Name: Dissezione lordo e Arti di epiteli sensoriali dellorecchio interno in adulti Zebrafish ( Danio rerio) (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2009-05-08T00:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 3 s
Description: Impara la dissezione lorda e fine degli epiteli sensoriali dell'orecchio interno in zebrafish adulti (Danio rerio). Questo metodo consente di isolare i tessuti per studiare la rigenerazione delle cellule ciliate nei vertebrati.

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Questa ricerca è stata sostenuta dal Programma di ricerca intramurale del National Human Genome Research Institute, National Institutes of Health.

Parte 1: Preparazione del tessuto <ol><li> Euthanize il pesce zebra adulti con tamponata MS-222 (3-etil aminobenzoate sale metanosolfonato, 0,03%). </li><li> Decapitare il pesce. Tagliare la mascella inferiore, posizionare la testa sul pad dissezione con il lato ventrale, e immobilizzare il tessuto con perni insetti. Rimuovere il tessuto molle ventrale al cranio e crack aprire la parte ventrale della capsula cranio con un paio di pinzette bene al microscopio di dissezione. </li><li> Fissare la testa di pesce in paraformaldeide (4%) a 4 ° C durante la notte. </li><li> Sciacquare la testa fissa pesce in PBS (Phosphate Buffered Saline, 1X) per 3 volte, a 5 minuti ogni volta. </li></ol> Parte 2: dissezione lordo dell&#39;orecchio interno <ol><li> Posizionare la testa di pesce sul pad dissezione con l&#39;alto lato ventrale. Immobilizzarla con i perni di insetti. Tutte le fasi che seguono sono svolte sotto il microscopio di dissezione. </li><li> Con un paio di pinzette fine, togliere l&#39;osso del cranio sopra l&#39;orecchio interno e quindi estrarre delicatamente i tessuti dell&#39;orecchio interno: sacculi, lagenae e otricoli. Il sacculo e lagena sono strettamente collegare gli uni agli altri e quindi tirare fuori insieme mentre il utricolo (anteriore al sacculo e lagena), molto probabilmente per essere distaccato dagli organi altra estremità durante la dissezione. </li><li> Mettete i tessuti dell&#39;orecchio interno in PBS (1X). Se non dissezione ulteriore fine è necessario, lavare il tessuto 2-3 volte con PBS (1X) e può essere utilizzato per altri esperimenti, criosezioni ad es. </li></ol> Parte 3: dissezione fine degli epiteli sensoriali dell&#39;orecchio interno <ol><li> La dissezione multa può essere effettuata in una goccia di PBS (1X) su un vetrino pulito. </li><li> Rimuovere il otoliti utricular dal utricolo con due paia di pinzette fine, e, se necessario, tagliare la non-sensoriale tessuto epiteliale e l&#39;innervazione dal epiteli con un paio di pinzette e una lama sottile ago. </li><li> Rimuovere il otoliti lagenar prima di separarsi sacculare e lagenar epiteli, mentre cercate di mantenere il sacculo tutto il più intatto possibile. Posizionare il tessuto in calo PBS fino lato ventrale. Usare la lama per tagliare l&#39;ago con attenzione tra il sacculo e lagena. Tagliare l&#39;eccesso non-sensoriale tessuto epiteliale e la innvervation con le pinzette e la lama sottile ago, se lo si desidera. </li></ol> Parte 4: colorazione fluorescente delle cellule ciliate della epiteli sensoriali <ol><li> Sciacquare gli epiteli sensoriali con PBT (1XPBS e 1% Triton X-100) per 3 volte, 5 minuti ogni volta. </li><li> Incubare gli epiteli con fluophore marcato falloidina (ad esempio 488 Farina Alexa falloidina, diluizione 1:1000) per 30 minuti a temperatura ambiente. </li><li> Sciacquare gli epiteli sensoriali con PBT per 3 volte, a 10 min ogni volta. </li><li> Montare il epiteli su un vetrino con il montaggio di medie e controllare il tessuto colorato sotto il microscopio a fluorescenza con filtri della lunghezza d&#39;onda appropriata. </li><li> Dopo la dissezione di successo e colorazione, epiteli intatto con una forte colorazione fascio di cellule dei capelli può essere visto al microscopio (Fig. 1). </li></ol><img src="/files/ftp_upload/1211/fig1.png" alt="Figura 1" /> Figura 1. Cellule ciliate dell&#39;epitelio sacculare sensoriali sono state colorate con farina di Alexa 488 falloidina (Verde). Il campione di tessuto è stato dissezionato e macchiato, come indicato nel documento. Diverse immagini sono state scattate in diverse posizioni del campione e piastrellato con Adobe Photoshop 7.0. Barra di scala = 150μm.

