Name: Vivere Imaging of the Brain Zebrafish embrionali da microscopia confocale (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2009-04-01T00:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 11 s
Description: Scopri l'imaging in vivo del cervello embrionale di Danio rerio mediante microscopia confocale a risoluzione cellulare. Questa tecnica consente di studiare la morfogenesi cerebrale nei vertebrati con dettaglio a singola cellula.

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Molte grazie a Dr. Jennifer Gutzman che per primo ha sviluppato questa tecnica in laboratorio Sive. Grazie anche a JB Verde presso il Dana-Farber Cancer Institute di Boston, MA che ha gentilmente fornito la codifica plasmide CAAX GFP-mRNA. L&#39;imaging confocale è stato condotto presso il WM Keck Foundation Imaging Fondo Biologiche presso l&#39;Whitehead. HS è supportato da NIHMH70926. EG è supportato da un pre-dottorato NSF.

1. Preparazione del mRNA per iniezione <ol><li> L'mRNA utilizzati in questa procedura è trascritto da un plasmide codifica CAAX-eGFP (memGFP) mRNA. In primo luogo linearizzare il plasmide secondo Gutzman et al, 2008. </li><li> Poi trascrivere mRNA memGFP utilizzando il mMessage mMachine kit. </li><li> Diluire l'mRNA risultante 1μg/μl, aliquota, e conservare a -80 ° C. </li><li> Preparare uno stampo ad iniezione di 1% agarosio con corsie della larghezza di embrioni allo stadio di una cellula. </li><li> Il giorno prima dell'iniezione, istituito gabbie accoppiamento che separa il maschio dalla femmina. </li><li> Il giorno di iniezione, tirare aghi capillare con un estrattore micropipetta per preparare l'iniezione. </li></ol> 2. Iniezione del mRNA <ol><li> Il giorno di iniezione, disgelo un'aliquota di mRNA memGFP 1μg/μl sul ghiaccio. </li><li> Diluire il mRNA 1:5 in acqua per una concentrazione finale di 200ng/μl, e tenere in ghiaccio. </li><li> Caricare l'ago capillare con 1ml di mRNA memGFP preparati a 200ng/μl. </li><li> Luogo carico ago in un micromanipolatore collegato a un alimentati a gas microinjector. </li><li> Regolare il volume di iniezione di 1nl. </li><li> Tirare i divisori di pesce di tipo selvatico in gabbia accoppiamento del giorno precedente. </li><li> Raccogliere gli embrioni non appena sono previste. Orientarle nello stampo ad iniezione agarosio coperto da media embrione (Westerfield, 1995) con la singola cella sul lato opposto del micromanipolatore. </li><li> Iniettare attraverso il corion e tuorlo in modo tale che l'mRNA viene depositato direttamente nella cella singola. Iniettare circa 50 embrioni per sperimentare. Non iniettare se la cella ha diviso. </li><li> Embrioni incubare a 28 ° C per una notte in media embrione </li></ol> 3. Montaggio e embrioni Imaging <ol><li> Per montare l'immagine e gli embrioni, rimuovere il corion con una pinza da embrioni sotto uno stereomicroscopio un'ora prima del punto di tempo di interesse. </li><li> Preparare un vetrino per il montaggio fino a 4 embrioni. <ul><li> Usare l'aspiratore grasso al silicone per sigillare un coprioggetto sulla parte inferiore di un apposito 2mm scivolo di plastica con un foro di circa 1 cm di diametro. </li><li> Riempire il buco nella diapositiva con il 0,7% di agarosio, e lasciate riposare circa 20 minuti o fino a quando indurito </li><li> Una volta che l'agarosio si è solidificato, rimuovere una piccola spina con 200μl puntali per formare fori cilindrici in cui montare ogni embrione. </li></ul></li><li> Mettere gli embrioni in agarosio pieno vetrino sotto un microscopio da dissezione. Aggiungere 50μl di tricaine (Westerfield, 1995) per anestetizzare gli embrioni. </li><li> Usare pinze per posizionare gli embrioni nei fori cilindrici in agarosio con il cervello o la regione di interesse contro il coprioggetto sottostante. </li><li> Coprire gli embrioni in agarosio con un altro vetrino fissato con grasso al silicone vuoto. </li><li> Immagine l'embrione utilizzando un invertito, fluorescente, laser-scanning o spinning microscopio confocale disco. Immagine a 63x o superiore per raccogliere immagini ad alta risoluzione di singole cellule all'interno del neuroepitelio. </li><li> Le immagini vengono esportate come file TIFF dal software LSM e analizzati utilizzando Photoshop. </li></ol> 4. Risultati rappresentante / Esito Mostrato nella Figura 1 è un'immagine rappresentativa confocale di un neuroepitelio 24 zebrafish hpf tra il mesencefalo e romboencefalo ventricoli. Ogni cella è etichettato con membrana GFP. <img src="/files/ftp_upload/1217/1217fig1.jpg" alt="" width="450" height="449"> Figura 1. Vivere l'imaging confocale di un memGFP a iniezione 24 embrione zebrafish HPF. (A) neuroepitelio di un embrione di 24 HPF con ogni cella delineato da GFP. Regione ripreso separa il mesencefalo e romboencefalo ventricoli (M, H rispettivamente), che formano il mesencefalo-rombencefalo confine.

