A lungo termine Imaging cellule di mammifero utilizzando Wide-Field Microscopia

In realtà quello che sto per fare, montalo qui prima e poi sostituisci Te. Quindi ora aspirerò cercando di essere il più delicato possibile. Ok. Pochi secondi solo in attesa. Va bene.

Quindi le caratteristiche importanti della nostra griglia di imaging dello stile di vita sono che, quindi, è un cannocchiale invertito, il che significa che l'obiettivo, i campioni qui nell'obiettivo sono sottostanti. Quindi l'obiettivo è rivolto verso l'alto e l'intero ambito, o praticamente tutto, praticamente l'intero ambito, compresi gli obiettivi e il campione sono a 37 gradi. Quindi tutto in questa scatola di plastica è a 37 gradi.

E proprio in cima al palco abbiamo una miscela di aria e CO2. Si tratta del 5% di CO2. Quindi l'idea è che il campione sia effettivamente in una cellula, è come un incubatore cellulare.

E così abbiamo, questo è il nostro miscelatore per l'aria e la CO2 e, e viene umidificato e riscaldato e poi convogliato sul campione sul palco. Ok. E oggi faremo solo fluorescenza GFP a un canale. Questo è il tubo in cui entrano la CO2 e il 5% di CO2 e si inserisce semplicemente nel supporto del palco.

Questo è importante. E poi possiamo chiuderli, rimuoverli, e poi andiamo alla nostra prima posizione. E quello che farò è andare al primo campo, che è il mio campione di controllo, e sceglierò le posizioni in base a ciò che vedo sullo schermo.

Quindi mi assicuro di guardare effettivamente nel microscopio in ogni nuovo, beh, perché il piano focale per ciascuno dei pozzetti è diverso, il, il piatto non è perfettamente piatto sul fondo. Quindi dovrai fare regolazioni fini quando ti sposti da un pozzo all'altro. Quindi in questo momento sono al primo, beh, quello che farò è mettere a fuoco, quindi ho semplicemente premuto, ho appena detto, ho semplicemente acceso la luce, la luce trasmessa per il microscopio.

E devo assicurarmi che tutta la luce vada agli oculari. E quindi guardo dentro, mi assicuro di avere un bel campo pulito. E poi quello che farò è spegnere quella luce, accendere la luce a fluorescenza, assicurarmi che le cellule che sto guardando abbiano un aspetto sano e non siano apoptotiche.

E, e lo spengo. E quello che faccio dopo è inviare, quindi ora inizierò a scegliere le posizioni, il che significa che devo inviare il percorso della luce alla telecamera. Questa è la fotocamera proprio qui.

Quindi dico al microscopio di inviare tutta la fotocamera, non vedono nulla negli oculari. Quello che farò è nel software che controlla il microscopio, sceglierò il giusto set di filtri, che per i nostri scopi è psy. E poi imposta un tempo di esposizione.

E conosco molto bene queste celle e so che richiedono un tempo di esposizione di 0,2 secondi. Quindi dico, è quello che dico al software di fare. E quello che farò è mettere a fuoco.

Questo è, ed è fondamentalmente semplicemente vivo. Il, Una luce si accenderà e potrete, oh, non so se riuscite a vedere le cellule, ma la ragione per cui questo è un buon campo è perché ci sono, tutte le cellule sono, anche in termini di fluorescenza, non ci sono cellule apoptotiche. Le cellule apoptotiche tendono ad essere molto luminose e non c'è sporcizia o schmutz sul campo.

E si può vedere che in realtà si tratta di una cellula di metafase e di una cellula di metafase, di una cellula che probabilmente è appena uscita dalla mitosi. E posso solo dire che, poiché sembra che lo siano, quei due set di cromatina sono molto ben orientati l'uno verso l'altro. Come se fossero appena usciti da una faccia.

Quindi questo è un buon campo. Quindi, e ora che so che il tempo di esposizione e il set di filtri sono corretti, e questo sarà specifico del software, andrò e prenderò le posizioni e ora il software ha memorizzato la posizione X, Y, Z di quel campo. E poi, quando scelgo un altro campo, è, e lo farò, quindi quando sto scegliendo, quando sto selezionando nuovi campi, ma nello stesso, beh, userò il, sposterò la i, girerò l'otturatore, aprirò l'otturatore e cercherò di vedere cosa vedo sullo schermo e sceglierò i campi in base a quello invece di guardare nel campo.