In questo protocollo, abbiamo descritto la dissezione lordo e fine degli epiteli sensoriali dell&#39;orecchio interno di zebrafish per adulti, che ci permette di preparare i campioni di tessuto per lo studio della funzionalità cellulare e subcellulare degli epiteli sensoriali. Al fine di realizzare una dissezione di successo, il primo passo, la fissazione, è molto importante. Assicurarsi di utilizzare sempre la soluzione paraformaldeide preparata perché vecchia soluzione si tradurrà in sotto...

<table><tbody><tr><td>MS222 (Etilesal di 3-amminobenzoato metanosolfonico)</td><td>Reagente</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A5040</td><td></td></tr><tr><td>PBS (Soluzione salina tamponata al fosfato, 10X)</td><td>Reagente</td><td>Mediatech, Inc.</td><td>46-013-CM</td><td></td></tr><tr><td>Paraformaldeide</td><td>Reagente</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P-6148</td><td></td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Reagente</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T8787</td><td></td></tr><tr><td>Alexa Fluor 488 phalloidina</td><td>Reagente</td><td>Invitrogen</td><td>A12379</td><td></td></tr><tr><td>VECTASHIELD Hard Set Mounting Medium con DAPI</td><td>Reagente</td><td>Vector Laboratories</td><td>H-1500</td><td></td></tr><tr><td>Microscopio per dissezione</td><td>Microscopio</td><td>Nikon Instruments</td><td>SMZ1000</td><td></td></tr><tr><td>Puntine da insetto</td><td>Strumento</td><td>Fine Science Tools</td><td>26000-40</td><td></td></tr><tr><td>Forbici</td><td>Strumento</td><td>Roboz Surgical Instruments Co.</td><td>RS-5880</td><td></td></tr><tr><td>Pinzette</td><td>Strumento</td><td>Roboz Surgical Instruments Co.</td><td>RS-5045</td><td></td></tr><tr><td>Lama a ago</td><td>Strumento</td><td>Sharpoint</td><td>78-6810</td><td></td></tr><tr><td>Microscopio a fluorescenza</td><td>Microscopio</td><td>Carl Zeiss, Inc.</td><td>Axiovert 200M</td><td></td></tr><tr><td>Tappetino per dissezione</td><td>Strumento</td><td>eNasco</td><td>SB07840M</td><td></td></tr><tr><td>Zebrafish</td><td>Animale</td><td>Varie</td><td>n/d</td><td></td></tr></tbody></table>

dissezione lordo e arti di epiteli sensoriali dell&#39;orecchio interno in adulti zebrafish ( danio rerio)

Gross and Fine Dissection of Inner Ear Sensory Epithelia in Adult Zebrafish (Danio rerio)