<ol><li>Gutzman, J. H., Graeden, E., Sive, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Formation+of+the+zebrafish+midbrain-hindbrain+boundary+constriction+requires+laminin-dependent+basal+constriction%5BTitle%5D)+AND+%22Mech+Dev%22%5BJournal%5D)">Formation of the zebrafish midbrain-hindbrain boundary constriction requires laminin-dependent basal constriction.</a> Mech Dev. 125 (974), 11-12 (2008).</li>
<li>Westerfield, M. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aWesterfield%2C+M+%22The+Zebrafish+Book%3A+a+Guide+for+the+Laboratory+Use+of+Zebrafish%22">The Zebrafish Book: a Guide for the Laboratory Use of Zebrafish</a>. , University of Oregon Press. Eugene, Oregon. (1995).</li>
</ol>

In questo video, si dimostra un metodo per iniezione di mRNA in embrioni di zebrafish singola cellula. Qui, usiamo mRNA codifica una membrana mirati GFP di etichettare ogni cella. Abbiamo poi dimostrare come montare e immagine lo sviluppo del cervello a risoluzione singola cellula. Questa tecnica ci ha permesso di studiare un nuovo tipo di cella di cambiare forma, costrizione basale, necessari per la formazione del mesencefalo-romboencefalo confine (Gutzman et al, 2008). Un&#39;analisi simile di altri fenomeni ha il pot...

<table><tbody><tr><td>Agarosio SeaKem GTG</td><td> Reagente</td><td>Lonza Inc.</td><td>50027</td><td></td></tr><tr><td>Etil estere dell'acido 3-aminobenzoico (Tricaina)</td><td>Reagente</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A-5040</td><td></td></tr><tr><td>Tubuli capillari</td><td>Strumento</td><td>Frederick Haer and Co.</td><td>30-30-1</td><td>Borosil 1,0 mmOD x 0,5 mmID/fibra 100 mm</td></tr><tr><td>Grasso per vuoto al silicone</td><td>Reagente</td><td>VWR international</td><td>W0S717</td><td></td></tr><tr><td>Pinzette</td><td>Strumento</td><td>Fine Science Tools</td><td>11232-20</td><td>Dumont n. 5 Bio Inox</td></tr><tr><td>Punte per pipetta 1-200 &amp;mu;l</td><td>Strumento</td><td>USA Scientific, Inc.</td><td>111-0806</td><td>Sono della dimensione corretta per embrioni a 24 hpf. </td></tr><tr><td>Kit di trascrizione mMessage mMachine</td><td>Reagente</td><td>Ambion</td><td>AM1340</td><td>Polimerasi RNA SP6</td></tr><tr><td>Confocale a scansione Zeiss LSM 510</td><td>Microscopio</td><td>Carl Zeiss, Inc.</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Micromanipolatore</td><td>Strumento</td><td>Narishige International</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Microiniettore</td><td>Strumento</td><td>Harvard Apparatus</td><td>PLI-100</td><td></td></tr><tr><td>Tiratore di micropipette</td><td>Strumento</td><td>Sutter Instrument Co.</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