Quindi non vedo nessuno dei miei tonici lì dentro. Ma ancora una volta, anche ben centrate, queste cellule passeranno attraverso il mio PS Continuo, ecco un buon esempio. Ecco un buon esempio di ciò che eviterei, vedete quanto è luminoso?

È molto luminoso. Probabilmente sono i resti di una cellula apoptotica. E il motivo per cui lo eviterei è perché, dato che è così luminoso, quando il software mette a fuoco automaticamente, si concentrerà automaticamente solo su quello e non sarà sullo stesso piano di tutte queste altre celle.

E quindi non otterrò alcuna informazione da quel campo. Sembra carino. C'è un, questa è una metafase pro proprio qui, quella è una metafase.

Quindi, e prenderò tre posizioni per pozzo. Quindi erano tre posizioni e ora andrò al mio prossimo pozzo, quindi puoi farlo, quindi quello che probabilmente farò è scattare immagini ogni 10 minuti. Quindi è un compromesso.

L'imaging dello stile di vita è sempre un compromesso, giusto? Devi fare l'immagine, devi mantenere le cellule sane, soprattutto se sei interessato alla mitosi. Quindi devi ridurre al minimo la loro esposizione alla linea fluorescente.

E, ma vuoi ottenere informazioni. Quindi devi scattare immagini, devi, quindi devi scendere a compromessi, devi fare una scelta su ciò che vuoi catturare, che tipo di informazioni vuoi catturare. Per i nostri scopi, la mitosi tende a durare circa un'ora.

Quindi, se prendiamo intervalli di 10 minuti, è abbastanza buono. Vediamo la profase, vediamo la metafase, vediamo l'anafase, e possiamo, possiamo vedere quando ci sono, ci sono trattamenti o farmaci o siRNA che influenzano quelle specifiche fasi del ciclo cellulare. Quindi, per i nostri scopi, questo è sufficiente, ma vogliamo sempre di più.

Vogliamo sempre più posizioni o un tempo e un intervallo più precisi o qualcosa del genere. Quindi è un compromesso. Quindi, e poi premo start.

E così il nostro software, fa un passaggio di messa a fuoco automatica al primo passaggio. Quindi, una volta premuto start, dovrebbe avviare la messa a fuoco automatica automatica e vedrai l'otturatore aprirsi, aprirsi e chiudersi tra la messa a fuoco automatica. Quindi premerò start.

Quindi questa è l'apertura e la chiusura dell'otturatore. Il motore Z è coinvolgente e sta effettivamente cercando di trovare l'aereo con il maggior contrasto, che sarà il più a fuoco. Puoi effettivamente vedere sullo schermo che entra e esce dalla ricerca del miglior piano di messa a fuoco che potrebbe essere preoccupante.

Quindi quello che fa è che guida il motore Z per trovare il migliore, il più a fuoco sul piano di messa a fuoco, beh, il più nell'immagine. E poi acquisisce l'immagine lì e poi impara quella posizione Z. E poi useremo quella posizione Z per i prossimi 12 passaggi.

E poi faremo di nuovo il passaggio di messa a fuoco automatica. Che tipo di esperimenti fanno? Ok, quindi il nostro laboratorio è principalmente interessato a capire cosa regola la progressione mitica, o almeno io sono più interessato a capirlo.

Quindi, con l'imaging di cellule vive e in particolare con il nostro cannocchiale di imaging multiposizione a lungo termine, è possibile filmare le cellule per due o tre giorni entrando in mitosi e si possono visualizzare più cicli di mitosi in modo da poter capire. E poi si possono mettere farmaci o RNA o qualsiasi tipo di perturbazione sulle cellule che si desidera studiare. In questo modo si può capire come, in che modo questi farmaci o geni siano importanti nella regolazione della progressione mitotica.

