di esperimenti eseguono? Ok, quindi il nostro laboratorio è principalmente interessato a comprendere cosa regola la progressione mitotica, o almeno io sono particolarmente interessato a capire questo.

Quindi, grazie all'immagine in tempo reale di cellule vive e in particolare al nostro microscopio per acquisizioni a lungo termine in più posizioni, è possibile registrare le cellule per due o tre giorni mentre entrano e completano la mitosi, e si possono osservare diversi cicli mitotici consecutivi. In questo modo è possibile comprendere il processo. Successivamente, si possono aggiungere alle cellule farmaci, RNA o qualsiasi tipo di perturbazione che si desideri studiare, al fine di capire come tali farmaci o geni siano importanti nella regolazione del progresso mitotico.

Poiché non si tratta di un esperimento su cellule fissate ma su cellule vive, è possibile comprendere quando è necessario applicare una perturbazione per influenzare la mitosi e in quale stadio della mitosi tale effetto si manifesta. Per questo aspetto, il metodo è davvero potente. Quali sono gli elementi tecnici principali di questi esperimenti?

Quali sono i possibili problemi? Beh, il problema maggiore, oltre alla configurazione dell'apparato, è che configurare l'apparato non è affatto banale. Molte persone possiedono l'apparato, ma assicurarsi che funzioni correttamente per la propria applicazione richiede attenzione.

L'aspetto finanziario non è, come dire, trascurabile. Dunque, c'è l'allestimento dell'apparato sperimentale e, una volta raccolti i dati, c'è un vero problema di analisi dei dati. Prendiamo ad esempio i filmati: se si registrano 40 filmati, ognuno con 30 cellule, si hanno 40 campi appena filmati e ognuno di questi campi contiene 30 cellule; a quel punto bisogna sedersi davanti a ciascuno di questi filmati ed esaminare ogni singola cellula presente in ciascun filmato.

Quindi richiede molto tempo per eseguire l'analisi dei dati. Ecco perché occorre una settimana per analizzare i dati che sono stati raccolti in due giorni. Questo rappresenta un ostacolo molto grande in termini di raccolta di grandi quantità di dati.

Quindi, anche se si tratta di raccolta dati ad alto rendimento, non si tratta di analisi ad alto rendimento. Cosa occorrerebbe fare per rendere questo esperimento veramente ad alto rendimento? Il nostro laboratorio sta sviluppando un programma che esegue automaticamente l'analisi dei dati.

Ed è un programma piuttosto valido. Non è perfetto. L'occhio umano è sempre migliore, ma ci si sta avvicinando.

Allora, quali sono le interessanti applicazioni di questo esperimento? Magari altri campi che potete menzionare? Oltre alla divisione cellulare?

Intende per, oh, per l'immagineggiamento di cellule vive? Sì. Beh, è possibile eseguire saggi sulla motilità cellulare. Si può, a seconda della microscopia utilizzata, osservare come si muovono le cellule, oppure seguire lo sviluppo di un tumore, se lo si desidera veramente.

Ma lì, voi, voi siete, purché abbiate un sistema di imaging adeguato, potete, in pratica non avete limitazioni di sorta. Il nostro microscopio è semplicemente a campo largo e utilizziamo un obiettivo 20x20. È quindi un sistema a risoluzione piuttosto bassa, ma sufficiente per ciò che dobbiamo osservare.

Quindi, anche se esistono, di certo non ci sono limitazioni: qualsiasi tipo di esperimento dinamico, come quelli della biologia, trarrebbe notevole beneficio dall'imaging su cellule vive. Ad esempio, l'imaging del calcio, anche se non potrebbe essere effettuato sul nostro apparato, è un esempio di imaging su cellule vive.

Per questo hai sicuramente bisogno dell'immagine di cellule vive. Come ho detto, saggi su pazienti, saggi di motilità e tipi simili di analisi trarrebbero grande beneficio dall'imaging di cellule vive. Vorresti parlare brevemente della tua esperienza pregressa?

Da quanto tempo lavora a queste tecniche? A cosa ha lavorato precedentemente? Wow. Durante il mio dottorato non ho lavorato.

Ho svolto molta microscopia confocale, ma nessuna acquisizione di immagini in vivo. Durante il mio postdottorato, ho aiutato il dottor King a ottenere questo apparato che abbiamo appena utilizzato per allestire questi frammenti e metterlo in funzione. Così, durante il mio postdottorato, ho acquisito molta esperienza sia con la microscopia a campo chiaro con acquisizioni sequenziali temporali sul nostro microscopio, ovvero la microscopia a campo chiaro, sia con acquisizioni sequenziali temporali mediante microscopia confocale.

E direi che è davvero potente. Si ottiene molta informazione, ma non è facile farla funzionare perfettamente. Richiede quindi molta attenzione e una grande cura per i dettagli a ogni singolo passaggio del processo.

E, e poi hai comunque problemi. È quindi un'applicazione difficile, ma puoi ottenere risultati davvero preziosi, se è ciò di cui hai bisogno per studiare il tuo problema scientifico; sotto questo aspetto è di inestimabile valore, anche se complessa. Perciò, trova qualcuno che sappia ciò che sta facendo e avvalertene.

Questo è il mio consiglio. Così buono.