vivere imaging of the brain zebrafish embrionali da microscopia confocale

Live Imaging of the Zebrafish Embryonic Brain by Confocal Microscopy

In questo video, dimostriamo il metodo nostro laboratorio ha sviluppato per analizzare i cambiamenti delle cellule forma e riarrangiamenti necessari per piegare e ripiegare il cervello pesce zebra di sviluppo (Gutzman et al, 2008). Tale analisi offre una nuova comprensione della biologia cellulare di base necessari per lo sviluppo della struttura 3D del cervello dei vertebrati, e aumenta notevolmente la nostra capacità di studiare la morfogenesi del tubo neurale. Il cervello ha la forma embrionale di zebrafish con inizio alle 18 ore dopo la fecondazione (HPF), come i ventricoli all&#39;interno del neuroepitelio gonfiare. Da 24 HPF, i passi iniziali della morfogenesi del tubo neurale sono completi. Utilizzando il metodo descritto qui, gli embrioni allo stadio di una cellula sono iniettati con mRNA codifica membrana mirati proteina verde fluorescente (memGFP). Dopo l&#39;iniezione e l&#39;incubazione, l&#39;embrione, ormai tra i 18 ei 24 HPF, è montato, capovolta, in agarosio e fotografato al microscopio confocale. In particolare, l&#39;embrione di zebrafish è trasparente che lo rende un sistema ideale per l&#39;imaging a fluorescenza. Mentre le nostre analisi si sono concentrate sul mesencefalo e il romboencefalo confine romboencefalo, questo metodo potrebbe essere esteso per l&#39;analisi di qualsiasi altra regione del zebrafish ad una profondità di 80-100 micron.

In questo video, si dimostra un metodo con cui analizzare il cervello dei vertebrati sviluppo in embrioni di zebrafish dal vivo a una risoluzione singola cellula al microscopio confocale. Questo include il metodo con cui iniettare il unicellulare zebrafish e, successivamente, montare e immagine lo sviluppo del cervello.

Vivere Imaging of the Brain Zebrafish embrionali da microscopia confocale

In questo video, dimostriamo il metodo sviluppato dal nostro laboratorio per analizzare i cambiamenti della forma cellulare e i riarrangiamenti necessari per piegare e ripiegare il...