Epiteli neurosensoriale nell&#39;orecchio interno sono le strutture fondamentali per le funzioni dell&#39;udito e dell&#39;equilibrio. Pertanto, è importante capire le caratteristiche cellulari e molecolari degli epiteli, che sono principalmente composti da due tipi di cellule: cellule ciliate (HC) e le cellule di supporto (SC). Qui abbiamo scelto di studiare gli epiteli sensoriali dell&#39;orecchio interno in zebrafish adulti non solo perché le strutture epiteliali sono altamente conservati in tutti i vertebrati studiati, ma anche perché il pesce zebra adulto è in grado di rigenerare HC, una capacità che i mammiferi perdere poco dopo la nascita. Usiamo l&#39;orecchio interno di zebrafish adulti come sistema modello per studiare i meccanismi di rigenerazione dell&#39;orecchio interno HC nei vertebrati adulti che potrebbero essere utili per la terapia clinica dell&#39;udito / deficit in equilibrio umano a causa della perdita di HC. Qui mostriamo come fare dissezioni lordo e multa di epiteli sensoriali dell&#39;orecchio interno in zebrafish adulti. La dissezione lordo rimuove i tessuti circostanti l&#39;orecchio interno ed è utile per la preparazione di sezioni di tessuto, che ci permette di esaminare la struttura dettagliata degli epiteli sensoriali. La dissezione multa pulisce il non-senso-tessuti epiteliali epitelio di ogni individuo e ci permette di esaminare l&#39;eterogeneità dell&#39;epitelio tutto facile per intero-mount campioni epiteliali.

L&#39;epitelio dell&#39;orecchio interno sensoriale del pesce zebra adulta è un sistema di buon modello per la comprensione dei meccanismi di rigenerazione delle cellule dei capelli nei vertebrati adulti. Questo protocollo dimostra la dissezione belle degli epiteli, attraverso il quale possiamo ottenere campioni di tessuto per lo studio degli eventi rigenerativi a livello cellulare e subcellulare.

Dissezione lordo e Arti di epiteli sensoriali dell&#39;orecchio interno in adulti Zebrafish ( Danio rerio)

Gli epiteli neurosensoriali dell'orecchio interno sono le strutture fondamentali per le funzioni dell'udito e dell'equilibrio. Pertanto, è importante comprendere il...

Nell'orecchio interno del pesce zebra, sono presenti tre paia di sacche, simili a organi terminali, ovvero l'utricolo, l'S e la Lana. L'utricolo si trova nella posizione più anteriore, mentre l'S e la lega sono strettamente aderenti l'una all'altra e si trovano posteriormente rispetto all'utricolo. Dopo la dissezione macroscopica, l'S e la lega rimangono attaccate e la struttura pietrosa denominata otolite può essere facilmente osservata in ciascun organo terminale durante la successiva dissezione fine. L'S e la lega vengono separate l'una dall'altra praticando un taglio dal lato ventrale.Gli otoliti vengono rimossi e i tessuti epiteliali non sensoriali vengono eliminati per ottenere i tessuti epiteliali sensoriali dai tre organi endocrini. Ciao, sono Jean Leon del laboratorio di Sean Burgess, sezione di genomica dello sviluppo presso l'Istituto Nazionale per la Ricerca sul Genoma Umano. Oggi vi mostreremo un procedimento per la dissezione fine e accurata degli epiteli sensoriali dell'orecchio interno dal pesce zebra adulto.Utilizziamo questo procedimento nel nostro laboratorio per studiare l'espressione genica nell'epitelio sensoriale dell'orecchio interno. Cominciamo dunque. Per

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Biologia

Questo protocollo descrive una procedura per l'individuazione e organi da sezionare il pesce zebra adulto.

Dissezione di organi dal Zebrafish adulti

Questo articolo descrive un approccio alla microdissect retine zebrafish con e senza epitelio pigmentato retinico collegato, da una a tre embrioni postfertilization giorni.

Microdissezione dei tessuti oculari Zebrafish embrionali

Un chiaro, metodo standardizzato per la dissezione e l'isolamento del cuore zebrafish a più stadi di sviluppo sono descritti. Tecniche di annotazione e la quantificazione vengono anche discussi.