Poiché non si tratta di un lavoro di cellule fisse e di un lavoro di cellule vive, è possibile capire cosa, quando è necessario avere una perturbazione per influenzare la mitosi o quale stadio della mitosi è interessato. Quindi è davvero potente in questo senso. Quali sono i principali elementi tecnici di questi esperimenti?

Quali sono i possibili problemi? Beh, il problema più grande oltre a quello di impostare il rig, non è banale. Molte persone hanno il rig, ma si assicurano che funzioni bene per la tua applicazione.

L'elemento finanziario non è, sai, non è piccolo. Quindi c'è la configurazione dell'apparato e poi, una volta raccolti i dati, c'è un vero problema di analisi dei dati. Ci vogliono questi filmati, se, così, se state raccogliendo 40 film ciascuno con 30 celle, quindi avete 40 in 40 campi che avete appena filmato e ognuno di questi campi ha 30 celle, allora dovete sedervi con ognuno di quei film e guardare ognuna di quelle cellule in quel film.

Quindi ci vuole molto tempo per fare l'analisi dei dati. E questo è il caso in cui ci vuole una settimana per analizzare i dati che ci sono voluti due giorni per raccogliere. Quindi c'è un ostacolo molto grande in termini di raccolta di molti dati.

Quindi non è, mentre si tratta di raccolta di dati ad alto rendimento, non è un'analisi ad alto rendimento. Quindi cosa faresti per rendere questo esperimento davvero ad alta produttività? Quindi il nostro laboratorio è in procinto di sviluppare un programma che esegue automaticamente l'analisi dei dati.

Ed è un programma abbastanza decente. Non è perfetto. L'occhio umano è sempre migliore, ma ci sta arrivando.

Quindi quali sono le interessanti applicazioni di questo esperimento? Forse altri campi che puoi citare? Oltre alla divisione cellulare?

Intendi per, oh, per l'imaging di cellule vive? Sì. Beh, è possibile eseguire saggi di motilità cellulare. Puoi, a seconda della microscopia che è coinvolta, puoi, sai, guardare come le cellule, potresti guardare lo sviluppo del tumore se lo volessi davvero.

Ma ecco, tu, sei tu, se finché hai la giusta configurazione di imaging, puoi, non sei praticamente limitato in termini di nulla. Il nostro campo d'azione sembra essere solo un ampio campo e usiamo un obiettivo 20 x 20. Si tratta quindi di una configurazione a risoluzione piuttosto bassa, ma è sufficiente per ciò che dobbiamo vedere.

Quindi ci sono, ma sicuramente non ci sono, non saresti limitato. Qualsiasi cosa che abbia un qualche tipo di esperimento dinamico, che è la biologia, sarebbe, trarrebbe davvero beneficio dall'imaging dello stile di vita. Quindi l'imaging del calcio, anche se non è possibile farlo sul nostro apparato, è una cellula viva.

Per questo è assolutamente necessario l'imaging di cellule vive. Come ho detto, i test sui pazienti, i test di motilità, questo tipo di cose trarrebbero davvero beneficio dall'imaging di cellule vive. Ti va di raccontare qualche parola sulla tua esperienza precedente?

Per quanto tempo lavori su queste tecniche? Su cosa lavoravi prima? Wow.So nel mio dottorato non ho lavorato.

Ho fatto molta microscopia confocale, ma nessuna imaging dello stile di vita. E così, durante il mio post-dottorato, ho aiutato il Dr. King a mettere in funzione questo apparecchio che abbiamo usato per impostare questi frammenti. E, durante il mio post-dottorato, ho avuto molta esperienza sia con l'imaging widefield con TimeLapse sul nostro oscilloscopio, che è il widefield, sia con l'imaging TimeLapse con microscopia confocale.

E direi che è davvero potente. Si ottengono molte informazioni, ma non è facile farlo funzionare perfettamente. Quindi richiede davvero molta attenzione e molta attenzione ai dettagli in ogni piccola fase del processo.

E poi hai ancora problemi. Quindi è un'applicazione difficile, ma si può davvero ottenere, se, se è ciò di cui si ha bisogno, studiare il proprio problema, il proprio problema scientifico, allora è inestimabile in questo senso, ma è difficile. Quindi trova qualcuno che sappia cosa sta facendo e usalo.

Questo è il mio consiglio. Troppo bene.