Questa procedura inizia con l'iniezione di un embrione di pesce zebra a singola cellula posizionato in uno stampo per iniezioni in modo che la cellula sia orientata in direzione opposta rispetto all'apparato di iniezione. Gli embrioni vengono quindi iniettati con mRNA mediante un ago che attraversa il tuorlo ed entra nella cellula. Il giorno successivo.Una piastrina di montaggio in plastica viene riempita con aros. Un embrione anestetizzato viene quindi posizionato capovolto in un foro negli aros e osservato mediante microscopia confocale. Ciao, sono Grabham del laboratorio della dottoressa Hazel Sieve presso l'Istituto Whitehead per la Ricerca Biomedica e il dipartimento di biologia del MIT.Oggi vi mostreremo un procedimento per iniettare embrioni di pesce zebra allo stadio a singola cellula e per l'imaging in tempo reale del cervello mediante microscopia confocale. Nel nostro laboratorio, utilizziamo questo procedimento per studiare la morfogenesi del cervello nei vertebrati a risoluzione di singola cellula. Cominciamo dunque.L'mRNA utilizzato in questa procedura è trascritto da un plasmide che codifica per la proteina GFP legata alla membrana C-A-X-E-G-F-P-R-N-A-A. Prima linearizzare il plasmide mediante digestione con not uno, quindi trascrivere l'mRNA della GFP legata alla membrana a partire dal plasmide linearizzato utilizzando il kit M message e machine. Dopo che l'mRNA è stato trascritto, quantificare, diluire l'mRNA risultante in acqua fino a una concentrazione di un microgrammo per microlitro, aliquotare e conservare a meno 80 gradi Celsius fino al momento dell'uso. Il giorno precedente l'iniezione, preparare gabbie per l'accoppiamento, separando i maschi dalle femmine nel giorno dell'iniezione. Utilizzare uno strumento apposito per micropipette per tirare a punta gli aghi capillari destinati all'iniezione.Preparare uno stampo per iniezione al 1% di agarosio con corsie larghe quanto gli embrioni allo stadio a una cellula nel giorno dell'iniezione, scongelare un'aliquote di mRNA per GFP della membrana a una concentrazione di un microgrammo per microlitro su ghiaccio. Diluire l'mRNA in rapporto 1:5 in acqua fino a una concentrazione finale di 200 nanogrammi per microlitro e mantenere sul ghiaccio. Caricare l'ago capillare con un microlitro di mRNA per GFP della membrana preparato a 200 nanogrammi per microlitro.Qui aggiungiamo il rosso fenolo allo 0,05% all'mRNA per renderlo visibile durante le iniezioni. Posizionare l'ago caricato su un micromanipolatore collegato a un microinjector a gas. Regolare il volume di iniezione a un nanolitro.Successivamente, rimuovere le partizioni dai pesci di tipo selvatico allestiti il giorno precedente in gabbie per l'accoppiamento. Raccogliere gli embrioni non appena vengono deposti. Riempire lo stampo per iniezioni AGA rose con mezzo per embrioni e posizionare gli embrioni nello stampo con una singola cellula rivolta verso il lato opposto al micro manipolatore.Iniettare attraverso il corione e il tuorlo in modo che l'mRNA venga depositato direttamente nella singola cellula. Iniettare circa 50 embrioni per esperimento. Tuttavia, se la cellula si è già divisa, non procedere con l'iniezione; dopo aver iniettato gli embrioni, incubarli a 28 gradi Celsius durante la notte in mezzo per embrioni.Dopo l'incubazione notturna, gli embrioni iniettati sono pronti per essere montati e osservati al microscopio. Per iniziare questa procedura, rimuovere la coriona dagli embrioni con pinzette sotto un microscopio stereoscopico un'ora prima del punto temporale di interesse e preparare un vetrino per montare fino a quattro embrioni. Successivamente, riempire il vetrino con aros allo 0,7% fino al bordo superiore del vetrino e attendere circa 20 minuti o fino a quando l'aros si solidifica.Una volta che l'aros si è solidificato, praticare un piccolo foro nell'aros utilizzando la punta di una pipetta da 200 microlitri per creare dei fori cilindrici in cui posizionare ciascun embrione. Rimuovere i tappi di aros con le pinzette prima del montaggio. Posizionare gli embrioni sulla diapositiva riempita con aros sotto un microscopio stereoscopico.Aggiungere 50 microlitri di trica per anestetizzare gli embrioni. Utilizzare pinzette per orientare gli embrioni capovolti nei fori cilindrici degli aros, con il cervello o la regione di interesse a contatto con il vetrino sottostante.Gli embrioni nell'AGA vengono sollevati con un altro coprioggetto e fissati con grasso da vuoto al silicone. Gli embrioni sono ora pronti per l'acquisizione delle immagini. Acquisire l'immagine dell'embrione utilizzando un microscopio confocale a scansione laser fluorescente invertito come mostrato qui, oppure un microscopio confocale a disco rotante con un ingrandimento di 63 x o superiore per raccogliere immagini ad alta risoluzione di singole cellule all'interno dell'epitelio neuro.Le immagini vengono esportate come file TIF dal software LSM e analizzate utilizzando Photoshop. Questa è un'immagine confocale rappresentativa di un embrione di pesce zebra a 24 ore, nell'epitelio neuroettodermico compreso tra i ventricoli del mesencefalo e del romboencefalo. M indica il mesencefalo e il relativo ventricolo, mentre H indica il ventricolo del romboencefalo.Ogni cellula è marcata con GFPE legato alla membrana. Abbiamo appena illustrato una tecnica che consente di analizzare il cervello dello zebrafish in via di sviluppo a risoluzione cellulare singola. Questa tecnica ci ha permesso di studiare un nuovo tipo di cambiamento della forma cellulare chiamato restringimento basale BA.Potrebbe inoltre essere utilizzato per analizzare altri tipi di fenomeni e per ampliare significativamente la nostra comprensione dell'organogenesi delle vertebre, nonché della biologia cellulare sottostante. È tutto. Grazie per aver guardato e buona fortuna con i vostri esperimenti.