Dissezione di cuore in larvale, Zebrafish giovanile e degli adulti, Danio rerio</em

Lo scopo di questo video è dimostrare procedure per ottenere cellule sane capelli intatte dagli organi dell'orecchio interno di zebrafish adulti e poi li utilizzano per studi di patch clamp per caratterizzare le proprietà biofisiche di loro canali voltaggio-dipendenti.

Registrazioni patch clamp in cellule interne dell&#39;orecchio Capelli Isolato da Zebrafish

Questo documento descrive come un zebrafish adulto può essere immobilizzata, intubato, e utilizzati per esperimenti di elettrofisiologia in vivo per permettere registrazioni e manipolazione di attività neurale in un animale intatto.

Registrazione elettrofisiologica nel cervello di intatto Zebrafish adulti

Poiché molti modelli di zebrafish di malattie neurologiche e non neurologiche sono studiate nei pesci adulti piuttosto che l'embrione / larve, abbiamo sviluppato una linea laterale rigenerativo dosaggio quantitativo che può essere applicato a modelli di malattia di zebrafish adulto. Il saggio coinvolto risoluzione al neuromast 1) e 2) livelli di cellule singolo capello.

Un test per Lateral Rigenerazione Line in Zebrafish adulti

La microscopia elettronica 2D su larga scala (EM), o nanotomia, è l'applicazione tissutale della risoluzione EM su scala nanometrica. Qui descriviamo un metodo universale per la nanotomia applicato per studiare il cervello larvale di zebrafish in salute e su lesioni cerebrali non invasive.

Su larga scala scansione microscopia elettronica a trasmissione (Nanotomy) di sana e feriti Zebrafish Cervello

Qui, presentiamo una serie standardizzata dei protocolli per osservare il solco superiore oculare, una struttura recentemente identificato, evolutivamente conservata nell'occhio dei vertebrati. Utilizzando larve di zebrafish, dimostriamo le tecniche necessarie per identificare i fattori che contribuiscono alla formazione e alla chiusura del solco superiore oculare.

Visualizzazione del solco superiore oculare durante l'embriogenesi Danio rerio

Qui, presentiamo un protocollo che semplifica la misurazione della luce dell'elettroretinogramma evocato le risposte dallo zebrafish larvale. Un elettrodo di romanzo spugna a forma di cono-Punta può contribuire a rendere lo studio di sviluppo visivo in zebrafish larvale utilizzando l'elettroretinogramma ERG più facile raggiungere con risultati attendibili e costi inferiori.

Registrazione dell'elettroretinogramma in Zebrafish larvale con elettrodo di spugna-punta conica A romanzo

Viene descritto un modello di lesione cerebrale meccanica nel pesce zebra adulto per studiare i meccanismi molecolari che regolano la loro elevata capacità rigenerativa. Il metodo spiega di creare una ferita da taglio nel tectum ottico di più specie di piccoli pesci per valutare le risposte rigenerative utilizzando l'immunocolorazione fluorescente.

Modello di lesione da coltellata del tectum ottico adulto utilizzando zebrafish e medaka per l'analisi comparativa della capacità rigenerativa

L'articolo spiega come rimuovere chirurgicamente gli occhi dalle larve viventi di zebrafish come primo passo verso lo studio di come l'input retinico influenza la crescita e lo sviluppo del tectum ottico. Inoltre, l'articolo fornisce informazioni sull'anestesia larvale, la fissazione e la dissezione cerebrale, seguite da immunoistochimica e imaging confocale.

Rimozione dell'occhio nelle larve di zebrafish viventi per esaminare la crescita dipendente dall'innervazione e lo sviluppo del sistema visivo

Impara la dissezione lorda e fine degli epiteli sensoriali dell'orecchio interno in zebrafish adulti (Danio rerio). Questo metodo consente di isolare i tessuti per studiare la rigenerazione delle cellule ciliate nei vertebrati.

Dissezione lordo e Arti di epiteli sensoriali dell'orecchio interno in adulti Zebrafish ( Danio rerio)

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