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Questo protocollo descrive l'imaging di singoli neuroni o cellule della cresta neurale nel vivere embrioni di zebrafish. Questo metodo è utilizzato per esaminare i comportamenti e la localizzazione cellulare di actina mediante fluorescenza confocale microscopia time-lapse.

Immagini dal vivo della motilità cellulare e citoscheletro dei singoli neuroni e cellule della cresta neurale in embrioni di zebrafish

Chiave per comprendere i processi morfogenetici che forma l'embrione precoce è la capacità di celle di immagine ad alta risoluzione. Descriviamo qui una tecnica per l'etichettatura di singole cellule o piccoli gruppi di cellule in embrioni di zebrafish intero con membrana mirati proteina verde fluorescente.

Etichettatura e cellule Imaging nel romboencefalo Zebrafish

Il video presente mostra un metodo che sfrutta la combinazione di elettroporazione e microscopia confocale per eseguire l'imaging in diretta su singole cellule progenitrici neurali nel proencefalo zebrafish via di sviluppo.

Time-lapse immagini dal vivo di relazione clonale cellule progenitrici neurali in via di sviluppo Zebrafish proencefalo

Imaging di sviluppo cerebrovascolare in zebrafish larvale è descritto. Sono forniti anche tecniche per facilitare l'imaging 3D e modificare lo sviluppo cerebrale con trattamenti chimici.

Imaging 3D e ricostruzione di strutture cerebrovascolari in Zebrafish embrionali

L'imaging del comportamento dinamico degli organelli e di altre strutture subcellulari in vivo può far luce sulla loro funzione in condizioni fisiologiche e patologiche. Qui, presentiamo metodi per marcare geneticamente due organelli, centrosomi e mitocondri, e per l'imaging delle loro dinamiche in embrioni di zebrafish viventi utilizzando la microscopia a campo largo e confocale.

Imaging strutture subcellulari nell&#39;embrione Living Zebrafish

Qui, presentiamo un metodo di montaggio versatile che consente l'imaging time-lapse a lungo termine dello sviluppo posteriore del corpo di embrioni vivi di pesce zebra senza perturbare il normale sviluppo.

Un metodo di montaggio versatile per il lungo termine Imaging di sviluppo Zebrafish

L'imaging in vivo è un potente strumento che può essere utilizzato per studiare i meccanismi cellulari alla base dello sviluppo del sistema nervoso. Qui descriviamo una tecnica per l'utilizzo della microscopia confocale time-lapse per visualizzare un gran numero di cellule multicolore etichettate Brainbow in tempo reale all'interno del sistema nervoso del pesce zebra in via di sviluppo.

Visualizzare il cervello in via di sviluppo nel pesce zebra vivente utilizzando Brainbow e Time-lapse Confocal Imaging

Questo protocollo descrive un approccio per l'etichettatura in toto e l'imaging multidimensionale dello sviluppo precoce dell'occhio del pesce zebra. Descriviamo l'etichettatura, l'incorporamento e l'imaging quadridimensionale (4D) utilizzando la microscopia confocale a scansione laser e considerazioni per ottimizzare l'acquisizione di set di dati per sezionare i meccanismi della morfogenesi della coppa ottica.

Imaging a 4 dimensioni della morfogenesi della coppa ottica zebrafish

Presentato qui è un protocollo per l'imaging in vivo dell'intero cervello del pesce zebra larvale utilizzando la microscopia a fluorescenza tridimensionale. La procedura sperimentale include la preparazione del campione, l'acquisizione di immagini e la visualizzazione.

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Dimostriamo un metodo che sfrutta la microscopia confocale a scansione rapida per eseguire l'imaging dal vivo delle cellule della microglia nel tectum ottico del pesce zebra in via di sviluppo, consentendo l'analisi della dinamica di queste cellule in vivo.

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